פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים
25 באוקטובר 2021
הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.
הפטוציטים ראשוניים של עכברים חשובים במחקרי כבד. במיוחד עבור חילוף חומרים של גלוקוז, ובדיקות תרופות בכבד. מבחינת זמן תהליך הבידוד יכול לגזול זמן רב והאנרגיה יקרה.
פרוטוקול זה יכול לספק דרך יעילה לבודד הפטוציטים ראשוניים של עכברים. זה זמן וידידותי לעבודה. דורש מעט מאוד שלבים עם כל האזורים הזמינים באופן מסחרי.
התחילו על ידי שימוש במשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל לשאוב מים מזוקקים כפולים מחוממים במהירות של 4 מ"ל לדקה, למשך חמש דקות. לאחר מכן החליפו את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם. ניטור בועת האוויר בין המים למדיום הזלוף.
יעזור לעקוב אחר זרימת מדיום הזלוף דרך המערכת. לאחר מכן יש לחטא את בטנו של עכבר נקבת C57 שחור 6J בן שמונה שבועות מורדם עם 70% אתנול. ובעזרת מספריים, חתכו את הבטן כדי לחשוף את הכבד, וריד הפורטל והווריד הנבוב התחתון.
ואז לעצור את המשאבה peristaltic. לאחר הקפדה על כך שצינור השאיבה מכיל מדיום פרפוזיה ולא מים. מכניסים קטטר של 24 מדים לתוך הווריד הנבוב התחתון.
הפעילו מחדש את המשאבה וחתכו את וריד הפורטל פתוח. בזמן שמדיום הזלוף נשאב, לחץ על וריד הפורטל כל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. יש להמשיך לשאוב במשך כשלוש עד חמש דקות או עד שהנוזל השטוף מתבהר.
לאחר מכן שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולגנאז. ולחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הדיספוזה של הקולגנאז מתרוקנים.
לאחר מכן לבודד את כל הכבד ללא כיס המרה. והניח אותו ב -30 מ"ל של מדיום שטיפה בצלחת פטרי על קרח. שימוש במלקחיים קורע את הכבד לחתיכות כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה.
בשלב זה, מדיום הכביסה הופך לתמיסה עכורה המכילה הפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות. סנן את התמיסה העכורה הזו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון, לתוך 20 מ"ל של 1X לכל שיחה HBSS בצינור של 50 מ"ל על קרח. ומערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.
הצנטריפוגה הבאה את הפתרון. לאחר מכן במכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. ולשטוף את הכדור עם 30 מ"ל של מדיום שטיפה קרה.
גלול את התאים שוב עם צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant, והשעה מחדש את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית. ספרו את התאים וצלחו אותם על צלחות התרבית הרצויות.
על פי התכנון הניסויי. לאחר הציפוי, הפטוציטים ראשוניים מבודדים היו מחוברים היטב בשעה אחת והורחבו במלואם לאחר 12 שעות. בהפטוציטים המבודדים, רמות ה-mRNA של סמני הפטוציטים, כגון טרנסתירטין, CD95, ASGR1 ו-ASGR2 עלו באופן משמעותי בהשוואה לכבד כולו.
לעומת זאת, הנוכחות של תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל הייתה נמוכה יותר. כפי שמעידה ירידה חדה ב-CD45, קולגן מסוג 1 אלפא 1, ותאי אנדותל 2 קינאז 2 רמות mRNA. מציע כי פרוטוקול זה יכול להפחית מאוד את ההפרעות של תאים אחרים בכבד.
לאחר ציפוי רמות ASGR1 ו- ASGR2 ירדו עם הזמן, אך נותרו דומות לכבד כולו עד לנקודת הזמן של 12 שעות. במיוחד עבור ASGR1. רמת הביטוי של CD81 הקשורה לממברנה הייתה עקבית במשך עד 48 שעות.
לשם השוואה, ביטוי קולטן 4 דמוי אגרה עלה בדרך כלל והפך לגבוה יותר מרמות in vivo לאחר 48 שעות. מבחני רגישות לאינסולין הראו כי אינסולין מקדם באופן משמעותי את הזרחון של שני ה-AKT ב-serine 473. ותיבת מזלג 01 בסרין 256, בהפטוציטים.
המציין את הרגישות של הפטוציטים ראשוניים לאינסולין. רמות החלבון Phosphoenolpyruvate carboxykinase עלו באופן משמעותי לאחר טיפול בגלוקגון. מה שמרמז על כך שמסלול ייצור הגלוקוז הופעל.
הפעלה זו אושרה עוד יותר על ידי ייצור מוגבר של גלוקוז. ועם ממריצים אחרים לייצור גלוקוז כמו פורסקולין+IBMX. פרוטוקול זה יכול לחסוך גם זמן וגם אנרגיה למחקרים באמצעות הפטוציטים ראשוניים של עכברים.
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע ניסויים קשורים כגון חילוף החומרים ההיפותטי של הגלוקוז ובדיקות סמנים ביולוגיים פרמצבטיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול יעיל מבחינת זמן וכוח אדם לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכבר, שהם קריטיים למחקר בתפקודי הכבד ובמטבוליזם. השיטה משתמשת בריאגנטים זמינים מסחרית כדי להגביר את התוצר ולמזער הפרעות מתאים לא-פארנכימליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- מטבוליזם כבדי
- מטבוליזם של גלוקוז
- בדיקת תרופות
רקע
- הפטיocytes ראשוניים של עכבר חיוניים לחקר הביולוגיה של הכבד.
- שיטות בידוד מסורתיות הן לרוב גוזלות זמן ודורשות עבודה מאומצת.
- קיצור זמן הבידוד יכול לסייע לביצוע ניסויים ביולוגיים יעילים יותר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול בידוד באמצעות משאבה פריסטלטית ומצע collagenase dispase.
- מודל עכברים: עכבר female C57BL/6J.
- טכניקות לתרבית תאים ומדידה של ביטוי גנים.
תוצאות עיקריות
- רמות mRNA מוגברות של סמני הפטוציטים בהשוואה לכבד שלם.
- נוכחות מופחתת של תאי מערכת החיסון ותאים אנדותליאליים לאחר הבידוד.
- הוכחת רגישות לאינסולין ומסלולי ייצור גלוקוז פעילים.
מסקנות
- פרוטוקול זה משפר משמעותית את היעילות של בידוד הפטוציטים ראשוניים.
- הבנה משופרת של מטבוליזם הגלוקוז ותגובה לתרופות במחקרי כבד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד יעיל של הפטוציטים ראשוניים הוא קריטי למחקרי מטבוליזם של הכבד ובדיקות תרופות, שבהם מגבלות זמן וכוח אדם משפיעות על התפוקה בתהליכי הגילוי. פרוטוקול זה מקצר את זמן הבידוד לכ-35 דקות תוך שמירה על תפוקת ההפטוציטים ועל טוהרם, ובכך תומך בבדיקה מהירה של השערות במודלים פרה-קליניים. השיטה מאפשרת הכנה ניתנת להרחבה (scalable) של מערכות רלוונטיות למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי תיקוף מטרות וזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מספק הפטוציטים מטוהרים לבחינת היפותזות טיפוליות במסלולי מטבוליזם של גלוקוז ותגובה תרופתית כבדית.
- ערך תפעולי: מפחית את נטל הזמן והעבודה, ומאפשר תפוקה גבוהה יותר במערכי בדיקה לתיקוף מטרות.
- ערך ניבוי: מניב הפטוציטים עם רגישות לאינסולין והפעלה של גלוקונאוגנזה, דבר התומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות כבדיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק הפטוציטים עם הפרעה נמוכה של תאים שאינם פרהנכימליים, דבר המשפר את סגוליות הבדיקה עבור סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: משתמש בריאגנטים זמינים מסחרית ובשלבים סטנדרטיים, מה שמעלה את רמת השחזוריות לאורך קמפיינים של סריקה.
- יכולת הרחבה: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקשפות המתאימות לפלטפורמות של סריקה פנוטיפית או סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: תומך במערכות הרלוונטיות למחלות לצורך תיקוף פרה-קליני של תרכובות המכוונות לכבד.
- קידום מותאם סיכונים: מייצר הפטוציטים עם ייצור גלוקוז ותגובה לאינסולין מתוקשפים, המסייעים בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go).
- התאמה לסמני ביולוגיים: שומר על ביטוי סמני הפטוציטים (ASGR1, ASGR2, CD81) למשך עד 12 שעות, מה שמאפשר תאימות לבדיקות סמנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מוביל ועד למחקרים פרה-קליניים, ומספקת מקור אמין של הפטוציטים ראשוניים עבור בדיקות מטבוליזם של הכבד.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות של מסלולים כבדיים באמצעות אספקת הפטוציטים עם ביטוי מסומנים מאושר ותגובות פונקציונליות.
- סריקה: מייצרת הפטוציטים המתאימים להערכת תרכובות הודות לזיהום מופחת של תאי סטרומה ורגישות עקבית לאינסולין.
- אנליטיקה: תומכת בקריאות כמותיות כגון ייצור גלוקוז, בדיקות פוספורילציה וביטוי mRNA של מסומני הפטוציטים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי אספקת הפטוציטים השומרים על פונקציות מטבוליות מרכזיות למשך עד 48 שעות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת בידוד הניתנת לשימוש חוזר, המstandardizes (מנרמלת) את הכנת ההפטוציטים בין פרויקטים וצוותים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במחקרי מטבוליזם של כבד באמצעות הפחתת הפרעות תאיות ותיקוף תפקודי.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימת העבודה עם מינימום שלבים וריאגנטים זמינים מסחרית, ובכך משפר את יעילות המעבדה.
- ערך אסטרטגי: מאיץ את לוחות הזמנים של הגילוי על ידי צמצום זמן הבידוד משעות לכ-~35 דקות, מה שמגביר את תדירות הבדיקות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד בעדיפות מותאמת-סיכון של מטרות בכבד על ידי אספקת מודלים פרה-קליניים אמינים לתיקוף מנגנונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחי עכברים ובטכניקות של פרפוזיה.
- תלוי בגישה למשאבה פריסטלטית וסביבה סטרילית לתרביות רקמה.
- מחייב הכנה סטנדרטית של ריאגנטים (תווך פרפוזיה, קולגנזה דיספז, ותסמיכי שטיפה ותרבית).
- כולל שיקולי התאמה עבור זני עכברים או גילאים שונים מעבר למודל של נקבת C57BL/6J שנעשה בו שימוש.
- מוגבל על ידי הצורך בשימוש מיידי בהפטוציטים מבודדים כדי לשמור על שלמות תפקודית, שכן ביטוי הסמנים פוחת לאחר 12 שעות.
