הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה היא טכנולוגיית הדמיה כימית המאפשרת גילוי מהיר וכמותי של שומנים ומאפשרת מעקב אחר שומנים בבעלי חיים באופן נטול תוויות. היתרון החשוב ביותר של מיקרוסקופיה SRS על פני טכניקות מסורתיות לגילוי שומנים הוא שזה תווית חינם ולכן, הוא לא בר קיימא כדי הלבנת צילום כמו פלואורסצנטיות אחרים וכתמים עניינים. השימוש במיקרוסקופיה SRS בשילוב עם הכלים הגנטיים והביוכימיים הזמינים עבור אורגניזמים מודל, במיוחד Caenorhabditis elegans מספק מסגרת רבת עוצמה לחקר הרגולטורים הרגילים של ביולוגיה של השומנים ומטבוליזם.

כדי להזין קרני לייזר לתוך מיקרוסקופ SRS, הראשון, להגדיר את periscope כדי להרים את הקרן מיציאת מקור אור picosecond ליציאת כניסת לייזר אינפרא אדום בסורק של המיקרוסקופ ולפתוח את תוכנת בקרת הלייזר כדי להפעיל את הלייזרים. הורידו את כוח הלייזר של המשאבה ל-50 מילי-וואט והגדירו את אות המשאבה ל-750 ננומטר. השתמש מרחיב קרן כדי להתאים את קוטר הקרן כדי להתאים את הצמצם האחורי של מטרות מיקרוסקופ.

השתמש בשתי מראות ממסר, M1 ו- M2, כדי להנחות את קרן הלייזר ל periscope ולהגדיר את הנהוני periscope במרכז טווח הכוונון. בחר את המיקום והזווית הראשוניים של כל מראה כך שקרן הלייזר תפגע בקירוב במרכז המראה כדי לשגר את הקרן למיקרוסקופ ולהשתמש ביציאה ריקה על הצריח האובייקטיבי של המיקרוסקופ כדי לבצע את יישור הקורס. הנח את גשוש מד הכוח ביציאה האובייקטיבית כדי למדוד את העוצמה של האור המשודר ולהגדיר את הסורק של המיקרוסקופ בזום הגבוה ביותר, 50X.

למדוד את העוצמה של האור המועבר עם נקודת קרן לייזר ממוקדת לייעל את הידיות של מראות M1 ו M2 איטרטיבית כדי להשיג את כוח לייזר המשודר הגבוה ביותר. השתמש בכלי היישור כדי לבצע את היישור העדין של האור המשודר כדי לוודא שהנורית עוברת במרכז המטרה ולמקם את מכסה היישור של יעד הפלואורסצנטיות על המושב האובייקטיבי הריק. כוונן את הידיות של מראה ההיגוי הראשונה, M1, כדי למרכז את נקודת קרן הלייזר ולהציג את צינור ההרחבה עם מכסה היישור בקצה השני למושב אובייקטיבי ריק לניטור נקודת קרן הלייזר.

לאחר מכן, כוונן את הידיות של מראת ההיגוי השנייה, M2, כדי למרכז שוב את נקודת קרן הלייזר בקצה השני של צינור ההרחבה. כדי להגדיר את מודול הזיהוי SRS, מקם קוביית מפצל קרן לאחר המסוף כדי לכוון את הלייזר המשודר למודול דיודה צילום. כדי להגדיר את חיבור האלקטרוניקה, השתמש אפנן אלקטרו אופטי מובנה ב 20 מגה הרץ בתוך לייזר picosecond כוונון מסוגל לווסת את עוצמת קרן סטוקס ולהאכיל את אות הפלט של דיודה צילום לתוך מגבר נעילה ב עבור demodulation של אובדן ראמאן מגורה.

לאחר מכן, הזן את פלט מגבר הנעילה לתיבה האנלוגית של המיקרוסקופ כדי להמיר את האות האנלוגי החשמלי לאות דיגיטלי. כדי למטב את תנאי ההדמיה, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חומצה אולאית לתא שקופיות זעיר של מיקרוסקופ וכסו את הדגימה בתעודת כיסוי. מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומשתמשים בקצה הכרית כדי לאתר ולהתמקד בטיפה.

כוונן את המדחף לתאורה של קולר והשתמש בכרטיס חיישן אינפרא-אדום ובמציג אינפרא-אדום כדי לבדוק אם נתיב קרן המשאבה עדיין נכון. ודא כי שלב ההשהיה מוגדר לאפס femtoseconds ולהגדיר את אורך הגל קרן המשאבה ל 795.8 ננומטר. כוון את העוצמה של קרן המשאבה ל-50 מילי-וואט והכוון את קרן סטוק ל-100 מילי-וואט.

פתח את התריס עבור שתי הקורות, כמו גם את התריס הראשי של הלייזר. סרוק את הדגימה ובדוק את התמונה על מסך המחשב. שנה את מצב התצוגה לשפל גבוה והתאם את הטווח כך יראה רוויה של כ- 50%.

בדקו אם הרוויה ממורכזת בתמונה, תוך התאמה קפדנית של מראות ההיגוי בתוך מערכת הלייזר המכווננת לפיקוסקונד לחפיפה ממוטבת של המשאבה והסטוקס כדי למקסם את עוצמת התמונה ולמרכז את עוצמת השיא לפי הצורך. לפני כל הפעלת הדמיה, הוסף 100 מיקרוליטרים של 2%agarose חמים לשקופית זכוכית נקייה הממוקמת בין שקופיות תמיכה עם שתי שכבות של קלטת מעבדה והנח במהירות שקופית שנייה מעל השקופית הראשונה. לחוץ בעדינות כדי ליצור כרית agarose דק, אפילו, ולאפשר agarose להתקרר.

כדי להרכיב את התולעים להדמיה, הניחו טיפת 4-5 מיקרוליטר של חומר הרדמה לכל 10 עד 20 תולעים על תלוש כיסוי והשתמשו במיקרוסקופ ניתוק כדי לבחור את התולעים לצילום, תוך הנחת התולעים על טיפת ההרדמה בזמן איסוףן. כאשר כל התולעים נאספו, לכסות את התולעים עם שקופית הזכוכית עם כרית agarose. להדמיה, התקן את דגימת התולעת עם החלקת הכיסוי מול העדשה האובייקטיבית והפנה את מקור אור השדה הבהיר אל העינית כדי לאתר את התולעים.

להביא את התולעים לפוקוס ולהתאים את מיקום המקדם בהתאם. כוונן את כוחות הלייזר על-ידי הגדרת עוצמת הלייזר של המשאבה ל- 200 מילי-וואט ואת עוצמת האי-ר-וואט ל- 400 מילי-וואט. הגדר את מגבר הנעילה להורדה בדרגה של אות ה-SRS של התולעת.

התחל לסרוק את התולעת הראשונה בקצב סריקה מהיר, תוך התאמת המיקוד העדין כדי למצוא את תחום העניין. לאחר אופטימיזציה של האות, עבור לקצב סריקה איטי יותר ולרזולוציית פיקסלים גבוהה יותר כדי להשיג את תמונת ה- SRS ולשמור את התמונה בתבנית המאפשרת רזולוציה גבוהה. לאחר שכל הדגימות תצויד, הנח את מקור הלייזר במצב המתנה וכבה את כל הציוד המשויך.

כדי לנתח את התמונות, פתח את הקבצים ב- ImageJ ובחר נתח והגדר מידות כדי לבחור את המאפיינים שיש לנתח. השתמש בכלי בחירת המצולע כדי לתאר את האזור של מעי התולעת לכימות ולחץ על לנתח ולמדוד שוב. המידות יופיעו בחלון התוצאות.

לאחר שכל התולעים תוארו, העתק והדבק את המידות עבור כל אחת מהתולעים בגנוטיפ נתון לתוך גיליון אלקטרוני. עבור ערך מדידת הרקע, בחר אזור בקרבת התולעת שאין לו אות SRS והפחת את ערך האפור הממוצע ברקע מהמדידה עבור כל תולעת בודדת כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן של הרקע חיסור ערכי אפור ממוצעים מכל התולעים בקבוצת גנוטיפ או קבוצת בדיקה נתונה. לאחר מכן ניתן לנרמל ערכים אלה לממוצע של קבוצת הביקורת.

בניתוח מייצג זה, רמות השומנים במעיים בתולעים מסוג בר מסונכרנות לגיל ומוטנטים daf-2 חסר קולטן האינסולין היו מכמתים במהלך הבגרות. כצפוי, ירידה ברמות השומנים נצפתה בתולעים מסוג בר, החל מהיום הראשון וממשיכה עד היום התשיעי לבגרות. עם זאת, רמות השומנים במוטנטים daf-2 עולות עד גיל חמישה ימים, ובשלב זה הן נשארות קבועות בערך פי 2.5 עד 3 גבוה יותר מסוג הפרא.

חוסר פעילות Daf-16 מדכא את העלייה ברמות השומנים של מוטציות daf-2. ביטוי של daf-16a a או daf-16b isoform ב daf-2, מוטציות כפולות daf-16 אינו משחזר את רמות השומנים. הביטוי של isoform daf-16d/f/h, עם זאת, מספיק כדי לשחזר את רמות השומנים ב daf-2, daf-16 מוטציות כפולות לרמות שנצפו מוטציות יחיד daf-2.

תוצאות אלו מצביעות על כך שהאיזופורם daf-16d/f/h מווסת באופן ספציפי את חילוף החומרים של השומנים בתולעים מוטנטיות daf-2. חשוב להשתמש באותו כוח לייזר עבור משאבה וקרני סטוקס לאורך כל מפגש ההדמיה ולכלול קבוצת ביקורת בכל שש וארבעה כימות עקבי. בנוסף לכימות אחסון השומנים, מיקרוסקופיה SRS ניתן לשלב עם תגי bioorthogonal, כגון deuterium, ומיושם כדי לדמיין את הדינמיקה של שילוב השומנים, סינתזה והשפלה.

מיקרוסקופיה SRS מאפשר מולטיפלקסים והוא יכול להיות מיושם כדי תמונה ביומולקולות מרובות בתאים תת תאיים שונים. מה שנקרא מיקרוסקופ SRS היפרספקטרלי יש עתיד גדול לחקור את הדינמיקה המטבולית.