Name: שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למד שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים ללא צורך במערכת לנגנדורף. השיטה מאפשרת בידוד תאים ביעילות של 70-80% מעכברים בגילאים שונים לחקר פיזיולוגיה ומחלות לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לטי ימאמוטו וליורי על עזרתם בניסויים המורפוגליים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק בסיוע למחקר מדעי (C) מהחברה היפנית לקידום המדע (18K06871 ל M.O.K. ו 17K08536 ל H.M.).

<ol><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 61, 291-332 (1898).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circulation Research. 26 (6), 679-687 (1970).</li>
<li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li>
<li>Joshi-Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+plasticity+in+long-term+cultures+of+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional plasticity in long-term cultures of adult ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 65, 76-87 (2013).</li>
<li>Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+current+in+single+myocardial+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium current in single myocardial mouse cells.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).</li>
<li>Zhou, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+activating+sustained+K%2B+current+modulates+repolarization+and+excitation-contraction+coupling+in+adult+mouse+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle.</a> Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Sambrano, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+signalling+network+in+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Navigating the signalling network in mouse cardiac myocytes.</a> Nature. 420 (6916), 712-714 (2002).</li>
<li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6257-6262 (2002).</li>
<li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro%3A+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Developmental Dynamics. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cardiac+fibroblasts+in+post-myocardial+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of cardiac fibroblasts in post-myocardial heart tissue repair.</a> Experimental and Molecular Pathology. 101 (2), 231-240 (2016).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+self-beating+cardiomyocytes+in+adult+mouse+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel type of self-beating cardiomyocytes in adult mouse ventricles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 (3), 361-366 (2009).</li>
<li>Shan, D., Marchase, R. B., Chatham, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+TRPC3+increases+apoptosis+but+not+necrosis+in+response+to+ischemia-reperfusion+in+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of TRPC3 increases apoptosis but not necrosis in response to ischemia-reperfusion in adult mouse cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology. 294 (3), 833-841 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+and+functional+role+of+the+rapidly+activating+delayed+rectifier+K%28%2B%29+current+in+left+and+right+atria+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Presence and functional role of the rapidly activating delayed rectifier K(+) current in left and right atria of adult mice.</a> European Journal of Pharmacology. 649 (1-3), 14-22 (2010).</li>
<li>Milgroom, A., Ralston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+skeletal+muscle+with+CLARITY+for+light+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging.</a> Cell Biology International. 40 (4), 478-483 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאז הלב רגיש מאוד איסכמיה, הזמן לקח כדי excise את הלב לטבול אותו CIB-EGTA קר כקרח כדי לעצור התכווצות צריך להישמר קצר ככל האפשר (<1 דקות). זהו השלב הקריטי הראשון בשיטה זו. הצעד הקריטי השני נוגע לכיוון הלב. האוריינטציה המסוימת של הלב שנכרת בשלב 2.1.2 מקלה על הצפייה וההסרה של רקמות השומן והחיבור סביב העורקים. לאחר ניקוי סביב העורקים, מניחים את הלב מהודק עם צד משטח לפנים על צלחת זלוף. השלב הקריטי האחרון כרוך החדרת מחט ההזרקה. בעת קידום המחט לכיוון הלב, מחט ההזרקה לא צריכה להיות מנותקת מצלחת הזלוף על מנת לשמור על מרחק קבוע מהצלחת. מיקום ההכנסה קרוב לשיא החדר השמאלי. הכנס את המחט בזהירות מבלי לסובב, שכן פיתול כזה עשוי להגדיל את החור. ניתן להעריך את עומק החדרת המחט על ידי צפייה בסימן האדום. אם המחט מוכנסת עמוק מדי, הקצה עשוי לנקב דרך מחיצת החדר ולהיכנס לחדר הימני או אם כי השסתום המיטרלי ולהיכנס לאטריום השמאלי. לאחר אישור היעלמות הדם מהקורק הכלילי, יש לתקן את המחט עם סרט הדבקה ללוחית הזלוף.
אורך ארוך יותר של העורקים מקשה על הידק של העורקים בתנוחה הנכונה. אם המהדק רחוק מדי מן האטריה, הלב עשוי להסתובב לאחר עירוי זלוף. כדי למנוע זאת, לחתוך את העורקים רק מתחת לעורק brachiocephalic כדי לקצר את כאבי העורקים לפני ההידוק.
אם הדם לא מתחיל לפרוק לאחר זלוף במהירות ראשונית של 0.5 מ"ל / דקה, להגדיל את המהירות ל 1 מ"ל / דקה. אם זה לא עוזר, מחט ההזרקה עשויה להיות ממוקמת באופן שגוי, כגון בחדר הימני, מחיצה חדרית או קיר שריר הלב השמאלי. במקרה כזה, להסיר את המחט מיד ולנסות להכניס אותו מחדש ליד השיא של החדר השמאלי. בעת החדרת המחט מספר פעמים, תאים מתעכלים עשויים לזרום החוצה מן החורים שנפתחו. שים לב כי זה בדרך כלל לא משפיע ברצינות על בידוד התא.
המפעילים יכולים לפקח על כל התהליך של זלוף antegrade של הלב באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי לבחון את השינויים בצבע ושקיפות והפעלה מחדש של מכות האטריה יחד עם העיכול. סך של 10 מ"ל של תערובת אנזימים צריך להיות המקסימום הנדרש, אפילו עבור לב ישן. בלבבות צעירים יותר (5-7 שבועות), אנו מפחיתים את הנפח ל 9 מ"ל, אשר דומה לגישה באמצעות זלוף מדרדר עם אותו תערובת אנזימים.
supernatant בצנטריפוגה הסופית מכיל פסולת, תאי דם, ולא מיוציטים ואילו, גלולה מכיל בעיקר cardiomyocytes וזיהום שאינם מיוציטים, כגון fibroblasts ותאי אנדותל. כדי לטהר את הקרדיומיוציטים, יש צורך בצעדים נוספים. באופן כללי, גלולה צריך להיות resuspended במדיום תרבות התא המתאים preplated במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על צלחת תרבית תא רקמה, ולאחר מכן בעדינות להסיר את cardiomyocytes על ידי pipetting ו preplating לתרבות.
תערובת האנזימים מכילה ריכוז נמוך של Ca2+ (0.3 מ"מ). לכן אנו דגירה תאים מתעכלים CIB-Ca2 +-BSA (1.2 mM Ca2+) לפני ההשעיה הסופית עם פתרון ההשעיה מחדש של התא (1.8 mM Ca2+), ואת הגידול ההדרגתי Ca2+ נמנע גרימת נזק לתא7. כל עוד הקרדיומיוציטים המבודדים שלמים (תאים רגיעה ללא התכווצות) הליך התאמה זה של Ca2+אינו משפיע על הכדאיות של התאים בעכברים. כמו התאים הפגועים מתים במהלך דגירה זו, אנו מקבלים כתוצאה מכך קבוצת תאים בריאה. באופן דומה, מיוציטים פרוזדוריים שלמים מבודדים (תאים רגיעה ללא התכווצות לא סדירה) ניתן לאחסן באותו פתרון ההשעיה מחדש של התא. עם זאת, myocytes הפרוזדורי נוטים להיות עדינים יותר כדי להיות מאוחסן להשוות את myocytes חדרית.
במעבדה, שיטת בידוד זו היא כמעט תמיד מוצלחת אלא אם כן החדרת המחט לחדר השמאלי נכשלת. הצלחנו גם לבודד תאים מהלב hypertrophied שהוכן על ידי התכווצות אבי העורקים רוחבית כירורגית. עם זאת, בעכברים מיושנים, שלעתים קרובות יש להם אוטם שריר לב קטן, הזלוף נפסק במקומות מסוימים, וכתוצאה מכך עיכול לא שלם ובכך תשואה נמוכה (איור 1C), בדומה לשיטת הנסיגה המבוססת על לנגנדורף. במקרים כאלה, ניתן לראות את הצורה המעוותת של הלב גם בתחילת הזחילה.
שיטת זלוף antegrade זו שימושית לבידוד תאי לב מעכברים בגילאים שונים אך לא מבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות ושפני ניסיונות. ייתכן שניתן יהיה ליישם שיטה זו על חולדות יילודים או נוער לפני התיישנות.
אחד היתרונות של שיטת זלוף antegrade זה הוא שזה מקטין את המכשולים הטכניים הקשורים באמצעות שיטת זלוף מדרדר מבוסס Langendorff עבור לבבות עכבר קטנים. הזמן הנדרש עבור זלוף הוא כ 7 דקות עם 10 מ"ל של האנזימים, תקופת עיכול קצרה זו מגבירה את הכדאיות של התאים. בנוסף, הוא מאפשר זלוף להתבצע באמצעות זרימת הדם הכלילית של הלב, גם לאחר שסתומי אבי העורקים כבר מתעכל. בידוד של מיוציטים פרוזדוריים בדרך כלל דורש זלוף מדרדר מבוסס Langendorff ודגרת נוספת עםאנזימים 17. גישה זו זלוף antegrade, עם זאת, יכול להחדיר עמוק את הרקמה עם האנזים כדי לבודד מיוציטים פרוזדוריים.
בניסויים באמצעות עכברים מרובים, יש לנקות את מנגנון לנגנדורף לפני שהוא מחלחל ללב הבא. עם זאת, בשיטת antegrade הנוכחית, כל עוד המספר הרצוי של ערכות מכשירים (למשל, מחטי מזרקים וצלחות זלוף) מוכנים מראש, זלוף יכול להתבצע ברציפות.
אנו מדווחים בזאת על המתודולוגיה הבסיסית של זלוף אנגרד של לב העכבר באמצעות אותם פתרונות כמו שיטת זלוף מדרדר מבוסס לנגנדורף ללא כימיקלים נוספים. ההרכב של perfusate ניתן לשנות כדי להתאים את מטרת הניסוי, כגון שימוש בחומר ניקוי המכיל EGTA במקום האנזימים כדי להפוך לב decellularized18.

בדרך כלל, הצעד הראשון של בידוד תא יחיד של רקמה מנותחת כרוך טחון הרקמה לחתיכות קטנות, ואחריו העיכול של רקמת החיבור מטריצה חוץ תאית עם אנזימים. עם זאת, לא ניתן לבודד קרדיומיוציטים בשיטת חיתוך כזו, שכן העשרה ברכיבי מטריצה חוץ-תאית, כולל סיבי קולגן ואלסטין, הופכת את שריר הלב לקשה מדי לטחון, והקרדיומיוציטים רגישים מאוד להיפוקסיה ולשינויים אחרים במיקרו-וירוס. לכן, באמצעות מערכת זלוף מדרדר מבוסס Langendorff1, שיטה לעיכול המטריצה חוץ תאית עם אנזימים פותחה כדי לבודד קרדיומיוציטים בודדים מהלב2,3,4.
בדגמי עכבר, זלוף מדרדר מבוסס Langendorff של הלב עם אנזימים משמש גם לבידוד של קרדיומיוציטים בודדים5,6,7,8. עם זאת, הכנרת של סיומת העכבר הקטנה והדקה וההרכבה שלה על מנגנון לנגנדורף לביצוע זלוף מדרדר דורשת רמה גבוהה של מיומנות, שכן קוטר העורקים בלב הבוגר הוא כ -1.2 מ"מ. יתר על כן, זה לוקח זמן לבצע ניסויים מרובים כמו מנגנון Langendorff יש לנקות לפני זלוף הלב הבא.
כחלופה זלוף מדרדר, שיטה חדשנית לבידוד cardiomyocytes מלב עכבר בוגר ללא מנגנון Langendorff פותחה. שיטה זו לייצור עידן התבססה על זלוף אנגרד של העורקים הכליליים9. לאחרונה שיפרנו כל שלב בפרוטוקול antegrade זה, כגון הידוק של העורקים, החדרת מחט ובקרת טמפרטורה, וניטרנו את כל הליכי הזלוף במיקרוסקופ10. אנו מדווחים בפירוט על עידון שיטת זלוף זו כדי לקצר את זמן הבידוד ולספק סרטון משלים. בשיטה זו, זלוף הלב לוקח בערך 7 דקות עם 10 מ"ל של האנזימים, ותקופת עיכול קצרה זו מגבירה את הכדאיות של התאים. זוהי שיטה פשוטה לבודד תאי לב בודדים באיכות גבוהה ללא צורך בתוספת של כימיקלים, כגון 2,3-butanedione monoxime (BDM)6,11 או טאורין5,8. אנו מאמינים כי שיטה זו תוריד את סף המיומנות של הטכניקה ולשפר את התועלת של קרדיומיוציטים העכבר במחקר בסיסי.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Wako Pure Chemical Industries, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן IgG נגד עכבר</td><td>בדיקות מולקולריות, ארה"ב</td><td>A11001</td><td>נוגדן משני עם תווית פלואורסצנטית. (דילול של 1:400 לצביעה חיסונית)</td></tr><tr><td>אנטי-אלפא;-אקטינין (ACTN)</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>A7811</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר (שיבוט EA-53). (דילול של 1:400 לצביעה חיסונית)</td></tr><tr><td>פפטיד נטריאורטי אנטי פרוזדורים (ANP)</td><td>Merck-Millipore, ארה"ב</td><td>AB5490-I</td><td>נוגדן רב-שבטי ארנב (דילול 1:2000 לכתמים מערביים)</td></tr><tr><td>אנטי-גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב</td><td>2118</td><td>נוגדן חד-שבטי לעכבר (דילול 1:10000 לכתמים מערביים)</td></tr><tr><td>אנטי אקטין שריר חלק (SMA)</td><td>דקו, דנמרק</td><td>M0851</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר (שיבוט 1A4) (1:400 לצביעה חיסונית)</td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד ארנב</td><td>אמרשם, GE Healthcare, ארה"ב</td><td>NA934</td><td>נוגדן משני (דילול 1:10000 לכתמים מערביים)</td></tr><tr><td>מלח דיסודיום ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>חומר ביולוגי להדבקה של התא או הרקמות</td></tr><tr><td>Chemi-Lumi One Super&nbsp;</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>02230-14</td><td>מגיב כימילומינסנט המשמש להכתמה מערבית.</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיקלים, ארה"ב</td><td>LS004176</td><td>בחר את הפעילות המובטחת להיות גדולה מ-300 יחידה/מ"ג.</td></tr><tr>מיני רוש <td>שלם</td><td>, גרמניה</td><td>11836153001</td><td>תערובת של מספר מעכבי פרוטאז.</td></tr><tr><td>4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>11034-56</td><td>משמש לצביעה גרעינית בלתי ניתנת לשימוש&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>08458-45</td><td>כולל 4.5 גרם/ליטר</td></tr><tr><td>צינור הארכה</td><td>גלואוז עליון, יפן</td><td>X1-50</td><td>התחבר עם מזרק ומחט הזרקה לזלוף מקדים.&nbsp;</td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון EPC-8</td><td>HEKA, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>Narishige Scientific Instrument Lab., יפן</td><td></td><td>קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, קוטר פנימי 0.9 מ"מ</td></tr><tr><td>מלח ליתיום GTP</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרואלקטרודות אופקי&nbsp;</td><td>גרמניה)</td><td>מחצלת חימום P-97</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Natsume Seisakusho, יפן</td><td>KN-475-3-40</td><td>ציוד לחימום צלחת הזילוף.</td></tr><tr><td>משאבת עירוי</td><td>TERUMO, יפן</td><td>TE-311</td><td>משאבת מזרק עירוי לזלוף קדמי.</td></tr><tr><td>מחט Injeciton (מד 27)</td><td>TERUMO, יפן</td><td>מחט NN-2719S</td><td>להחדרה לחדר השמאלי.</td></tr><tr><td>אינסולין (מלבלב בקר)</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>I5500</td><td>מתמוסס ב-0.1 M HCl.</td></tr><tr><td>מטחנה אלחוטית מיני</td><td>Funakoshi, יפן</td><td>cG-4A</td><td>מטחנה קטנה להומוגניזציה של רקמות בצינור דגימה של 1.5 מ"ל.</td></tr><tr><td>4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution (4% PFA)</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>09154-85</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G אשלגן</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>26239-84</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>26807-21</td><td></td></tr><tr><td>10X פוספט חוצץ מלח (pH7.4) (10X PBS)</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>27575-31</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית מרובת בארות פלסטיק</td><td>פלקון, ארה"ב</td><td>353226</td><td>השתמש במכסה של צלחת התרבית מרובת הבארות כצלחת הזילוף.</td></tr><tr><td>מזרק פלסטיק (20 מ"ל)</td><td>TERUMO, יפן</td><td>SS-20ES</td><td>שימוש לעירוי CIB-EGTA.</td></tr><tr><td>מזרק פלסטיק (30 מ"ל)</td><td>TERUMO, יפן</td><td>SS-30ES</td><td>השתמש לעירוי של פיפטת העברת פלסטיק תערובת אנזים</td></tr><tr><td></td><td>Sarstedt, גרמניה</td><td>86.1171</td><td>חתוך את הקצה רגע לפני יניקת לב העכבר לתוך הפיפטה.</td></tr><tr><td>ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF)</td><td>Merck-Millipore, ארה"ב</td><td>IPVH00010</td><td>ממברנת Immobilin-P (ממברנת העברה לספיגת חלבון)</td></tr> <tr><td>פרוטאז</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>P5147</td><td>תערובת של שלושה פרוטאזות או יותר כולל סרין פרוטאז חוץ-תאי.</td></tr><tr><td>תמיסת חיץ לדוגמא 4X</td><td>Fuji Film, יפן</td><td>198-13282</td><td>מכילה 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS, 40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB</td></tr><tr><td>SDS פוליאקרילאמיד ג'ל&nbsp; (15%)</td><td>Fuji Film, יפן</td><td>193-14991</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>נקלאי טסקה, יפן</td><td>32237-14</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ 10X Tris-Glycine (10X TG)</td><td>Nacalai Tesque, יפן</td><td>09422-81</td><td>מכיל 0.25 M-tris ו-1.92 M-Glycine, (pH 8.3)&nbsp;</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>T8003</td><td>טריפסין מבקר מסוג 1.&nbsp;</td></tr><tr><td>מהדק כלי דם</td><td>Karl Hammacher GmbH, גרמניה</td><td>HSE 004-35</td><td>מהדק כלי דם ישר קטן המשמש להידוק אבי העורקים.</td></tr><tr><td>כל שאר הריאגנטים</td><td>נקלאי טסקה, יפן</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת זלוף antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

במחקר בסיסי באמצעות לב העכבר, בידוד קרדיומיוציטים בודדים קיימא הוא צעד טכני חיוני להתגבר. באופן מסורתי, בידוד קרדיומיוציטים מארנבים, שרקנים או חולדות בוצע באמצעות זלוף מדרדר של הלב עם אנזימים באמצעות מנגנון Langendorff. עם זאת, רמה גבוהה של מיומנות נדרשת כאשר שיטה זו משמשת עם לב עכבר קטן. שיטת זלוף antegrade שאינו משתמש במנגנדורף מנגנון דווח לאחרונה לבידוד של קרדיומיוציטים העכבר. אנו מדווחים בזאת פרוטוקול מלא עבור זלוף antegrade משופר של הלב שנכרת כדי לבודד תאי לב בודדים מעכברים בוגרים (8 - 108 שבועות). זלוף Antegrade מבוצע על ידי הזרקת perfusate ליד השיא של החדר השמאלי של הלב שנכרת, שאב העורקים של אשר היה מהודק, באמצעות משאבת עירוי. כל ההליכים מתבצעים על מחצלת תנור מחוממת מראש תחת מיקרוסקופ, המאפשרת ניטור של תהליכי ההזרקה והזלוף. התוצאות מראות כי מיוציטים חדריים ואקבריים, ופיברובלסטים יכולים להיות מבודדים היטב מעכבר בוגר יחיד בו זמנית.

העיקרון של שיטה זו הוא פשוט: perfusate זורם מן התא השמאלי, שסתום אבי העורקים נפתח, ואת perfusate פועל לתוך העורק הכלילי באותו כיוון כמו ריצת הדם, שכן אבי העורקים סגור על ידי הידוק, המאפשר זלוף עמוק של שריר הלב על מנת לעכל את המטריצה החוץ תאית.
מיוציטים חדריים מבודדים זה עתה בשיטה הנוכחית מוצגים באיור 1A. איור 1B מציג תמונות מוגדלות של מיוציטים חדריים ופטריים. הליך בידוד זה הביא לתשואה גבוהה (70%-80%) של מיוציטים חדריים רגיעה בצורת מוט מעכברים בוגרים (8-10 שבועות), שהיו זמינים בתוך כ 5 שעות לאחר הבידוד (איור 1C), מרווח דומה לזה בעת שימוש בהליך המסורתי מבוסס Langendorff7. עם זאת, היחס בין תאים בני קיימא שבודדו זה עתה היה נמוך יותר בעכברים בגילאי &gt;2 שנים (איור 1C). המספר הכולל של מיוציטים חדריים שהושגו לכל לב בוגר באמצעות פרוטוקול זה היה כ 3 x 106 תאים, אשר היה דומה לערך שדווח בעבר7,12. פוטנציאל הפעולה שנרשם במיציטים החדריים והפרוצדורניים(איור 1D)היה דומה לזה של תאים שהושגו על ידי השיטה המבוססת על לנגנדורף10. ניתוח חיסוני אישר כי המבנה הסרקוומרי של מיוציטים חדריים היה מאורגן היטב עם קרום תא גלוי בבירור (איור 2A). הקרדיומיוציטים הבודדים המבודדים בשיטה זו יכולים לשמש ישירות בניסויים, כגון ניתוח אלקטרופיזיולוגי10 או ניסוי immunostaining.
פיברובלסטים לבביים קיימים בחללים ביניים. עיכול מספיק של המטריצה החוץ תאית גורם לבידוד של תאים אלה. פיברובלסטים לב מבודדים להתרבות בתנאי תרבות ניתן לעבור מספר פעמים או מאוחסן חנקן נוזלי בתמיסת מאגר התא המתאים. איור 2B מראה כי רוב פיברובלסטים לב תרבותיים הפכו myofibroblasts במהלך תת תרבות, כפי שאושר על ידי ביטוי מוגבר של α חלקה שריר actin13,14. כמו כן, אבות הלב יכולים להיות מבודדים עם השיטה הנוכחית ותרבית במדיום התרבות המתאים, אשר מתחילים להכות באופן אוטומטי10,15.
הומוגניזציה של שריר הלב חזק לא קל, במיוחד עבור רקמת לב מעכברים בגילאי, אשר בעל כמות גדולה של סיבים חוץ תאיים. לאחר זלוף אנגרד, חלבון מן האטריה החדרים ניתן הומוגנית בקלות במאגר התמוגה עם כוח אור כדי לחלץ חלבונים. ניתוח כתמים מערבי הדגים את הביטוי הספציפי של ANP באטריה אך לא בחדרים מעכברים בוגרים (בני 20 שבועות) ומבוגרים (בני 108 שבועות)(איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig1.jpg"> איור 1. קרדיומיוציטים מבודדים מעכברים. א. מיוציטים חדריים מבודדים זה עתה עם זלוף אנגרד, עם תמונות שנרכשו בהגדלה נמוכה. לאחר הכביסה הסופית, הקרדיומיוציטים נוצלו מחדש עם 2 מ"ל של פתרון ההשעיה מחדש של התא, 100 μL מתוכם הושלכו על צלחת התרבות בתחתית הזכוכית ויישוב התא חיכה. בר, 100 מיקרומטר.B. תמונות מוגדלות של מיוציטים חדריים מבודדים (עליון) ומיוציטים פרך (למטה). בר, 100 מיקרומטר.C. תאים מבודדים הושעו בתמיסת ההשעיה מחדש של התא ואחסנו ב 37 מעלות צלזיוס לתקופה הרצויה, ומספר מיוציטים חדריים חיים נספר ב 10-15 שדות תחת מיקרוסקופ. תאים מעוגלים נחשבו לפצועים או מתיםבאופן בלתיהפיך 16 . סמלים ירוקים, כחולים ואדומים התקבלו מ-3 עכברים בגיל 8-10 שבועות, וסמלים שחורים היו מעכבר בן 106 שבועות. סימן צהוב מציין את הממוצע של כל קבוצה. ד. פוטנציאל פעולה מייצג שנרשם ממיוציטים חדריים (שחורים) ופסוליים (אדומים) של 8-10 עכברים. הנתונים התקבלו מהתאים כ 3 שעות לאחר הבידוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig2.jpg"> איור 2. חיסון עבור α-actinin ב myocytes חדרי עכבר מבודדים α חלקה שרירים actin פיברובלסטים לב עכבר בתרבית. א. מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית של אימונוסטיין עבור α-אקטין (ירוק), כתמי DAPI עבור גרעינים (כחול) ותמונת DIC של מיוציטים חדריים מבודדים מלב העכבר עם זלוף אנגרד. בר, 50 מיקרומטר.B. Immunostaining עבור α חלקה שריר actin (ירוק), כתמי DAPI עבור גרעינים (כחול) ותמונה DIC של פיברובלסטים לב מבודדים מלב העכבר עם זלוף antegrade. פיברובלסטים לבביים היו תרבותיים במשך ארבעה ימים. בר, 100 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig2large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61866/61866fig3.jpg"> איור 3. ניתוחי כתמים מערביים של ANP באטריה ובחמלים. ניתוחי כתמים מערביים עבור פפטיד נטריורטיק סמן סמן פרך (ANP) ב atria (A) ו ventricles (V) מוכן ממבוגר (20 שבועות) ומעלה (108 שבועות) לבבות. ANP נוכח באטריה אך נעדר בחדרים. השתמש גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) כמו חלבון שליטה בית שמירה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/61866fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">פתרונות מלאי לבידוד תאי לב</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">10X CIB (500 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>37.99 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCI</td>
			<td>2.01 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>2.5 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0.23 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (היפס)</td>
			<td>29.79 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>מילוי עד 500 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 מ"מ CaCl2 תפוגת מניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 </td>
			<td>100 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון מניית EGTA של 400 מ"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>400 מ"ר</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון אינסולין</td>
		</tr>
<tr>
<td>אינסולין</td>
			<td>יחידה אחת/מ"ל ב- 0.1 M HCl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">50X פתרון מלאי אנטיביוטיקה (20 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>פניצילין</td>
			<td>100 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>סטרפטומיצין</td>
			<td>100 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>פנול אדום</td>
			<td>1.5 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>20 מ"ל וחיטוי באמצעות סינון</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרון 10X Tyrode (1000 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>81.82 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>4.03 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>0.47 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (היפס)</td>
			<td>11.92 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>נאוה</td>
			<td>0.8 גר'</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>מילוי עד 1000 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">סולוטין מלאי לחיסון</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מלאי DAPI</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>2 מ"ג/מ"ל במתנול</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פתרונות מלאי עבור כתמים מערביים</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר HEPES (100 מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקלה (נקל)</td>
			<td>0.88 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>400 מ"מ אגטה</td>
			<td>0.25 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>היפס (היפס)</td>
			<td>0.24 גרם</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M נאוה</td>
			<td>התאמת pH ל- 7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>מילוי עד 500 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">קוקטייל מעכבי פרוטאז</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיני שלם</td>
			<td>טאבלט אחד</td>
		</tr>
<tr>
<td>DW</td>
			<td>0.4 מ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1. תיאור פתרונות המלאי. שמור על פתרונות מלאי ב 4 °C (69 °F). מעכבי פרוטאז Aliquot קוקטייל לאחסון ב -20 מעלות צלזיוס.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">פתרונות לבודד תאי לב</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB (200 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>10X CIB</td>
			<td>20 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פתרון אינסולין</td>
			<td>0.01 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>גלוקוז</td>
			<td>0.79 גרם</td>
		</tr><tr><td>1M נאוה</td>
			<td>התאמת pH ל- 7.4</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>מילוי עד 200 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">תמיסת תערובת אנזימים (30 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>סוג קולגנאז2</td>
			<td>30 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>טריפסין (נסיון)</td>
			<td>1.8 מ"ג (1.8 מ"ג)</td>
		</tr><tr><td>פרוטאז</td>
			<td>1.8 מ"ג (1.8 מ"ג)</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניות CaCl2 של 100 מ"מ</td>
			<td>0.09 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>30 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-Ca2+-BSA (15 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>30 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניות CaCl2 של 100 מ"מ</td>
			<td>0.18 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>15 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CIB-אגטה (150 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניית EGTA של 400 מ"מ</td>
			<td>0.150 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>CIB</td>
			<td>150 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון טיירוד (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>פתרון מניית טיירוד 10X</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>גלוקוז</td>
			<td>0.99 גרם</td>
		</tr><tr><td>1M CaCl2
</td>
			<td>1.8 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>1M נאוה</td>
			<td>התאמת pH ל- 7.4</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>מילוי עד 1000 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון שימוש חוזר בתאים (15 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>BSA</td>
			<td>30 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>פתרון מלאי אנטיביוטיקה 50X</td>
			<td>0.3 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פתרון טיירוד</td>
			<td>15 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרונות לחיסון</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון דבק תא (0.3 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>תא-טאק</td>
			<td>0.01 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>0.1 M נהקו3 (עמ' 8.0)</td>
			<td>0.285 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>0.1 מ' נאוה</td>
			<td>0.005 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרון חסימה-פרמביליזטין (10 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>סרום שור עוברי</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>טריטון X-100</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>פי 10 PBS</td>
			<td>1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>7 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">K+ פתרון פיפטה עשיר</td>
		</tr><tr><td>אשלגן אספרטט</td>
			<td>70 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>KCl</td>
			<td>50 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4
</td>
			<td>10 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>MgSO4
</td>
			<td>1 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>מלח דיסודיום ATP</td>
			<td>3 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>מלח ליתיום GTP</td>
			<td>0.1 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>EGTA (EGTA)</td>
			<td>5 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>היפס (היפס)</td>
			<td>5 מ"מ</td>
		</tr><tr><td>קו ה- KOH</td>
			<td>ה-pH מותאם ל-7.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פתרונות כתמים מערביים</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר תמוגה (1 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>מאגר HEPES</td>
			<td>0.86 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>לא אידיט-P40</td>
			<td>0.1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>קוקטייל מעכבי פרוטאז</td>
			<td>0.04 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר הפעלה (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>10X TG (0.25 מטר טריס ו-1.92 מ' גליצין)</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>SDS (SDS)</td>
			<td>1 גרם</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>900 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר העברה (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>10X TG</td>
			<td>100 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>מתנול (רתנול)</td>
			<td>200 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>700 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="2">מאגר סופג (TBST) (1000 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>5M NaCl</td>
			<td>20 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>2M טריס-HCl (עמ' 7.5)</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>10% טווין 20</td>
			<td>10 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>DW</td>
			<td>965 מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>שולחן 2. תיאור פתרונות העבודה לבודד תאי לב, חיסונים וכתמים מערביים. הכינו את כל פתרונות העבודה ממש לפני הניסויים.
איור משלים 1. קו המתאר של בידוד התא. תרשים זרימה של בידוד מיוציטים חדריים ואסטריים ופיברובלסטים לב מלב אחד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61866/SupplementaryFig1R.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

פיתחנו שיטה פשוטה ללא לנגנדורף לבידוד תאי לב בודדים של העכבר בטכניקת אריזה. שיטה זו מאפשרת בידוד של תאי לב מעכברים צעירים ומבוגרים יותר. זלוף מדרדר המבוסס על לנגנדורף נחשב לסטנדרט זהב לבידוד מיוציטים לבביים בבעלי חיים ניסיוניים שונים.עם זאת, קנול של LTA הוא קשה מבחינה טכנית בעכברים בשל גודלם הקטן. עבור קציר לב העכבר, לאחר אישור המתת חסד וגילוח הבטן, לפתוח את חלל בית החזה במהירות כדי לחשוף את הלב ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך בערך את גודל הלב למצוץ את הלב לתוך פיפטה. הרם את הפיפט כדי ליצור מספיק מקום להכניס מספריים מעוגלים ולהשתמש במספריים כדי להוציא את הלב מהצד הגבי דואג כדי למנוע פגיעה atria.מיד, מניחים את הלב לתוך זכוכית 30 מיליליטר המכיל CIB-EGTA קר כקרח במשך כדקה אחת. כאשר הצירים נעצרו, מניחים את הלב בצלחת תרבות 35 מיליליטר המכיל CIB-EGTA קר כקרח, ולהסיר את הריאה ורקמות גלויות אחרות. מניחים את הלב המנוקה בגסות על דוכן לב מלא בצד CIB-EGTA קריר למטה ומניחים את המעמד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.הסר את השומן ואת רקמות החיבור מסביב לאבי העורקים. אם אורך העורקים החתוכים ארוך מדי, קיצצו את העורקים ממש מתחת לעורק הברכיוצפלי וכוונו את הלב כך שהמשטח הקדמי פונה קדימה. השתמש בפינצטה כדי להרים את קצה העורקים ולהשתמש מהדק כלי דם קטן כדי להדק את העורקים ליד אטריה תוך בעדינות דוחף למטה על אטריה.לאחר מכן מניחים את הלב מהודק על צלחת זלוף עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה לחות הלב עם כמה טיפות של CIB-EGTA. עבור זלוף antegrade, לטעון מזרק 20 מיליליטר המכיל CIB-EGTA מראש מחובר צינור הרחבה גמישה מחט הזרקה מסומן על משאבת עירוי ולהתחיל את המשאבה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. כאשר המחט והמשאבה מולאו, מניחים את מחט ההזרקה על צלחת הזלוף עם הצד הקצר יותר של הצורה האלכסונית מלפנים ומחליקים את המחט עד שהיא רק נוגעת בשיא הלב.בזהירות, להכניס את המחט ליד השיא של החדר השמאלי לתוך החדר מבלי לסובב או לנתק את המחט מהצלחת, צופה בסימן כדי להעריך את עומק החדרת המחט. כאשר החדרת המחט הושלמה, הדם צריך להתחיל לזרום מן העורק הכלילי. השתמש בסרט הדבקה כדי לתקן את מחט ההזרקה לצלחת ולהגדיל את מהירות המשאבה למיליליטר אחד לדקה.אם הלב חדור בהצלחה, זרימת החיץ נימי צריך להיות גלוי ממש מתחת לאפיקרדיום. לאחר 2-3 מיליליטר של זלוף CIB-EGTA, החלף את מאגר הזלוף בתמהיל אנזימים. לאחר מיליליטר אחד עד שני מיליליטר כבר perfused, להגדיל את מהירות המשאבה ל 1.5 מיליליטר לדקה.השתמש פיפטה כדי להסיר את זלוף המכיל דם שנצבר זורם מהלב לפי הצורך ולעצור את זלוף כאשר הנפח הכולל של אנזים perfused מגיע 10 מיליליטר. בסוף הזלוף, מעבירים 10 מיליליטר של תערובת אנזימים מהמזרק לצלחת תרבות של 60 מילימטר על מחצלת תנור ומוסיפים 20 מיליגרם BSA למנה. בעדינות מערבולת את המנה כדי להמיס את האבקה ולהסיר את מחט ההזרקה ואת מהדק מהלב.הסר את החדרים ואת atria מהלב ומניחים את הרקמות לתערובת אנזים BSA בתוספת. כדי לבודד את מיוציטים חדרית, להשתמש בשני זוגות פינצטה כדי לתפוס את epicardium בעדינות למשוך את החדרים לחתיכות קטנות. כאשר כל שברי החדר נוצרו, לפזר את התאים כ 30 פעמים עם צינור עדין לסנן את הפסולת מעוכל דרך מסננת 100 מיקרון רשת התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה cardiomyocyte ב CIB מראש הוסיף סידן ו- BSA ולהדגיר את התאים במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend קרדיומיוציטים מזרזים בנפח המתאים של פתרון ההשעיה התא לתחזוקתם ב 37 מעלות צלזיוס עד ניתוח במורד הזרם. כדי לבודד את מיוציטים פרוזדוריים, להעביר את atria למיכל של CIB מראש התחרה בתוספת סידן ו- BSA ולקרוע את האטריה לחתיכות כפי שהוכח.השתמש פיפטה 20 microliter להגדיר 10 microliters לשבש את הרקמות על ידי pipetting ולאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן התשען מחדש את התא התוך-מדינתי בנפח מתאים של פתרון שימוש חוזר בתאים. בתמונה זו, מיוציטים חדריים מבודדים טריים ניתן לראות.הליך בידוד זה גורם לתפוקה של 70 עד 80% של מיוצ'יטים חדריים רגיעה בצורת מוט משמונה עד עשרה שבועות עכברים בתוך כחמש שעות של בידוד. היחס בין תאים בני קיימא שבודדו זה עתה נמוך יותר בעכברים מעל גיל שנתיים. פוטנציאל הפעולה שנרשם במיציטים החדריים והפוריים דומה לאלה הנמדדים בתאים המתקבלים על ידי השיטה המבוססת על לנגנדורף.ניתוח immunostaining יכול לשמש כדי להעריך את הארגון של המבנה הסרקוומרי של מיוציטים חדריים ואת הטרנספורמציה של פיברובלסטים לב לתוך myofibroblasts לאחר תת תרבות. ניתוח כתם מערבי מומלץ לקבוע את הביטוי הספציפי של חלבונים של עניין אטריה החדרים לאחר העיבוד. לאחר זלוף עם אנזימים, חלבונים מן האטריה החדרים ניתן הומוגנית בקלות מאגר תמוגזה עם כוח אור עבור מיצוי חלבון.חשוב לשלוט בכיוון ובמעמקי החדרת המחט. בעת החדרת המחט לתוך החדר השמאלי, להיזהר לא לנקב את מחיצת החדר או לחדור את השסתום. אתה יכול לשנות את ההרכב של perfusate בהתאם למטרת הניסוי.לדוגמה, חומר ניקוי בתוספת EGTA יכול לשמש להכנת פיגום ללא תאים של הלב.

an-antegrade-perfusion-method-for-cardiomyocyte-isolation-from-mice

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר טכניקת זילוח מקדימה של לב עכבר מבודד שבמהלכה מוזרק פרפוזט דרך החדר השמאלי, ובסופו של דבר הוא מחורר את שריר הלב כולו. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד cardiomyocytes ממודלים murine וליצור לבבות decellularized עבור יישומים נוספים במורד הזרם.

מודל זילוח Antegrade: טכניקת Ex Vivo לניקוב לב עכבר מבודד

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טרנס-תירטוי ותרבות ארוכת טווח של עכבר בוגר וקרדיומיוציטים של חולדות.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly...

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים Conifer

למד שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים ללא צורך במערכת לנגנדורף. השיטה מאפשרת בידוד תאים ביעילות של 70-80% מעכברים בגילאים שונים לחקר פיזיולוגיה ומחלות לב.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

גלה סרטונים נוספים