Name: חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: חקור את פעילות הנוירופפטידים וגורמים הורמונליים המווסתים את מערכת ההפרשה ביתושים בוגרים. השיטה משתמשת בבדיקות Ramsay ו-SIET למדידת הפרשת יונים ונוזלים בצינורות Malpighian.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקי גילוי של המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ל- AD ו- J-PP. אל ו-FS קיבלו פרסי NSERC CGS-M לתמיכה במחקרם לתואר שני.

ללא.

כאשר בולעים ארוחה דם, חרקי הממטופג מתמודדים עם האתגר של מסיסים עודפים ומים בהמולימפ2 שלהם. כדי להתמודד עם זה, יש להם מערכת הפרשה מיוחדת, אשר נשלטת היטב על ידי גורמים הורמונליים, המאפשר חרקים ליזום במהירות diuresis שלאחר פראנדיאל. בדיקת רמזי ושימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונים מאפשרים מדידה של שיעורי הפרשת נוזלים יחד עם ריכוזי יונים ושיעורי הובלה ב- MTs חרקים מבודדים. צעדים קריטיים בגישות אלה כוללים הבטחת ניתוח נכון של MTs החרקים. הסרה בנפרד של כל צינור מהחרק חייבת להיעשות בזהירות, שכן כל נזק...

שמירה על רמות המלח והמים בחרקים מאפשרת להם להצליח בנישות אקולוגיות וסביבתיות רבות, תוך שימוש במגוון אסטרטגיות האכלה1. רוב החרקים פיתחו מנגנונים לווסת את הרכב המולימפה שלהם בתוך גבולות צרים על מנת לעמוד באתגרים השונים הקשורים לסביבתם המסוימת2. חרקים יבשתיים מתמודדים לעתים קרובות עם האתגר של חיסכון במים ומערכת ההפרשה עוברת אנטי diuresis כדי למנוע אובדן מים וכמה מלחים חיוניים, ולכן, הימנעות התייבשות. לעומת זאת, diuresis מתרחשת כאשר החרק ניזון והוא מאותגר עם עודף מים וייתכן מלחים 3,4. באמצעות מערכת ההפרשה המיוחדת והפעילה ביותר שלהם, חרקים פיתחו מנגנוני רגולציה הפועלים כדי להתמודד עם האתגרים האוסמורגולטוריים שלהם. אצל יתושי Aedes aegypti למבוגרים, מערכת ההפרשה מורכבת מהצינורות המלפיגיים (MTs) וההינדגוט, שהאחרון שבהם מורכב מאילום הקדמי ופי הטבעת האחורית5. MTs אחראים על יצירת שתן ראשוני, בדרך כלל עשיר NaCl ו / או KCl. השתן העיקרי משתנה לאחר מכן באמצעות תהליכי הפרשה ו reabsorptive כפי שהוא נוסע במורד הזרם של הצינור ונכנס hindgut5. הצואה הסופית יכולה להיות היפר-או היפוסמוטית להמולימפה, בהתאם לתנאי האכלה/סביבה, והיא מועשרת בפסולת רעילה וחנקנית2.
MTs הם אידיאליים לחקר תכונות רבות של נוזל אפיתל ותחבורה solute כפי שהם מבצעים מגוון גדול של פונקציות תחבורה הפרשה2,6. באמצעות ויסות הורמונלי2, MTs פונקציה על ידי הפרשת יונים ומסיסים אחרים מן הדם לתוך לומן צינור7, מתן שיפוע אוסמוטי המאפשר מים להיות מועברים על ידי aquaporins8,9, אשר באופן קולקטיבי יוצר את השתן העיקרי, לפני נסיעה לכיוון hindgut reabsorptive2. לכן, על ידי איסוף הנוזל המופרש מ MTs מבודדים, אפשר לפקח ברציפות על הובלה transepithelial של נוזל ויונים. מדידת קצב ההפרשה והרכב השתן מספקים תובנה על מנגנונים האחראים על יון transepithelial והובלת נוזלים. שיטה פופולרית לחקר שיעורי הפרשת נוזלים היא בדיקת רמזי, שהוצגה לראשונה על ידי רמזי בשנת 195310. בשיטה זו, הקצה הדיסטלי (הסגור) של הצינור מטופל עם הורמון (או תרכובת בדיקה אחרת / תרופה), בעוד הקצה הפרוקסימלי (הפתוח) עטוף סביב סיכה בשמן פרפין רווי מים, אשר מפריש את השתן העיקרי, מצטבר כטיפה על קצה הסיכה. MTs מבודדים מסוגלים לשרוד ולתפקד לתקופות ארוכות (עד 24 שעות) בתנאי הפריה חוץ גופית ממוטבים, מה שהופך אותם למודלים מתאימים ויעילים למדידת הפרשת נוזלים. לחרקים יש מערכות דם פתוחות, ולכן MTs מנותחים בקלות ומוסרים כפי שהם בדרך כלל צפים בחופשיות haemolymph6. בנוסף, למעט כנימות – חסרות MTs11 – מספר ה- MTs11 במין חרק נתון יכול להשתנות במידה ניכרת מארבע למאות (חמישה יתושי Aedes) המאפשרים מדידות מרובות מחרק אחד.
MTs יתושים Aedes, במשותף עם חרקים אנדופטריגוטה אחרים, מורכבים משני סוגי תאים היוצרים אפיתל פשוט2,12; תאים עיקריים גדולים, המאפשרים הובלה פעילה של cations (כלומר, Na + ו- K +) לתוך הלומן, ותאי סטלה דקים, אשר מסייעים בהפרשת Cl-epithelial transepithelial13. MTs אינם innervated2, ובמקום זאת מווסתים על ידי מספר הורמונים כולל גורמים משתן ואנטי משתן, המאפשרים שליטה על הובלת יונים (בעיקר Na +, K +, ו- Cl-) ומים מחויבים osmotically2. מחקרים רבים בחנו את הרגולציה ההורמונלית של Aedes MTs כדי להבין את תפקידם של גורמים אנדוקריניים על תחבורה transepithelial14,15,16,17,18. כפי שניתן לראות בתוצאות הייצוגיות, הפרוטוקולים כאן מדגימים את ההשפעות של גורמים הורמונליים שונים על MTs מבודדים מנקבה בוגרת יתושים A. aegypti, כולל הן שליטה משתן והן שליטה אנטי משתן (איור 1). בדיקת Ramsay משמשת כדי להדגים כיצד הורמון אנטי משתן, AedaeCAPA-1, מעכב הפרשת נוזלים של MTs מגורה על ידי הורמון משתן 31 (DH31) (איור 1).
הגודל הקטן יותר של חרקים דרש פיתוח של שיטות מיקרו למדידת פעילות יונית וריכוזים בדגימות נוזלים, או ליד פני השטח של רקמות מבודדות כגון MTs ומעיים. שיטות שונות יושמו, כולל שימוש radioisotopes של ions19, אשר דורש איסוף של טיפות נוזל מופרש למדידה של ריכוזי יונים20. צינורות Aedes מגורה במבחנה בדרך כלל להפריש ~ 0.5 nL / min21, ובכך טיפול של כרכים קטנים כאלה יכול להוות אתגר, פוטנציאל להציג שגיאה בעת ההעברה. כתוצאה מכך, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים (ISMEs) שימשו בהרחבה למדידת ריכוזי יונים בטיפות מופרשות של MTs במבחנה. בשיטה זו, אלקטרודה התייחסות ISME, מלא פתרון מילוי גב מתאים ionophore, ממוקמים לתוך טיפת שתן מופרשת כדי לקבוע ריכוזי יון22. הותאם מדוניני ועמיתיו23, פרוטוקול נוכחי זה משתמש ionophore Na +-סלקטיבי כדי למדוד פעילות יונים בטיפות מופרשות מ MTs מגורה יתושי Aedes למבוגרים. מאחר שמיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונים מודדים פעילות יונים, נתונים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי כריכוזי יונים בעקבות ההנחה שפתרונות הכיול והדגימות הניסיוניות חולקים את אותו מקדם פעילות יונים21 (איור 1B,C).
טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת היונים (SIET) עושה שימוש גם ב- ISMEs כדי למדוד שיפועי ריכוז יונים בשכבה הלא מסודרת הסמוכה לאיברים, רקמות או תאים המעבירים יונים. ISMEs למדוד שיפועי מתח אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב את שיפועי ריכוז היונים ואת הכיוון ואת הגודל של שטף יונים על פני האיבר, הרקמה, או התא20. בטכניקה זו, ISME מותקן על מניפולטור שלושה צירים הנשלט על ידי מנועי מיקרו-צעד ממוחשבים, כך מיקומו התלת-ממדי נשלט לרמת המיקרומטר20. מתחים נמדדים בשתי נקודות בתוך השכבה הלא מסודרת באמצעות פרוטוקול דגימה המתוכנת ונשלט על ידי תוכנת מחשב. שתי הנקודות מופרדות בדרך כלל על ידי מרחק של 20-100 מיקרומטר עם נקודה אחת בתוך 5-10 מיקרומטר מפני השטח של האיבר, הרקמה או התא והנקודה השנייה במרחק של 20-100 מיקרומטר נוספים. ההבדל בגודל המתחים בין שתי הנקודות מחושב כדי לקבל שיפוע מתח24,25,26, אשר משמש לאחר מכן לחישוב שיפוע הריכוז ולאחר מכן השטף נטו באמצעות Law24,27 של פיק. שיטה זו שימושית להערכת הובלת יונים ספציפיים על פני אזורים שונים של המעיים חרקים MTs, או בנקודות זמן ספציפיות לאחר חשיפה לקמח דם או טיפול. לדוגמה, ניתן להשתמש ב- SIET כדי להבין כיצד תהליכי ספיגה והפרשה במערכת הפרשת יתושים מוסדרים על ידי הורמונים28, כמו גם התנהגויות האכלה שונות ותנאי גידול25. עבודה קודמת שהשתמשה ב-SIET חשפה אתרים המעורבים בהובלת יונים לאורך הפפילות האנאליות ופי הטבעת של יתושים זחליים ומבוגרים24,28. הפרוטוקול הנוכחי, שתואר בעבר על ידי פאלוצי ועמיתיו26, מודד את שטף Na+ על פני אפיתליה של כרית פי הטבעת הנשית הבוגרת (איור 2).
החלק האחרון של מערכת הפרשת יתושים דורש תנועה שרירית מתואמת כדי לעזור לערבב מזון ולהפריש פסולת26. מוצרים בלתי נספגים של עיכול מן midgut, יחד עם שתן ראשוני המופרש על ידי MTs, מועברים דרך שסתום pyloric ונמסרים hindgut2. התכווצויות הינדגוט ספונטניות מתחילות בשסתום הפילורי ומתרחשות בגלים פריסטלטיים, המועברים מעל האיליום באמצעות התכווצות מתואמת של שרירים מעגליים ואורך המקיפים את פני השטח הבסיסיים של תאי אפיתל26. לבסוף, השרירים בתוך פי הטבעת לעזור להניע ולחסל פסולת דרך התעלה אנאלית. למרות תנועתיות הינדגוט חרקים היא מיוגנית, הדורשת Ca2+ חוץ תאית לייצר התכווצויות ספונטניות, תהליכים אלה יכולים להיות מוסדרים גם נוירונים26,29,30. ויסות אקסוגני זה על ידי מערכת העצבים חשוב לאחר האכלה, כמו החיה חייבת לגרש פסולת מהמעיים ולשחזר איזון haemolymph31. כתוצאה מכך, ביצוע ביו-אסאיות במבחנה כדי לזהות נוירופפטידים מיוסטימולטוריים או myoinhibitory שימושי בהערכת האופן שבו נוירוכימיקלים משפיעים על תנועתיות הינדגוט. הפרוטוקול הנוכחי, המבוצע על ידי Lajevardi ו- Paluzzi28, משתמש בהקלטות וידאו כדי לבחון תנועתיות אילאלית בתגובה לנוירופפטידים (איור 3). באופן דומה, מתמר כוח או ממיר עכבה עשוי לשמש גם כדי לבחון עקבות של התכווצויות באמצעות תוכנת רכישת נתונים32,33. עם זאת, באמצעות טכנולוגיית וידאו מאפשר לנו להעריך חזותית את האיבר ולנתח עוד באמצעות קבוצת משנה של פרמטרים כדי לזהות את התפקיד של הורמונים על תנועתיות hindgut.
שימוש בטכניקות אלה יכול לעזור לאפיין גורמים המסדירים ומתאמים הובלת נוזלים ויונים לאורך מערכת ההפרשה יחד עם תנועתיות הינדגוט. חשוב לציין, קשר פונקציונלי בין התגובה משתן על ידי MTs ותנועתיות hindgut נתמך, כמו הורמונים משתן, כגון DH31 ו 5HT, מאופיין ביכולתם לעורר הפרשת נוזלים על ידי MTs, נמצאו גם להפגין פעולות מיוטרופיות לאורך היתוש hindgut21,34,35 . ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של תיאום מחמיר בין MTs והינדגוט במהלך אירועים כגון diuresis שלאחר פראנדיאל בחרקים הדורשים חיסול פסולת מהירה.
להלן, הגישה המפורטת מאחורי טכניקת הבדיקה Ramsay כדי למדוד את קצב הפרשת הנוזלים יתוש, A. aegypti, ואת השימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים יון כדי לקבוע את ריכוזי Na + בתוך הנוזל המופרש של MTs מתוארים, אשר בשילוב מאפשר שיעורי הובלת יונים transepithelial להיקבע. בנוסף, טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת היונים ובדיקות התכווצות ההינדגוט מתוארות כדי למדוד שטף יונים ותנועתיות, בהתאמה, מה שעוזר להבהיר את הרגולציה ההורמונלית של ההינדגוט (איור 4).

<table><tbody><tr><td>מזרקים 1 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14955456</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחות פטרי</td><td>קורנינג פלקון (פישר סיינטיפיק)</td><td>C351008</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית בורוסילקט (OD 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ, אורך 100 מ"מ)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>המשמש לאלקטרודות</td></tr> <tr><td>ייחוס ISMEצינורות נימיים נימיים מזכוכית Borosillicate (OD 2 מ"מ, ID 1.12 מ"מ, אורך 102 מ"מ)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>1B200F-4</td><td>המשמש לאלקטרודות ייחוס SIET</td></tr><tr><td>צינורות נימיים מזכוכית Borosillicate (OD 1.5 מ"מ, קוטר פנימי 1.12 מ"מ, אורך 100 מ"מ)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td>המשמש לאלקטרודות ISME ו-SIET</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>Diamed</td><td>GEN59-114</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Dimethyltrimethylsilylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41716</td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>מותאם אישית</td><td></td><td>ניתן לייצר על ידי חנות מכונות מקומית</td></tr><tr><td>Ferric chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (Dumont #5)</td> <td>Fine Science</td><td>Tools 91150-20</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-748A</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי מיובש</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>8042-47-5</td><td>מותג ספציפי אינו חשוב</td></tr><tr><td>INFINITY1-2CB מצלמת וידאו</td><td>Luminera</td><td>INFINITY1-2CB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators (שמאל וימין)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>MMJL ו- MMJR</td><td>מותג ספציפי אינו חשוב כל עוד מניפולטור איכותי</td></tr><tr><td>שמן מינרלי, Light</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-4</td><td></td></tr><tr><td>סיכות Minutien (נירוסטה 0.1 מ"מ)</td> <td>Fine Science</td><td>Tools 26002-10</td><td></td></tr><tr><td>חימר דוגמנות שאינו מתקשה</td><td>Sargent Art</td><td></td><td>מותג ספציפי אינו חשוב</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור אולימפוס (FOR SIET)</td> <td>מערכת</td><td></td>מותאמת אישית <td>של אולימפוס</td></tr> פלסטיק <tr><td>פסטר (העברה) פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין תמיסה (0.1 מ"ג/מ"ל)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A-005-M</td><td>84 kDa</td></tr><tr><td>פוליוויניל כלוריד (PVC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>81395</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>10053-09</td><td></td></tr> מערכת <tr><td></td><td></td><td></td> סיגמא-אולדריץ' S0146 <td></td>SIET של שניידר</tr><tr><td></td><td></td><td>מערכת מותאמת אישית</td> אלקטרוניקה ישימה <td>פרטים זמינים בכתובת: http://www.applicableelectronics.com/overview</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל נתרן יונופור II</td><td>פלוקה</td><td>99357</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי פוליסטירן סטנדרטיים (תרבות)</td><td>פישרברנד</td><td>FB012921</td><td>כל גודל יעבוד, אבל כלים של 60 מ"מ טובים גם לנתיחות וגם בדיקת</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ עם מיקרומטר עיניים ניקון</td><td></td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>סאטר P-97 חולץ פיפטה חום בוער</td><td>Sutter Instruments</td><td>FGPN7</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Chemical Company</td><td>NC9285739</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>VWR מערבל פלטה חמה מתקדם - אלומיניום</td><td>VWR</td><td>9578</td><td>מותג ספציפי אינו חשוב</td></tr></tbody></table>

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

מחקרים על פיזיולוגיית חרקים, במיוחד באותם מינים שהם וקטורים של פתוגנים הגורמים למחלות בבני אדם ובעלי חוליות אחרים, מספקים את הבסיס לפיתוח אסטרטגיות חדשניות להדברה. כאן, סדרה של שיטות מתוארות כי הם מנוצלים באופן שגרתי כדי לקבוע את התפקידים התפקודיים של neuropeptides וגורמים עצביים אחרים (כלומר, אמינים ביוגניים) על מערכת ההפרשה של היתוש, Aedes aegypti. הצינוריות המלפיגיות (MTs), האחראיות על היווצרות שתן ראשונית, יכולות להמשיך לתפקד במשך שעות כאשר הן מוסרות מהיתוש, ומאפשרות מדידות הפרשת נוזלים בעקבות טיפולים הורמונליים. ככזה, בדיקת רמזי היא טכניקה שימושית למדידת שיעורי הפרשה מ- MTs מבודדים. מיקרואלקטרודים סלקטיביים של יון (ISME) יכולים לשמש ברצף למדידת ריכוזי יונים (כלומר, Na+ ו- K +) בנוזל המופרש. בדיקה זו מאפשרת מדידה של מספר MTs בזמן נתון, קביעת ההשפעות של הורמונים שונים ותרופות. טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת יון משתמשת ב- ISME כדי למדוד נציג מתח של פעילות יונית בשכבה הלא מסודרת הסמוכה לפני השטח של איברים המעבירים יון כדי לקבוע הובלה טרנס-אפיתלאלית של יונים בזמן אמת. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את התפקיד של הורמונים ורגולטורים אחרים על ספיגת יונים או הפרשה על פני אפיתליה. בדיקות התכווצות הינדגוט הן גם כלי שימושי לאפיון נוירופפטידים מיואקטיביים, שעשויים לשפר או להפחית את היכולת של איבר זה להסיר עודפי נוזלים ופסולת. באופן קולקטיבי, שיטות אלה מספקות תובנה כיצד מערכת ההפרשה מוסדרת יתושים בוגרים. זה חשוב כי תיאום פונקציונלי של איברי הפרשה הוא קריטי להתגבר על אתגרים כגון מתח ייבוש לאחר עיקול ולפני מציאת מארח חוליות מתאים כדי לקבל קמח דם.

יישום DH31 נגד MTs לא מגורה גורם לעלייה משמעותית בשיעור הפרשת הנוזלים, המאשר את תפקידו כהורמון משתן יתושי Aedes (איור 1A). כאשר טובולות מטופלות ב-AedaeCAPA-1, נצפתה ירידה בשיעור ההפרשה ב-MTs מגורה DH31. איור 1B מדגים את השימוש באלקטרודות סלקטיביות ליונים כדי למדוד ריכוזי Na+ בטיפות המופרשות. טיפול DH31 על MTs לא הייתה השפעה על ריכוז Na + בטיפת המופרשת; עם זאת, עם היישום של AedaeCAPA-1</...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות מאחורי בדיקת רמזי, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים, סריקת טכניקת אלקטרודה סלקטיבית יון (SIET) ובדיקות התכווצות במבחנה, המיושמים לחקר מערכת הפרשת היתושים הבוגרת, המורכבת מצינורות Malpighian והינדגוט, כדי למדוד באופן קולקטיבי שיעורי הפרשת יונים ונוזלים, פעילות התכווצות והובלת יונים טרנס-אפיתל.

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...

פרוטוקול זה מתאר טכניקות שניתן להשתמש בהן על ידי פיזיולוגים של בעלי חיים קטנים כדי להבהיר את תפקידם של נוירופפטידים וגורמים הורמונליים אחרים המווסתים את מערכת העיכול או ההפרשה. טכניקות אלה מאפשרות מדידות של דגימות ביולוגיות בגודל מיקרו שאחרת לא היו אפשריות באמצעות טכניקות שתוכננו במיוחד עבור מודלים גדולים יותר של בעלי חיים, כולל, למשל, מכרסמים ו teleus. שיטה זו יכולה לספק תובנה על הרגולציה האנדוקרינית של המעיים, כולל הובלת אפיתל, כמו גם שריר חלק הקשור למערכת העיכול בחרקים ובמינים שאינם חרקים בגודל דומה.הדגמת נהלי חצוצרות החרקים תהיה פארווה סג'די, מועמדת לדוקטורט מהמעבדה שלי. בנוסף, סטודנט לתואר שני לשעבר מהמעבדה שלי ארית Lajevardi יהיה להפגין את הפרוטוקולים ממוקדים hindgut. התחילו בהכנת רמזי ובדיקות התכווצות כלים לניסויים.יש להשתמש בפיפטה ולמלא בארות עם עד 20 מיקרוליטרים של תמיסה. לפקדים לא מגורים, מלאו את הבארות ב-20 מיקרוליטרים של המדיום של Aedes מלוחים שניידר. לאחר שכל הבארות מתמלאות, יוצקים שמן מינרלי מיובש לצלחת הבדיקה עד שהבארות וסיכות המינוטין שקועות.לאחר טבילת הצינור בבאר, להרים את הקצה הפרוקסימלי של הצינור עם מלקחיים, להסיר אותו מן טיפת הרחצה, ולעטוף את הקצה סביב הסיכה. עוטפים את הצינור סביב הסיכה פעמיים ושומרים על אורך הצינור שנותר בטיפת הרחצה בקנה אחד עם הצינורות האחרים. כדי להפוך את microelectrode נתרן סלקטיבי, להשתמש מזרק מיליליטר אחד כדי למלא את האלקטרודה עם 100 מילימולרי נתרן כלורי.ודאו שתמיסת המילוי האחורית מתמלאת עד קצה האלקטרודה. אם מופיעות בועות אוויר, יש להעיף בעדינות את המיקרואלקטרוניקה או להסיר את התמיסה ולמלא מחדש. יש לטבול קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בתמיסת היונופור הסלקטיבית של הנתרן.בשורה את האלקטרודה מאונך לפיפטה, ולאחר מכן למקם אצבע בכפפה מעל החלק התחתון של הקצה כדי ליצור לחץ ולגרש טיפה קטנה של ionophore. בזהירות לגעת טיפה של ionophore לקצה microelectrode, הקפדה לא לשבור אותו. מלאו קטנה באמצע הדרך עם 100 מילימולר נתרן כלורי והניחו קצת חימר דוגמנות על החלק הפנימי בחלק העליון של הכוס.לאחר היונופור נלקח, מניחים את קצה האלקטרודה על קיר הכוס, ומאפשרים את הטיפים בתוך הנתרן כלורי. שמור את ISME בכוס עד שיהיה מוכן לשימוש. כדי להפוך את אלקטרודת הייחוס ISME, למלא בחזרה אלקטרודה עם 500 מילימולר אשלגן כלורי ולאחסן אותו בכוס.מצפים את קצות האלקטרודה באמצעות תמיסה של כ 3.5% פוליוויניל כלוריד, מומס טטרהידרופורן, כדי למנוע תזוזה של היונופור כאשר שקוע בשמן פרפין. כדי לכייל את אלקטרודת הנתרן, מניחים 10 טיפות מיקרוליטר של ריכוזים סטנדרטיים של נתרן כלורי על קצה צלחת רמזי עם הצינורות המלפיגיים המדודרים. מניחים את הטיפות הסטנדרטיות במרחק שני סנטימטרים זה מזה עם הריכוז הגבוה יותר למעלה.הכנס הן את אלקטרודת הייחוס והן את האלקטרודה הסלקטיבית של היונים מעל חוטי הכסף של הכלוריד והידק אותם בבטחה באמצעות מחזיקי אלקטרודות המחוברים למיקרו מניפולטורים. נווט את שתי האלקטרודות לכיוון טיפת הנתרן כלורית 200 מילימולרית באמצעות מניפולטורים מיקרו, להבטיח כי קצות אלקטרו לא לגעת בתחתית המנה. הפעל את האלקטרומטר כדי להתחיל להקליט ולאפשר לקריאה להתייצב.הקלט את הקריאה והמשיך לסטנדרט הבא. לאחר רכישת מדידות של קצב הפרשת הנוזלים, העבירו בזהירות את ההתייחסות ואת האלקטרודות הסלקטיביות של היונים לטיפות המופרשות באמצעות המניפולטורים הזעירים. הפעל את ההקלטה ואפשר לקריאה להתייצב ולאחר מכן הקלט.הפעילו את מגבר ה-IPA-2 Ion/Polarographic, את מיקרוסקופ האור ואת המחשבים. מניחים את הנתרן מיקרואלקטרודה סלקטיבית על מחזיק המורכב חוט כלוריד כסף ולחבר אותו לשקע המחבר הנשי. הסר אלקטרודת התייחסות אחת מן הכוס עם אשלגן כלורי, הצבת אצבע אחת בקצה אחד והטיית נימי הזכוכית לכיוון אצבע זו כדי למנוע את אגר לנשור.בזהירות למקם קצה אחד לתוך המחזיק, להבטיח כי לא נוצרות בועות. אם יש בועה, להסיר את אלקטרודת הייחוס, למלא את המחזיק עם שלושה אשלגן כלורי טוחן ולחזור. מקם את מחזיק האלקטרודה בשקע המחבר הנשי.לאחר הכיול, לנתח את האיבר. מניחים את צלחת הפולי-L-ליזין עם הדגימה המנותחת על במת המיקרוסקופ ומכניסים את קצה אלקטרודת הייחוס בתוך תמיסת המלח. להטביע את קצה המיקרו-אלקטרוניקה הסלקטיבית של היון בתמיסת המלח, תוך הקפדה שלא לשבור את הקצה.השתמש בידיות הכוונון הידניות כדי להתאים את מיקום המיקרו-אלקטרוניקה בעת התבוננות מתחת למיקרוסקופ האור. התאם את המיקום האנכי של המיקרואלקטרודה כך שהקצה שלו יהיה באותו מישור כמו האיבר או הרקמה, ואז סובב את מתג המנוע כדי לאפשר. באמצעות מקשי החצים של המחשב, הזז את המיקרואלקטרודה אופקית למיקום המרוחק שלושה מילימטרים מהרקמה כדי למדוד הקלטות רקע.כאשר אתה מוכן, התחל להקליט על-ידי הקשה על F5, השג חמש מדידות של פעילות ברקע. הזז את קצה microelectrode קרוב לרקמה תוך הקפדה לא לנקב את האיבר. הפחת את רגישות הפגיעה העיקרית כדי למקם את קצה microelectrode שני מיקרומטרים ישירות ימינה, בניצב לרקמה.להשיג שלוש הקלטות באתר לאורך כרית רקטלית כדי לזהות את האתר של פעילות היונים הגדולה ביותר, ולאחר מכן לקבל מדידות מלוחים בסיסיות באתר המציג את הפעילות הגדולה ביותר. כדי להקליט התכווצויות hindgut, למלא את אחת הבארות בצלחת עם נפח ידוע של תמיסת מלח Aedes. לאחר הניתוח, מעבירים בזהירות את ההינדגוט המנותח המחובר לבטן האמצעית לבאר בצלחת אחרת, ומקפידים לא לצבוט את האילום.שקועים במעיים בתמיסת המלח בתוך הבאר ומניחים סיכות מינוטין לתוך המעיים האמצעיים ופי הטבעת. ileum לא צריך להיות תחת מתח התכווצויות ספונטניות שמקורן בשסתום פילורי באיליאום הקדמי יש לראות. חבר את מצלמת הווידאו למיקרוסקופ הסטריאוסקופי.לאחר מכן מניחים את המנה המכילה את האיבר המנותח מתחת למיקרוסקופ ולהקליט וידאו במשך שתי דקות. יישום של DH31 נגד צינורות Malpighian unstimulated גורם לעלייה משמעותית בשיעור הפרשת נוזלים, המאשר את תפקידו כהורמון משתן יתושים Aedes. כאשר טובולות מטופלות עם AedaeCAPA-1, ירידה בשיעור הפרשה הוא ציין DH31 מגורה צינורות Malpighian.אלקטרודות סלקטיביות יון שימשו למדידת ריכוזי נתרן בטיפות המופרשות. טיפול DH31 על MTs לא הייתה השפעה על ריכוז הנתרן בטיפת המופרשת. עם זאת, עם היישום של AedaeCAPA-1, ריכוז הנתרן בנוזל המופרש גדל באופן משמעותי.בנוסף, בהשוואה לבקרות לא מגורות, DH31 הוביל לקצב הובלת נתרן גדול יותר באופן משמעותי, ואילו AedaeCAPA-1 ביטל עלייה זו בצינורות מגורה DH31. ה- SIET שימש להערכת שינויים בהובלת נתרן לאורך אפיתל כרית פי הטבעת של יתושים נקבות בוגרות. אנלוגי לוקוקינין שימש לבחינת שינויים בספיגת הנתרן, מה שגרם לירידה של פי ארבעה בספיגת הנתרן בהשוואה לשליטה מלוחה.כדי להעריך את התפקיד של pyrokininin neuropeptide2 על תנועתיות ileal, נעשה שימוש באנלוגי של רודניוס פרוליקסוס, אשר הוכח בעבר כדי להפעיל את קולטן A.aegypti PK2 מועשר ileum יתוש. יחסית לרמות הבסיס, PK2 מעכב באופן משמעותי התכווצויות ileal. בעת ביצוע בדיקת רמזי עם טובולות Malpighian ומדידת שיעורי הפרשת יונים או נוזלים, זה הכרחי כי צינורות לא ניזוקו במהלך הניתוח או במהלך ההעברה לתוך צלחת הבדיקה.בעקבות בדיקת רמזי, מובילי ממברנות ספציפיים יכולים להיות ממוקדים או פרמקולוגית או מולקולרית באמצעות טכניקות גנטיות הפוכות כדי להבחין בתרומתם הספציפית להובלה טרנס-אפיתל של מסיסים באפיתל הפשוט.

studying-activity-neuropeptides-other-regulators-excretory-system

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בראיון זה, ג'ורג' Dimopoulos מתמקד מנגנונים פיזיולוגיים בשימוש על ידי יתושים להילחם Plasmodium falciparum וזיהומים וירוס דנגה. הסבר ניתנת כמה גנים עקשן מפתח, אותם גנים המקנה עמידות פתוגנים וקטור, מזוהות היתוש ועד כמה הידע הזה יכול לשמש כדי ליצור יתושים מהונדס כי אינם יכולים לשאת את טפיל המלריה או וירוס דנגה.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

פרוטוקול זה מספק הוראות לבחירת המשובטים תאים קו פליטת אור סידן assay כדי לנתח את מבנה פעילות יחסי נוירופפטידים arthropod מסונתז על GPCRs מאותו מקור שלהם. Assay זה יכול לשמש עבור deorphanization קולטן מבנה פעילות מחקרים היחסים לעיצוב אנלוגי פפטיד סינתטי / סמים להוביל לגילוי.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

בפרוטוקול זה אנו משלבים RNAi בתיווך להשתקת גנים...

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

המאמר הנוכחי מפרט פרוטוקול שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרמות מוצלחות ובעלות רעש נמוך במספר סוגים של יתושים, כולל נקבות וזכרים כאחד.

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

מתוארים נהלים לחקר התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם באמצעות אלקטרו-חדירה AC-DC.

אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

קהילות מיקרוביאליות ביתושים טומנות בחובן הבטחה גדולה לאסטרטגיות הדברה ביולוגית וקטורית. רוב הסימביונטים אינם ניתנים לטיפוח, ודורשים ניתוחים מטגנומיים. אנו מתארים שיטה לנתח נקבות יתושים ולהפריד בין השחלות, המעי התיכון ובלוטות הרוק למניעת זיהום צולב, להקל על מחקרי מיקרוביום ברמת האיברים, ולשפר את ההבנה של תפקידי המיקרואורגניזמים בביולוגיה של יתושים.

דיסקציה של שחלות יתושים, מעי האמצע ובלוטות הרוק לצורך ניתוח מיקרוביום ברמת האיברים

חקור את פעילות הנוירופפטידים וגורמים הורמונליים המווסתים את מערכת ההפרשה ביתושים בוגרים. השיטה משתמשת בבדיקות Ramsay ו-SIET למדידת הפרשת יונים ונוזלים בצינורות Malpighian.

חקר הפעילות של נוירופפטידים ורגולטורים אחרים של מערכת ההפרשה יתוש למבוגרים

גלה סרטונים נוספים