Name: פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: למד פרוטוקול יעיל לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים לחקר מטבוליזם כבדי ותרופות. השיטה משתמשת בחומרים מסחריים ומשפרת תפוקת תאים טהורים לניסויים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 5R01HD095512-02 ל- S.W.).

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות C57BL/6 (בנות 8 שבועות).
1. הכנה:
<ol><li>ערבבו את ה-E Medium של William 's (תוסף גלוטמקס) עם 10% FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטיקוטית כדי להפוך את התרבית למדיום.</li>
	<li>סנן 25 מ"ל של מדיום פיזור קולגן (למשל, Liver Digest Medium) דרך מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים.</li>
	<li>חם 50 מ"ל של H2O מזוקק כפול (ddH2O), 35 מ"ל של מדיום פרפוזיה (למשל, מדיום פרפוזיה בכבד) (או 50 מ"ל בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה), ו-25 מ"ל של מדיום מסונן של קולגן-דיספוזיה באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>בתוך מכסה מנוע תרבית רקמה סטרילי, יש לערבב 2 מ"ל של 10x HBSS ו-18 מ"ל של פרקול בצינור של 50 מ"ל כדי ליצור 20 מ"ל 1x Percoll-HBSS ולשמור על קרח או 4 מעלות צלזיוס. הערה: ניתן לשמור 1x Percoll-HBSS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות.</li>
	<li>בתוך קפוצ'ון תרבית רקמה סטרילי, יוצקים 30 מ"ל של מדיום שטיפה (למשל, Hepatocyte Wash Medium) לתוך צלחת פטרי נקייה, ושומרים על קרח.</li>
	<li>טבלו את צינור השאיבה במים של אמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. התוצאות הן האמינות ביותר אם טמפרטורת החדר היא ב 25 °C (76 °F).</li>
	<li>הכן 2 מ"ל של 1x הרדמה על ידי ערבוב 225 μL של קטמין HCL, 93.75 μL של Xylazine, ו 1681 μL של 1x PBS.</li>
	<li>הרדמה עכבר אחד בשיטה מאושרת. כאן הוזרק לעכבר תוך-צפקית 150 μL של הרדמה של 1x. בצע את הבדיקות לאובדן רפלקסים כגון תגובה לצביטת הבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה.</li>
	<li>הצמידו את העכבר שעל גבו אל משטח הנתיחה על ידי ארבע גפיים, על ידי הצמדה או שימוש בנייר דבק חסין מים או בשיטות אחרות שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסד (או מקבילות).</li>
	<li>הכן מלקחיים ומספריים מעוקרים לניתוח. כדי למנוע זיהום אפשרי, לבצע את כל הצעדים בתוך מכסה המנוע סטרילי.</li>
</ol>2. נוהל:
<ol><li>באמצעות משאבה פריסטלטית, התחילו לשאוב ddH2O מחומם במהירות של 4 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. משנים את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם.</li>
	<li>יש לחטא את בטנו של העכבר המרדים ב-70% EtOH ולחתוך עם מספריים כדי לחשוף את הכבד, את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC).</li>
	<li>עצרו את המשאבה הפריסטלטית. הכנס צנתר 24 G (לדוגמה, קטטר IV סגור, 24 G, 0.75 IN) לתוך IVC. התחילו לשאוב וחתכו את וריד הפורטל פתוח.</li>
	<li>ממשיכים לשאוב עד שהנוזל השטוף מתבהר (בסביבות 3-5 דקות). לחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. היזהרו לא לתת לבועות אוויר להיכנס ל-IVC. הערה: שלב זה הוא לשטוף כמה שיותר דם מהכבד.</li>
	<li>שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולג'נאז. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הקולגנאז-דיספוזה מתרוקן תוך כדי ביצוע שלב 2.6.</li>
	<li>לחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. הערה: בשלב זה, אובדן מוחלט של דם הוא קטלני לעכבר. מותו של העכבר יכול להיות מאושר על ידי חוסר פעימות לב לאחר הניסוי. השליכו את הפגר בהתאם למדיניות המתקן.</li>
	<li>מבודדים את כל הכבד החוצה ללא כיס המרה למדיום הכביסה של 30 מ"ל בצלחת פטרי על קרח.</li>
	<li>קרעו אותו לחתיכות עם מלקחיים כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה. שלב זה יהפוך את מדיום הכביסה לתמיסה עכורה מלאה בהפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות.</li>
	<li>סנן את הפתרון המעונן בשלב 2.8 דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך 20 מ"ל 1x Percoll-HBSS בצינור 50 מ"ל על קרח. מערבבים על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>בתוך מכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור עם 30 מ"ל קר של מדיום לשטוף.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 50 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>הסר את ה-supernatant והחזיר את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית (או נפחים אחרים מתאימים) בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה.</li>
	<li>ספרו את מספר התאים וצלחו את התאים על גבי לוחות התרבית הרצויים על פי התכנון הניסיוני. הערה: הפטוציטים ראשוניים המבודדים כראוי מעכבר אחד בן 8 שבועות בדרך כלל מספיקים כדי להיות מצופים על ארבע צלחות של 6 בארות או ארבע צלחות של 12 בארות.</li>
</ol>

<ol><li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cell+polyploidization%3A+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214(2015).</li>
<li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).</li>
<li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li>
<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+as+immunological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li>
<li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).</li>
<li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li>
<li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li>
<li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li>
<li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-147%2C+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation%2C+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).</li>
<li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169(2007).</li>
<li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation%3A+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li>
<li>Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021).</li>
<li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+cell+of+origin%2C+molecular+class%2C+and+effects+on+patient+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li>
<li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48(2017).</li>
<li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li>
<li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History%2C+heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD95+receptor%3A+apoptosis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li>
<li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li>
<li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פותחו פרוטוקולים שונים לבידוד הפטוציטים ראשוניים. הם גם נשמרו מותאמים ומותאמים בהתאם לצרכים שונים (טבלה 1). פרוטוקולי בידוד מורכבים בדרך כלל משני חלקים: פרפוזיה (כולל עיכול אנזים) וטיהור.
ניתן לבצע את הזלוף עם כל הכבד in vivo 2,20,21,22,23 או עם אונות כבד מנותחות 24. הזלוף של אונות מ...

הכבד משמש כאחד האיברים החשובים ביותר בגוף בעלי החוליות בשל התפקיד החיוני שהוא ממלא בתפקודים תומכי חיים רבים כמו עיכול מזון, זרימת דם וניקוי רעלים. השימוש בתרבית הפטוציטים ראשונית במבחנה של עכבר פופולרי יותר ויותר במחקרים על חילוף חומרים של פחמימות וקרצינומה בכבד. לכן, חשוב לפתח שיטה נוחה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכבר תוך שמירה על תפקודו הפיזיולוגי המולד. בשל תפקודו כמרכז של חילוף חומרים של גלוקוז, הכבד הוא גם מרכזי בייצור גלוקוז ואחסון1. ניסויים עם הפטוציטים ראשוניים במבחנה הם חובה לרוב מחקרי חילוף החומרים של גלוקוז. לכן, במשך שנים, קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולים לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.
ההליך הכללי של בידוד הפטוציטים של עכברים הוא קודם כל לשטוף את הדם בכבד עם נוזל איזוסמוטי כגון מלח בחסימת פוספט (PBS) או תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחר מכן להשתמש בתמיסה המכילה קולגן כדי לנתק הפטוציטים. פרוטוקולים אלה חולקים הליך כללי אך נבדלים זה מזה בריאגנטים ובשלבים בהתאם לצרכים שונים. עם זאת, הכנת ריאגנטים נדרשים וביצוע צעדי בידוד לוקחים זמן. בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי, היעילות נקבעה כעדיפות, כאשר כל הריאגנטים מוכנים לשימוש וזמינים מהשוק, וכמה שפחות צעדים. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ויעילה לעבודה כדי לבודד הפטוציטים ראשוניים מעכבר, מבלי לסכן את טוהר הפטוציטים ראשוני מבודדים ואת הכדאיות.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>12 בארות</td><td>ציפוי</td><td>FALCON</td><td>353043</td> לא נדרש</tr><tr>ציפוי <td>FALCON</td><td>353046</td><td>צלחת 6 בארות</td><td>לא נדרש</td></tr><tr><td>אנטי-AKT</td><td>Cell Signaling</td><td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטרייתית (100x), מיוצב</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-FOXO1</td><td>איתות תאים</td><td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-GAPDH</td><td>איתות תאים</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-p-AKT (S473)</td> <td>איתות תאים</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-PEPCK</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-p-FOXO1 (S256)</td><td>איתות תאים</td><td>84192S</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 70 ומיקרו; m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>צנתר IV סגור, 24 מד 0.75 IN</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, ללא גלוקוז, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChrom ערכת בדיקת גלוקוז</td><td>BioAssay Systems</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>גלוקגון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG נוגדן משני</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG נוגדן משני</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash בינוני</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>איתות תאים</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>לילי</td><td>NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>עיכול כבד בינוני</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>Aliquot בתוך מכסה המנוע של תרבית רקמות ל-25 מ"ל כל אחד בצינור של 50 מ"ל, ושמור ב-20 מעלות; C מקפיא</td></tr><tr><td>זלוף כבד בינוני</td><td>Gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>מסוגל לשאוב במהירות של 4 מ"ל לדקה</td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> <td>מקוררתSorvall</td><td>Legend RT</td><td>מסוגל לצנטריפוגה של צינור 50 מ"ל ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>נתרן L-לקטט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' L7022</td><td></td></tr><tr>מסנן מזרק <td>11360070</td><td></td><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>, PVDF 0.45 ומיקרו; מזרק CELLTREAT 229745 בקוטר 30 מ"מ</td><td></td><td></td>, מזרק 329461 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>בקטון דיקינסון</td><td>0.5 מ"ל</td></tr>, <tr><td>תמיסת טריפן כחולה 60</td><td></td> מ"ל בקטון דיקינס <td></td> 309653 ון, צינור 15250061 <td></td>0.4% גיבקו</tr><tr><td>, צינור 430052</td><td></td><td></td><td></td>קורנינג 15 מ"ל</tr>, <tr><td></td><td></td><td></td> מים קורנינג 430290 מ"ל <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיכל אמבטיה</td><td>קורנינג</td><td>CLS6783</td><td>או כל מיכל אמבט מים המסוגל להתחמם עד 45 מעלות; סי</td></tr><tr><td>ויליאם' s E בינוני (תוסף GlutaMAX)</td><td>ג'יבקו</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>קסילוזין (100 מ"ג/מ"ל)Vetone</td> <td>Anased LA</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר במבחנה בכבד , במיוחד במחקרי חילוף חומרים של גלוקוז. טכניקת בסיס הותאמה על בסיס צרכים שונים, כמו זמן, עבודה, עלות ושימוש ראשוני בהפטוציטים, וכתוצאה מכך פרוטוקולי בידוד ראשוניים שונים של הפטוציטים. עם זאת, הצעדים הרבים וההכנות המגיבים הגוזלים זמן רב בבידוד הפטוציטים ראשוני הם חסרונות עיקריים ליעילות. לאחר השוואת פרוטוקולים שונים עבור היתרונות והחסרונות שלהם, היתרונות של כל אחד מהם שולבו, ונוצר פרוטוקול בידוד הפטוציטים ראשוני מהיר ויעיל. תוך כ-35 דקות בלבד, פרוטוקול זה יכול להניב הפטוציטים ראשוניים בריאים באותה מידה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, ניסויים במטבוליזם של גלוקוז שבוצעו באמצעות הפטוציטים ראשוניים מבודדים אימתו את התועלת של פרוטוקול זה במחקרי חילוף חומרים בכבד במבחנה . כמו כן, סקרנו וניתחנו בהרחבה את המשמעות והתכלית של כל שלב במחקר זה, כך שחוקרים עתידיים יוכלו לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הזה על סמך הצרכים.

על מנת לבחון את היעילות, פרוטוקול הבידוד הראשוני הנוכחי של הפטוציטים בוצע על נקבות עכברי C57BL/6 בנות 8 שבועות. ההתקשרות והטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים נבדקו. בידוד ראשוני של הפטוציטים משמש למגוון רחב של ניסויים בפיזיולוגיה של הכבד, כגון השפעות תרופות בכבד ומטבוליזם של גלוקוז, פעילות סמנים ביולוגיים תרופתיים2, רגישות לאינסולין וייצור גלוקוז. לכן, הפעילות של hepatocytes הראשיים שבודדו עם פרוטוקול זה נבדקו בניסויים הבאים.
הציפוי לא היה נדרש להצמדת הפטוציטים ...

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

הפטוציטים ראשוניים של עכברים חשובים במחקרי כבד. במיוחד עבור חילוף חומרים של גלוקוז, ובדיקות תרופות בכבד. מבחינת זמן תהליך הבידוד יכול לגזול זמן רב והאנרגיה יקרה.פרוטוקול זה יכול לספק דרך יעילה לבודד הפטוציטים ראשוניים של עכברים. זה זמן וידידותי לעבודה. דורש מעט מאוד שלבים עם כל האזורים הזמינים באופן מסחרי.התחילו על ידי שימוש במשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל לשאוב מים מזוקקים כפולים מחוממים במהירות של 4 מ"ל לדקה, למשך חמש דקות. לאחר מכן החליפו את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם. ניטור בועת האוויר בין המים למדיום הזלוף.יעזור לעקוב אחר זרימת מדיום הזלוף דרך המערכת. לאחר מכן יש לחטא את בטנו של עכבר נקבת C57 שחור 6J בן שמונה שבועות מורדם עם 70% אתנול. ובעזרת מספריים, חתכו את הבטן כדי לחשוף את הכבד, וריד הפורטל והווריד הנבוב התחתון.ואז לעצור את המשאבה peristaltic. לאחר הקפדה על כך שצינור השאיבה מכיל מדיום פרפוזיה ולא מים. מכניסים קטטר של 24 מדים לתוך הווריד הנבוב התחתון.הפעילו מחדש את המשאבה וחתכו את וריד הפורטל פתוח. בזמן שמדיום הזלוף נשאב, לחץ על וריד הפורטל כל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. יש להמשיך לשאוב במשך כשלוש עד חמש דקות או עד שהנוזל השטוף מתבהר.לאחר מכן שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולגנאז. ולחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הדיספוזה של הקולגנאז מתרוקנים.לאחר מכן לבודד את כל הכבד ללא כיס המרה. והניח אותו ב -30 מ"ל של מדיום שטיפה בצלחת פטרי על קרח. שימוש במלקחיים קורע את הכבד לחתיכות כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה.בשלב זה, מדיום הכביסה הופך לתמיסה עכורה המכילה הפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות. סנן את התמיסה העכורה הזו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לתוך 20 מ"ל של 1X לכל שיחה HBSS בצינור של 50 מ"ל על קרח. ומערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.הצנטריפוגה הבאה את הפתרון. לאחר מכן במכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. ולשטוף את הכדור עם 30 מ"ל של מדיום שטיפה קרה.גלול את התאים שוב עם צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant, והשעה מחדש את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית. ספרו את התאים וצלחו אותם על צלחות התרבית הרצויות.על פי התכנון הניסויי. לאחר הציפוי, הפטוציטים ראשוניים מבודדים היו מחוברים היטב בשעה אחת והורחבו במלואם לאחר 12 שעות. בהפטוציטים המבודדים, רמות ה-mRNA של סמני הפטוציטים, כגון טרנסתירטין, CD95, ASGR1 ו-ASGR2 עלו באופן משמעותי בהשוואה לכבד כולו.לעומת זאת, הנוכחות של תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל הייתה נמוכה יותר. כפי שמעידה ירידה חדה ב-CD45, קולגן מסוג 1 אלפא 1, ותאי אנדותל 2 קינאז 2 רמות mRNA. מציע כי פרוטוקול זה יכול להפחית מאוד את ההפרעות של תאים אחרים בכבד.לאחר ציפוי רמות ASGR1 ו- ASGR2 ירדו עם הזמן, אך נותרו דומות לכבד כולו עד לנקודת הזמן של 12 שעות. במיוחד עבור ASGR1. רמת הביטוי של CD81 הקשורה לממברנה הייתה עקבית במשך עד 48 שעות.לשם השוואה, ביטוי קולטן 4 דמוי אגרה עלה בדרך כלל והפך לגבוה יותר מרמות in vivo לאחר 48 שעות. מבחני רגישות לאינסולין הראו כי אינסולין מקדם באופן משמעותי את הזרחון של שני ה-AKT ב-serine 473. ותיבת מזלג 01 בסרין 256, בהפטוציטים.המציין את הרגישות של הפטוציטים ראשוניים לאינסולין. רמות החלבון Phosphoenolpyruvate carboxykinase עלו באופן משמעותי לאחר טיפול בגלוקגון. מה שמרמז על כך שמסלול ייצור הגלוקוז הופעל.הפעלה זו אושרה עוד יותר על ידי ייצור מוגבר של גלוקוז. ועם ממריצים אחרים לייצור גלוקוז כמו פורסקולין+IBMX. פרוטוקול זה יכול לחסוך גם זמן וגם אנרגיה למחקרים באמצעות הפטוציטים ראשוניים של עכברים.בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע ניסויים קשורים כגון חילוף החומרים ההיפותטי של הגלוקוז ובדיקות סמנים ביולוגיים פרמצבטיים.

an-improved-time-labor-efficient-protocol-for-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג הכדאיות גבוהה, תשואה גבוהה של hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal של הכבד. זו מושגת על ידי פרפוזיה הכבד עם פתרון collagenase IV סוג דרך וריד שער הכבד, ואחריו דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי להשיג hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal.

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים מהכבד ואלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים ו-mRNA כדי לשבש גן מטרה טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית של הכבד. השיטות המתוארות מביאות לכדאיות גבוהה ולרמות גבוהות של שינוי גנים לאחר אלקטרופורציה.

אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 ו-mRNA לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה

הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

למד פרוטוקול יעיל לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים לחקר מטבוליזם כבדי ותרופות. השיטה משתמשת בחומרים מסחריים ומשפרת תפוקת תאים טהורים לניסויים ביולוגיים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

גלה סרטונים נוספים