בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת DNA/Ki67 לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בעכברים מחוסנים
5 בינואר 2021
הרחבת ציפורן היא תכונה מרכזית של תגובת תאי T ספציפיים אנטיגן. עם זאת, מחזור התא של תאי T מגיב אנטיגן נחקר בצורה גרועה, בין היתר בגלל מגבלות טכניות. אנו מתארים שיטה ציטומטרית זרימה לנתח באופן קלוני הרחבה תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן בטחול ובלוטות הלימפה של עכברים מחוסנים.
הפרוטוקול שלנו מספק גישה מעשית שבאמצעותה טחול עכבר ובלוטות לימפה ניתן להשתמש כדי לשקף את הדינמיקה של תגובת תא T גדול יותר מאשר מתן תמונה פנוטיפית במצב יציב. הטכניקה שלנו מזהה ברגישות תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן העוסקים בתגובה מתמשכת. תאי CD8 T מתרבים נמדדים ללא ההשפעות המבלבלות של טיפול תרופתי ב- vivo או העברת תאים.
הטכניקה שלנו יכולה לספק חלון בדינמיקה החיסונית במספר הגדרות. לדוגמה, ביחס לתגובה לחיסון וזיהומים, מחלות אוטואימוניות ואימונותרפיה לסרטן. הכן מאגר שטיפה טרי של 1x permeabilization על ידי דילול מאגר פרמזיזציה של פי 10 עם מים מזוקקים וסינן אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר כדי למנוע אגרגטים.
לדלל נוגדן חד שבטי Ki67 FITC ב 1x permeabilization לשטוף חוצץ כפי שנקבע עם ניסוי titration עבור נפח סופי של 100 microliters לכל מדגם. הוסף 3 מיליליטר של 1x permeabilization לשטוף חוצץ לכל צינור עם תאים צנטריפוגה ב 400 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את סופר-טבעי.
שוב, מוסיפים את 1x permeabilization לשטוף חוצץ צנטריפוגה כדי גלולה את התאים. לאחר מכן, זרוק את סופרנטנט. הוסף 100 מיקרוליטרים של נוגדן חד שבטי מדולל Ki67 FITC לכדור, ואז מערבולת ודגרה במשך 30 דקות בחושך.
לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של 1x permeabilization חוצץ, centrifuging לאחר כל לשטוף, ולהשליך את supernatant. הוסף 350 מיקרוליטרים של PBS לכדור התא כדי שדגימות יירכשו ישירות בציטומטר הזרימה ו -250 מיקרוליטרים של PBS לכדור התא כדי שדגימות יתדגרו עם Hoechst להכתמת DNA. הכן את תמיסת Hoechst ו- PBS והוסף אותו לכל דגימה כך שהריכוז הסופי הוא שני מיקרוגרם למיליליטר.
מערבולת ודגרה הדגימות במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגות הדגימות במשך חמש דקות ולהוסיף 350 microliters של PBS לכדור התא. פתח את התוכנה וצור קבוצות שונות המתאימות לאיברים השונים שיש לנתח על-ידי לחיצה על צור קבוצה"במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה.
פתח את חלון הקבוצה שהשתנה על-ידי לחיצה כפולה על שם הקבוצה וסנכרן את הקבוצות החדשות שנוצרו על-ידי הוספת סימן ביקורת על הפונקציה המסונכרנת. גרור כל קובץ FCS לקבוצה המתאימה לו ולאחר מכן צור אסטרטגיית gating החל מקבוצת a-LN. פתח את חלון הגרף על-ידי לחיצה כפולה על המדגם המוכתם במלואו כדי להציג את האירועים המנוכרים שנרכשו עבור המדגם בפתיחת נקודה.
שים לב שציר ה- x ו- y מסומנים כמו בקבצי FCS, כפי שצוין בטבלה שתיים של קובץ הגדרות ציטומטר הזרימה של כתב יד זה. ודא כי מוצג מספר מספיק של אירועים עבור פריט חזותי מתאים. במידת הצורך, פתח העדפות על-ידי לחיצה על סמל הלב ברצועת הכלים של סביבת העבודה, בחר תרשימים ולאחר מכן נקודה התוויית "כסוג גרף, ובדוק שמספר הנקודות שצוירו בתיבה המתאימה הוא נכון או לשנות אותו.
הצג את האירועים המנוכרים בחלון הגרף בפתילת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- DNA-W בציר ה- y. השתמש בקנה מידה ליניארי עבור שני הצירים. במידת הצורך שנה קנה מידה לוגריתמי ליניארי על-ידי לחיצה על התיבה המצוינת עם T קרוב לכל ציר בחלון התרשים.
בחר אוכלוסיית תא בודד על-ידי לחיצה על מלבן במקטע כלי הגינג ולאחר מכן לחץ פעמיים במרכז השער המלבני כדי להציג תאים בודדים בפתילת נקודה עם פרמטר FSC-A בציר x ותא מת מת על ציר ה- y. לחץ על המצולע כדי לבחור את אוכלוסיית התאים החיים, אשר שליליים למות תאים מתים. לחץ פעמיים במרכז שער המצולע כדי להציג את התאים בפתילציית נקודה עם הפרמטר FSC-A בציר x והפרמטר SSC-A בציר ה- y.
לחץ על מלבן וליצור שער רגוע לכלול את כל התאים החיים יחיד בגרף זה. לחץ פעמיים במרכז השער הרגוע כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם CD3 בציר ה- x ו- CD8 בציר ה- y. השתמש בסולם הגישה המתאים לפריט חזותי בחלון התרשים.
במידת הצורך, שנה את סולם x ו- y על-ידי לחיצה על התיבה, המצוינת עם T קרוב לכל ציר, בחר התאמה אישית של פונקציית Access ושנה עשורים נוספים של שלילה עם בסיסים ועשורים חיוביים לפי הצורך. בחר את התקליטורים +CD8+על-ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז שער CD3+CD8+כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם Tetr-gag על ציר ה- x ו- Pent-gag על ציר ה- y.
בחר את תאי ה- CD8 T הספציפיים לאנטיגן על-ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז השער הספציפי למחסום כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 על ציר ה- y. בחר את התאים בשלבי מחזור התא השונים על ידי לחיצה על Quad"במקטע כלי הגינג של חלון התרשים.
העתק את אסטרטגיית הגטינג שנוצרה במדגם אחד לקבוצה המתאימה כדי להחיל את השערים על כל הדגימות של הקבוצה. לאחר מכן העתק אסטרטגיות גטינג עבור קבוצות הטחול b ו- CBM, כמתואר בכתב היד של הטקסט. ודא שכל השערים מתאימים לכל מדגם של שלוש הקבוצות.
במידת הצורך, בטלו את סנכרון הקבוצה ושנו שערים כמתואר בכתב היד. הצג את תאי ה- BM של השער הרגוע בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 על ציר ה- y. הצג את התוצאות באופן חזותי על-ידי לחיצה על עורך הפריסה", במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה.
גרור כל שער של אסטרטגיית הג'יטינג בחלונית לדוגמה לעורך הפריסה והצב את התוויות בהתאם לרצף הג'יטינג. במידת הצורך, שנה את סוג התרשים על-ידי לחיצה כפולה על התוויית התוויה המתאימה בפריסה ובחירת הסוג המתאים בחלון הגדרת התרשים. לחץ על הקבוצה וחזר על ידי פונקציות ברצועת הכלים לפריסה כדי לדמיין את התוצאות שהושגו בתאי CD8 T ספציפיים אנטיגן מכל איבר ולהשוות דגימות שונות.
דמיינו תוצאות של תאי מח עצם המייצגים שליטה חיובית. דוגמה אופיינית לניתוח מחזור התא של תאי מח העצם מוצגת כאן. הפרוטוקול הניב מקדם נמוך של וריאציה של G0 ל- G1 ו- G2 לפסגות DNA M, המציין איכות מעולה של כתמי ה- DNA.
אסטרטגיית גטינג בת חמישה שלבים הופעלה כדי לזהות תאי CD8 ספציפיים לאנטיגן. שני multimers שימשו כדי לשפר את הרגישות של זיהוי תאי CD8 T ספציפיים למחסום בעכברים מחוסנים מבלי להגדיל את הרקע הכתים בעכברים לא מטופלים. תאי CD8 T ספציפיים למחסום הניקוז ובטחול מכילים שיעור גבוה של תאים בשלבי S-G2/M ביום השלישי לאחר הדחיפה.
יתר על כן, תאי CD8 T ספציפיים למחסום בשלבי S-G2/M היו בעלי FSC-A ו- SSC-A גבוהים כאשר הם היו על גבי תאי ה- CD8 T הכוללים מאותו איבר. היסטוגרמות היסטות הראו כי ביטוי CD62L על ידי תאי CD8 T ספציפיים למחסום היה נמוך, כצפוי עבור תאי T מופעלים, למעט כמה תאים ב- G0 בבלוטות הלימפה. שיטה זו מיועדת לתאי T כדי להשיג איכות מצוינת של כתמי DNA יחד עם הממברנה והכתמת Ki67.
ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה הוא נקודת מפתח. הקפד להשתמש בבקרה מתאימה למיקום השער. בשיטה זו גילינו תאי T בשלבי S-G2/M של מחזור התאים בעכבר ובדם ההיקפי האנושי.
טכניקה זו הייתה שימושית במחקרים ניטור אימונו בסוכרת מסוג 1, מונונוקלאוזיס זיהומיות, ו- COVID-19.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה של ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) לניתוח של תאי T מסוג CD8 ספציפיים לאנטיגן המתרחבים באופן קלונאלי בטחול ובקשרי הלימפה של עכברים מחוסנים. הטכניקה מאפשרת זיהוי של תגובות תאי T ללא השפעות מבלבלות של טיפול תרופתי in vivo או העברת תאים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ציטומטריית זרימה
- ביולוגיה של תאי T
רקע
- התרחבות קלונלית היא קריטית לתגובות של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- מחזור התא של תאי T המגיבים לא היה נחקר מספיק בשל אתגרים טכניים.
- הבנת הדינמיקה של תאי T חיונית להשגת תובנות לגבי תגובות חיסוניות.
- מחקר זה נותן מענה לצורך בשיטה לניתוח תגובות של תאי T בזמן אמת.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לניתוח תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן in vivo.
- אספקת תובנות לגבי proliferציה של תאי T במהלך תגובות חיסוניות.
- סיוע בחקר דינמיקת תאי T בהקשרים אימונולוגיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת בופר שטיפה וחתירה (permeabilization wash buffer) טרי לצביעת תאים.
- שימוש בנוגדן מונוקלונלי Ki67 FITC לזיהוי תאי T במצב התחלקות.
- ניתוח באמצעות ציטומטריה זורמת להערכת אוכלוסיות תאי T ומצבי ההפעלה שלהן.
- אסטרטגיות gating לבידוד תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן מתוך אוכלוסיות מעורבות.
תוצאות עיקריות
- השיטה מזהה בהצלחה תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן המעורבים בתגובות פעילות.
- ניתן למדוד במדויק את השכפול של תאי CD8 T ללא משתנים מתערבים.
- הטכניקה חושפת תובנות לגבי הדינמיקה של תאי T במהלך חיסון והדבקה.
- התוצאות מדגימות את התועלת של שיטה זו בחקר מחלות אוטואימוניות ואימונותרפיה לסרטן.
מסקנות
- השיטה הפרווומטרית שפותחה יעילה לניתוח תגובות של תאי T.
- גישה זו משפרת את ההבנה של דינמיקה חיסונית בהקשרים שונים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את התנהגותם של תאי T במצב בריאות ובמחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של התרבות תאי T מסוג CD8 ספציפיים לאנטיגן in vivo, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בניטור אימונולוגי לפיתוח חיסונים ואימונותרפיה. על ידי הבחנה בין שלבי G0, G1 ו-S-G2/M ללא הסתמכות על אנלוגים של נוקלאוטידים או דילול צבע, היא מספקת תמונת מצב מכניסטית של דינמיקת ההתרחבות הקלונאלית. דבר זה תומך בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים על ידי קישור מעורבות האנטיגן למצבים פרוליפרטיביים תפקודיים במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות על ידי קורלציה בין ספציפיות לאנטיגן לבין התקדמות מחזור התא בתאי T מגיבים.
- ערך תפעולי: מספק קריאת ציטומטריה זרימתית הניתנת לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרה, ללא המגבלות של BrdU או CFSE.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות הפרופורציה של תאי T ספציפיים לאנטיגן הנמצאים בשלב המיטוזה לעומת אלו הנמצאים בשלבי G1 או G0.
סריקה ופיתוח מערך בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטים כמותיים וסטנדרטיים (DNA-A מול Ki67) המתאימים לסריקה רחבת היקף (high-throughput screening) של מועמדים לוואקצינים או למודולטורים חיסוניים.
- שחזוריות: משתמשת ב-Hoechst 33342 להבחנה ברזולוציה גבוהה של שיאי DNA, ובכך מבטיחה הפרדה עקבית בין שלבי G0/G1 ל-G2/M בין הדגימות.
- יכולת הרחבה: תואמת לניתוח של איברים מרובים (טחול, קשרי לימפה, מחול השריד) וניתנת להתאמה למינים פרה-קליניים לצורך השוואה בין מחקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ישים למחקרי יעילות של חיסונים, כפי שהודגם בעכברים שחוסנו באמצעות וקטור HIV-gag, אשר הראו העשרה של S-G2/M בתאי T CD8 ספציפיים לאנטיגן.
- רציפות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי אספקת מדידה בעלת רזולוציה קינטית של התרחבות תאי T, המנבאת את עוצמת התגובה החיסונית.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר קביעת קריטריונים של go/no-go בהתבסס על קינטיקה פרוליפרטיבית של קלוני-אנטיגן ספציפיים, ובכך מפחית את ההסתמכות על סמנים פנוטיפיים של נקודת סיום בלבד.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קלמיני, ומאפשרת הערכה מוקדמת של יכולת השכפול של תאי T לאחר חיסון, תוך מתן מידע לאופטימיזציה של המולקולות המובילות באמצעות פרופיל חיסוני תפקודי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קישור זיהוי אנטיגן (באמצעות MHC-multimer) למצב מחזור התא, ובכך מבהיר האם השפעתו מובילה לשגשוג (proliferation) או לאנרגיה (anergy).
- סריקה: מספק נתונים כמותיים של התפלגות מחזור התא המוכנים לבדיקה, לצורך השוואת פלטפורמות של חיסונים או השפעות של עזרים (adjuvants) על התרחבות תאי T.
- אנליטיקה: מייצר תוצאות רב-פרמטריות (תכולת DNA, Ki67, scatter, סגוליות לאנטיגן) המאפשרות השוואה סטטיסטית של מדדי שגשוג בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי זיהוי תתי-אוכלוסיות של תאי T מופעלים הנמצאים במחזור התא, אשר נמצאים במתאם עם חסינות מגנה במודלים של זיהום וסרטן.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לניטור אימונולוגי לשימוש חוזר עבור מחקרים אורכיים בקווי פיתוח של מחלות אוטואימוניות, מחלות זיהומיות ואימונו-אונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי פתרון ההטרוגניות הפרוליפרטיבית בתוך אוכלוסיות של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה באמצעות אסטרטגיית gating קבועה וצביעת DNA מבוססת Hoechst, ובכך ממזער שונות בין בדיקות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי התסייעות בהסרת סיכונים מוקדמת של מועמדים לאימונומודולציה, בהתבסס על קינטיקה פונקציונלית של תאי T.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק מידע לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים, באמצעות כימות הפרקציה הפרוליפרטיבית של תאי T ספציפיים לאנטיגן כסמן ביולוגי לאיכות התגובה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בציטומטריה זרימה רב-צבעית, כולל בקרות פיצוי (compensation) עבור אותות של FITC-Ki67 ו-Hoechst.
- נדרשת גישה לציטומטר זרימה המסוגל לבצע עירור UV לצורך גילוי Hoechst 33342, וכן סטים של מסננים מתאימים.
- נדרשים פרוטוקולי חדירה (permeabilization) ושטיפה סטנדרטיים כדי לשמור על שלמות האפיטופים של Ki67, מולטימרים וסמני שטח.
- כולל אופטימיזציה של ריכוז ה-Hoechst (2 µg/mL) וזמן הדגרה כדי למנוע ציטוטוקסיות תוך השגת רזולוציית שיא DNA אופטימלית.
- תלוי בהיררכיית gating נכונה, המתחילה בהדרה של סינגלטים ותאים חיים, כדי להבטיח זיהוי מדויק של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
