קיטוב של M1 ו M2 תאים נגזרים מונוציט אנושי וניתוח עם Cytometry זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium

פרוטוקול זה מציע את ההזדמנות לעקוב אחר קיטוב חיסוני של תאים שמקורם במונוציטים אנושיים על סמך הדמיה ואפיון עמוק של Mtb חלבון פלואורסצנטי ירוק בתת-קבוצות מקרופאגים מגוונות באמצעות ציטומטריית זרימת צבע של 10. זה מייצג שיטה יעילה וניתנת לשחזור לחקר תגובות לזיהום Mtb במקרופאגים מקוטבים M1 או M2, כולל הערכת פנוטיפ ותפקוד לפני ואחרי ההדבקה. כדי לבודד PBMC ממעילי באפי של תורם אנושי, השתמש בפיפטה כדי לכסות באיטיות 15 מיליליטר של דם מעיל באפי לאורך הצד של צינור של 50 מיליליטר על 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה.

השתמש בפיפטה סטרילית של פסטר כדי להסיר את שכבת הפלזמה העליונה ולהעביר בזהירות את שכבת התאים החד-גרעיניים לצינור חדש של 50 מיליליטר. הוסף מדיום RPMI נטול סרום לתאים לנפח סופי של 50 מיליליטר והפוך בעדינות את הצינור כמה פעמים לפני הצנטריפוגה. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב -20 מיליליטר של מדיום נטול סרום לספירה.

כדי ליזום התמיינות מקרופאגים, יש לדלל את התאים ל-5 פעמים 10 עד 6 תאים למיליליטר של ריכוז בינוני נטול סרום ולזרוע שני מיליליטר תאים לבארות בודדות של צלחת של שש בארות. מניחים את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שעתיים-שלוש כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הבאר. בתום הדגירה, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מדיום נטול סרום בכל שטיפה, והוסיפו שני מיליליטר של מדיום RPMI שלם בתוספת 50 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF או 50 ננוגרם למיליליטר של M-CSF עבור התמיינות M1 או M2 בהתאמה לכל באר של תאים דבקים.

שלושה ימים לאחר תחילת הקיטוב, החלף בזהירות מיליליטר אחד של סופרנטנט מכל באר במיליליטר אחד של מדיום שלם טרי בתוספת גורמי הגדילה המתאימים. ביום השישי של התרבית, הוסף 50 ננוגרם למיליליטר של אינטרפרון גמא ו-10 ננוגרם למיליליטר של LPS לבארות שטופלו ב-GM-CSF ו-20 ננוגרם למיליליטר של IL-4 לבארות שטופלו ב-M-CSF. בדוק את המורפולוגיה של תרביות התאים שמקורן במונוציטים באופן קבוע על ידי מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהמונוציטים הקטנים יותר מתמיינים לתאים דמויי מקרופאגים גדולים יותר.

כדי להקים תרבית Mtb, במתקן בטיחות ביולוגית ברמה III, ערבבו מיליליטר אחד של תרחיף חיידקים מופשרים עם תשעה מיליליטר של מדיום שלם של שחפת בצינור מכסה מסונן של 50 מיליליטר לדגירה של 24 שעות בצינור בחממת תרבית התאים. למחרת, אספו את החיידקים על ידי צנטריפוגה והשעו את הגלולה ב-15 עד 20 מיליליטר של מדיום שלם של שחפת טרייה בצינור תרבית חדש של 50 מיליליטר לפני החזרת החיידקים לחממת תרבית התאים. לאחר שבעה עד 10 ימי תרבית, שטפו את החיידקים פעמיים ב-35 עד 40 מיליליטר של מאגר כביסה סטרילי בכל כביסה, והשעו מחדש את החיידקים במיליליטר אחד של מדיום RPMI נטול סרום לאחר הכביסה השנייה.

הוסף עוד תשעה מיליליטר של מדיום RPMI נטול סרום לחיידקים ועשה סוניקטור לחיידקים בסוניקטור אמבט מים בארון בטיחות ביולוגית Class II למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מדוד את הצפיפות האופטית של מיליליטר אחד של תרחיף חיידקים באורך גל של 600 ננומטר בספקטרופוטומטר הממוקם בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. כדי להדביק את התאים שמקורם במונוציטים, יש לדלל את החיידקים ל-5 פעמים 10 למושבה השישית היוצרת יחידות לריכוז מיליליטר במדיום נטול סרום ולהחליף את הסופרנטנט בכל באר של צלחת תרבית התאים בת שש הבארות במיליליטר אחד של מדיום טרי נטול סרום ומיליליטר אחד של תרחיף חיידקים לכל באר כדי להשיג ריבוי זיהום של חמישה.

לאחר דגירה של ארבע שעות בחממת תרבית התאים, יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר כביסה סטרילי לכל שטיפה, ולהטות את הצלחת בזהירות כדי להסיר את כל נפח החיץ מפינות הבארות לאחר כל שטיפה. לאחר מכן השעו מחדש את התאים שמקורם במונוציטים הנגועים ב-Mtb בשני מיליליטר של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה. כדי לצבוע את התאים לצורך ציטומטריית זרימה, דגרו על התאים הנגועים במיליליטר אחד של מאגר FACS בתוספת 0.5 מילי-מולרי EDTA לבאר למשך 30 דקות לפחות.

בתום הדגירה, אספו את התאים המנותקים עם פיפטינג עדין והעבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים עם מכסה בורג לצנטריפוגה. השעו מחדש את התאים בכ-50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים אנטי-אנושיים מצומד פלואורוכרום וצבע כדאיות מעניין ודגרו על התאים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנים מאור. לאחר הכביסה, יש לתקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר קיבוע טרי שהוכן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר המוגן מפני אור.

לאחר הקיבוע והכביסה, השעו מחדש את התאים ב-400 מיקרוליטר של מאגר FACS והעבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של מיליליטר אחד. כדי לנתח את התאים, השתמש בחרוזי פיצוי כדי לפצות על האות הפלואורסצנטי עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום בקוקטייל והשתמש בתאים לא מוכתמים כדי להגדיר את השער לאוכלוסיית התאים השלילית. לאחר מכן רכוש מינימום של 50,000 תאים לדגימה.

גם תאים שמקורם במונוציטים M1 וגם M2 מציגים תזוזה אנכית לגרעיניות גבוהה יותר וגודל תא מופחת עם זיהום Mtb. מוות תאי מוגבר נצפה גם בתאי M1 ו-M2 נגועים ב-Mtb בריבוי הדבקה של חמישה בהשוואה לתאי M0 לא נגועים. יש לציין כי ביטוי גבוה משמעותית של Mtb GFP נצפה בתאי M2 לאחר ארבע שעות של הדבקה בהשוואה לתאי M1.

ניתן לאפיין תאי M1 ו-M2 לא נגועים על ידי קולטני CD64 ו-CD86 או CD200 וביטוי משותף של CD163 בהתאמה. לאחר ארבע שעות של זיהום Mtb, נצפתה תדירות מוגברת של תאים חיוביים לקולטן CD200 בתאים מקוטבים M1 חיוביים ל-Mtb GFP, בעוד שביטוי CD163 מופחת בתאי M2. ניתן לראות חיידקי Mtb GFP גם בתאי M1 חיוביים CD64 ובתאי M2 חיוביים CD163 על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ניתוח UMAP מגלה כי ארבע שעות של הדבקה ב-Mtb אינן מספיקות כדי להשפיע על קיטוב המקרופאגים, בעוד ש-24 שעות של הדבקה מביאות לאשכולות מופרדים בבירור של תאי M1 ו-M2 לא נגועים ונגועים המבטאים פרופילי ביטוי מובהקים של סמני פני השטח. יתר על כן, ניתוח PhenoGraph מראה כי 24 אשכולות שונים בגדלים שונים מפוזרים באופן ייחודי בין תאים M1 ו-M2 לא נגועים ו-Mtb. היעילות של קיטוב M1 או M2 או זיהום Mtb יכולה להשתנות באופן מהותי בין תורמים אנושיים.

ולכן, מומלץ לכלול לפחות שני תורמים בכל ניסוי כדי להפחית את השונות בניסוי. מודל זה מאפשר הערכה סימולטנית של מקרופאגים אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתוח ביטוי mRNA, בדיקות מולטיפלקס של גורמים מסיסים וכימות חיידקים באמצעות ביטוי GFP או יחידות יוצרות מושבה.