שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

פיתחנו שיטה פשוטה ללא לנגנדורף לבידוד תאי לב בודדים של העכבר בטכניקת אריזה. שיטה זו מאפשרת בידוד של תאי לב מעכברים צעירים ומבוגרים יותר. זלוף מדרדר המבוסס על לנגנדורף נחשב לסטנדרט זהב לבידוד מיוציטים לבביים בבעלי חיים ניסיוניים שונים.

עם זאת, קנול של LTA הוא קשה מבחינה טכנית בעכברים בשל גודלם הקטן. עבור קציר לב העכבר, לאחר אישור המתת חסד וגילוח הבטן, לפתוח את חלל בית החזה במהירות כדי לחשוף את הלב ולהשתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך בערך את גודל הלב למצוץ את הלב לתוך פיפטה. הרם את הפיפט כדי ליצור מספיק מקום להכניס מספריים מעוגלים ולהשתמש במספריים כדי להוציא את הלב מהצד הגבי דואג כדי למנוע פגיעה atria.

מיד, מניחים את הלב לתוך זכוכית 30 מיליליטר המכיל CIB-EGTA קר כקרח במשך כדקה אחת. כאשר הצירים נעצרו, מניחים את הלב בצלחת תרבות 35 מיליליטר המכיל CIB-EGTA קר כקרח, ולהסיר את הריאה ורקמות גלויות אחרות. מניחים את הלב המנוקה בגסות על דוכן לב מלא בצד CIB-EGTA קריר למטה ומניחים את המעמד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.

הסר את השומן ואת רקמות החיבור מסביב לאבי העורקים. אם אורך העורקים החתוכים ארוך מדי, קיצצו את העורקים ממש מתחת לעורק הברכיוצפלי וכוונו את הלב כך שהמשטח הקדמי פונה קדימה. השתמש בפינצטה כדי להרים את קצה העורקים ולהשתמש מהדק כלי דם קטן כדי להדק את העורקים ליד אטריה תוך בעדינות דוחף למטה על אטריה.

לאחר מכן מניחים את הלב מהודק על צלחת זלוף עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה לחות הלב עם כמה טיפות של CIB-EGTA. עבור זלוף antegrade, לטעון מזרק 20 מיליליטר המכיל CIB-EGTA מראש מחובר צינור הרחבה גמישה מחט הזרקה מסומן על משאבת עירוי ולהתחיל את המשאבה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. כאשר המחט והמשאבה מולאו, מניחים את מחט ההזרקה על צלחת הזלוף עם הצד הקצר יותר של הצורה האלכסונית מלפנים ומחליקים את המחט עד שהיא רק נוגעת בשיא הלב.

בזהירות, להכניס את המחט ליד השיא של החדר השמאלי לתוך החדר מבלי לסובב או לנתק את המחט מהצלחת, צופה בסימן כדי להעריך את עומק החדרת המחט. כאשר החדרת המחט הושלמה, הדם צריך להתחיל לזרום מן העורק הכלילי. השתמש בסרט הדבקה כדי לתקן את מחט ההזרקה לצלחת ולהגדיל את מהירות המשאבה למיליליטר אחד לדקה.

אם הלב חדור בהצלחה, זרימת החיץ נימי צריך להיות גלוי ממש מתחת לאפיקרדיום. לאחר 2-3 מיליליטר של זלוף CIB-EGTA, החלף את מאגר הזלוף בתמהיל אנזימים. לאחר מיליליטר אחד עד שני מיליליטר כבר perfused, להגדיל את מהירות המשאבה ל 1.5 מיליליטר לדקה.

השתמש פיפטה כדי להסיר את זלוף המכיל דם שנצבר זורם מהלב לפי הצורך ולעצור את זלוף כאשר הנפח הכולל של אנזים perfused מגיע 10 מיליליטר. בסוף הזלוף, מעבירים 10 מיליליטר של תערובת אנזימים מהמזרק לצלחת תרבות של 60 מילימטר על מחצלת תנור ומוסיפים 20 מיליגרם BSA למנה. בעדינות מערבולת את המנה כדי להמיס את האבקה ולהסיר את מחט ההזרקה ואת מהדק מהלב.

הסר את החדרים ואת atria מהלב ומניחים את הרקמות לתערובת אנזים BSA בתוספת. כדי לבודד את מיוציטים חדרית, להשתמש בשני זוגות פינצטה כדי לתפוס את epicardium בעדינות למשוך את החדרים לחתיכות קטנות. כאשר כל שברי החדר נוצרו, לפזר את התאים כ 30 פעמים עם צינור עדין לסנן את הפסולת מעוכל דרך מסננת 100 מיקרון רשת התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.

לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה cardiomyocyte ב CIB מראש הוסיף סידן ו- BSA ולהדגיר את התאים במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend קרדיומיוציטים מזרזים בנפח המתאים של פתרון ההשעיה התא לתחזוקתם ב 37 מעלות צלזיוס עד ניתוח במורד הזרם. כדי לבודד את מיוציטים פרוזדוריים, להעביר את atria למיכל של CIB מראש התחרה בתוספת סידן ו- BSA ולקרוע את האטריה לחתיכות כפי שהוכח.

השתמש פיפטה 20 microliter להגדיר 10 microliters לשבש את הרקמות על ידי pipetting ולאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן התשען מחדש את התא התוך-מדינתי בנפח מתאים של פתרון שימוש חוזר בתאים. בתמונה זו, מיוציטים חדריים מבודדים טריים ניתן לראות.

הליך בידוד זה גורם לתפוקה של 70 עד 80% של מיוצ'יטים חדריים רגיעה בצורת מוט משמונה עד עשרה שבועות עכברים בתוך כחמש שעות של בידוד. היחס בין תאים בני קיימא שבודדו זה עתה נמוך יותר בעכברים מעל גיל שנתיים. פוטנציאל הפעולה שנרשם במיציטים החדריים והפוריים דומה לאלה הנמדדים בתאים המתקבלים על ידי השיטה המבוססת על לנגנדורף.

ניתוח immunostaining יכול לשמש כדי להעריך את הארגון של המבנה הסרקוומרי של מיוציטים חדריים ואת הטרנספורמציה של פיברובלסטים לב לתוך myofibroblasts לאחר תת תרבות. ניתוח כתם מערבי מומלץ לקבוע את הביטוי הספציפי של חלבונים של עניין אטריה החדרים לאחר העיבוד. לאחר זלוף עם אנזימים, חלבונים מן האטריה החדרים ניתן הומוגנית בקלות מאגר תמוגזה עם כוח אור עבור מיצוי חלבון.

חשוב לשלוט בכיוון ובמעמקי החדרת המחט. בעת החדרת המחט לתוך החדר השמאלי, להיזהר לא לנקב את מחיצת החדר או לחדור את השסתום. אתה יכול לשנות את ההרכב של perfusate בהתאם למטרת הניסוי.

לדוגמה, חומר ניקוי בתוספת EGTA יכול לשמש להכנת פיגום ללא תאים של הלב.