Name: הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: חקור פלישת תאים סרטן בזמן אמת באמצעות מכשיר ספרואידים תלת-ממדי. השיטה מאפשרת הדמיית פלואורסצנטיות לאורך זמן ומניתוח התנהגות תאית בסרטן שד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי טמפל ביו-הנדסה על דיונים חשובים. אנו מודים לדיוויד אמברוז בליבת הזרימה (בית הספר לרפואה של לואיס כץ) על עזרתו במיון תאים ולטוני בוהם ממרכז הרעיונות (המכללה להנדסה, אוניברסיטת טמפל) על העזרה בהדפסה בתלת מימד. אנו מודים גם למשאבי המימון שלנו: חוקר מחקר האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן גרנט 134415-RSG-20-034-01-CSM, לכבוש סרטן עכשיו / פרס החוקר הצעיר, המכונים הלאומיים לבריאות, R00 CA172360 ו R01 CA230777, כל BG.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Noone, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNoone%2C+A+%22SEER+Cancer+statistics+review+1975-2015%2C+based+on+November+2017+SEER+data+submission%22">SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission</a>. , (2019).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiment. , e2720(2011).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+cell+spheroid+assay+to+assess+invasion+in+a+3D+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).</li>
<li>Tönisen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP4+receptor+promotes+invadopodia+and+invasion+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer.</a> European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).</li>
<li>Bayarmagnai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia-mediated+ECM+degradation+is+enhanced+in+the+G1+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle.</a> Journal of Cell Sciences. 132, 227116(2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Boutin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+imaging+and+nuclear+segmentation+analysis+protocol+for+cleared+3D+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models.</a> Science Reports. 8, 11135(2018).</li>
<li>Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+spheroid+formation+recorded+with+light+sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).</li>
<li>Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarcello%2C+M+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and%22">Advances in Experimental Medicine and</a>. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מרווח ההדפסה בתלת-ממד תוכנן ליצור יריעות בעובי 1 מ"מ של PDMS שניתן להשתמש בהן כדי ליצור בקלות צורות שונות של PDMS, כנדרש על-ידי היישומים הניסיוניים. בשל הפשטות של הייצור שלה ואת החופש לשנות את העיצוב, שיטה זו של הליהוק PDMS נבחרה עבור העיצוב הראשוני של SID. אם נדרש נפח גבוה של מזהי אבטחה, ניתן לייעל את הייצור על-ידי יצירת תבנית המודפסת בתלת-ממד, שכבר מכילה דיסקי PDMS עם שלושה חורים במרווחים שווים, וצמצום התהליך לשלב אחד. זה יבטל את הצורך לנקב כל דיסק, יחד עם שלושת החורים הבאים, ולהפחית את זמן ההכנה הכולל.
<p class="j...

במהלך התקדמות הסרטן, תאים סרטניים יכולים לרכוש מוטיל פנוטיפ פולשני, המאפשר להם לברוח מסת הגידול לפלוש לתוך הרקמות שמסביב1. בסופו של דבר, תאים סרטניים פולשניים אלה יכולים להגיע ולגדול בתוך איברים משניים, תהליך הנקרא גרורות סרטן1. גרורות גורמות ליותר מ -90% ממקרי המוות הקשורים לסרטן2. אחת הסיבות לכך היא שבעוד שגידולים מקומיים ניתנים לניהול קליני, לא קיימות שיטות יעילות לחיסול תאים סרטניים פולשניים לאחר שהתרחשה התפשטות גרורתית. לכן, הופעתם של תאים סרטניים פולשניים והמעבר ממחלה מקומית למחלה פולשנית מהווים אתגר קליני גדול. קביעת האופן שבו תאים סרטניים ליזום ולקיים התנהגות פולשנית עלול להוביל להתפתחות של טיפולים חזקים הרומן.
מודל ספרואיד 3D הוא פלטפורמה אידיאלית לחקור את ההתנהגות המוטיב של תאים סרטניים תחת מבוקר, עדיין תנאים רלוונטייםמבחינה פיזיולוגית 3. ואכן, במהלך מבחנים אלה, ספירואידים של תאים סרטניים מוטבעים בתוך מטריצה חוץ תאית (ECM), למשל קולגן I, המחקה גידול פשוט יותר. לאחר מכן, ההדמיה משמשת כדי לדמיין את הפלישה של תאים סרטניים מהספרואיד לתוך מטריצת הקולגן. עם זאת, אתגרים מרובים מגבילים הליך זה.
האתגר הראשון מתרחש בשלב ההטבעה, שבו מטריצת הקולגן הנוזלי יכולה להתפשט על פני משטח הכלים, מה שגורם לספרואיד לגעת בתחתית המנה. כתוצאה מכך, תאים מהספרואיד מתפשטים על פני השטח הדו-ממדיים (דו-ממדיים), ושוברים את המורפולוגיה הכדורית התלת מימדית (3D). הגדלת נפח הקולגן היא פתרון יעיל אך יקר. כדי למנוע מהתאים להתפשט על פני השטח הדו-ממדיים, תוך שמירה על נפח מינימלי של קולגן, פיתחנו מכשיר הדמיה כדורי (SID) על ידי תוחם פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעובי 1 מ"מ, בעל 3 חורים, מוכנס לתבנית תחתונה מזכוכית.
האתגר השני של מבחני הכדוריד הוא תיוג של תאים סרטניים בספרואידים, המוגבל על ידי חדירה לקויה של נוגדנים וצבעים פלואורסצנטיים, השפעה הגדלה עם גודל הכדורואיד. בעוד שהפתרון האידיאלי לתיוג תאים הוא הקמת קווי תאים המבטאים ביציבות חלבונים פלואורסצנטיים, אפשרות זו מוגבלת בעיקר לקווי תאים מונצחים ומוגבלת על ידי הזמינות של כימרות חלבון פלואורסצנטיות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמי immunofluorescence של ספרואידים קבועים, כמו גם את השימוש היעיל של צבע ציטופלסמי לתייג תאים מיד לפני הטמעת הכדורואיד.
האתגר השלישי של מבחני הכדוריד הוא היעדר פקודות מאקרו פשוטות של פיג'י לכימות אוטומטי למחצה של פלישת תאים לאורך זמן. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה לניתוח אזור הכדורואיד לאורך זמן. אנו ממחישים את היתרונות של פרוטוקול זה באמצעות קווי התאים 4T1 ו- 67NR כדוגמאות.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>60-014-44</td><td></td></tr><tr><td>10X Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>SH30028.LS</td><td></td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368-9M</td><td></td></tr><tr><td>1X Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 48 בארות</td><td>Falcon</td><td>T1048</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי קורטקטין</td><td>Abcam</td><td>ab33333</td><td>1 עד 200 דילול</td></tr><tr><td>אנטי נוגדן E-cadherin</td><td>Invitrogen</td><td>13-1900</td><td>1 עד 100 דילול</td></tr><tr><td>תמיסת אטלוקולגן בקר I (Nutragen)</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>501050ML</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker צבע אדום CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים</td><td>פלקון</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>FisherBrand</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חד פעמי</td><td>סיכות</td><td></td><td>כוסות פלסטיק</td></tr><tr><td>פיפטה העברה חד פעמית</td><td>Thermo Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו-פרצופי</td><td>סקוטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>eBioscience</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht כתם גרעיני Thermo</td><td>Fischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fischer</td><td>S25371A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת MatTek (צלחת תחתית זכוכית)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>מתיל תאית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M6385-100G</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td><td></td>MilliQ</tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>צלחת</td><td>פטרי קורנינג</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>טיפים פיפט</td><td>פישרברנד</td><td>02-707</td><td></td></tr><tr><td>פיפטס</td><td>Gilson</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים,</td> קולגן זנב עכברוש ספציפי למשתמש <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים משניים, ספציפי</td><td></td><td></td><td></td>למשתמש</tr><tr><td>Slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1354W-72</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 סיליקון</td><td>דאו קורנינג</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>קלטת</td><td>סקוטש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריטון X100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>655204-100 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3d

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

הפלישה של תאים סרטניים מן הגידול העיקרי לתוך הרקמות הבריאות הסמוכות הוא צעד מוקדם גרורות. תאים סרטניים פולשניים מהווים אתגר קליני גדול כי אין שיטה יעילה לחיסול שלהם פעם ההפצה שלהם מתבצעת. הבנה טובה יותר של המנגנונים המסדירים פלישת תאים סרטניים עלולה להוביל להתפתחות טיפולים חדשניים וחזקים. בשל הדמיון הפיזיולוגי שלהם לגידולים, ספרואידים מוטבע קולגן אני כבר מנוצל בהרחבה על ידי חוקרים כדי ללמוד את המנגנונים החלים פלישת תאים סרטניים לתוך המטריצה חוץ תאית (ECM). עם זאת, מבחנה זו מוגבלת על ידי (1) חוסר שליטה על הטמעת ספרואידים לתוך ECM; (2) עלות גבוהה של קולגן I ומנות תחתונות זכוכית, (3) תיוג אימונופלואורסצנטי לא אמין, בשל חדירה לא יעילה של נוגדנים וצבעים פלואורסצנטיים ו-(4) עיבוד תמונה וזמן רב וכימות הנתונים. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול כדורי תלת מימדי (3D) כדי תמונה פלואורסצנטית שכותרתו תאים סרטניים מוטבע קולגן אני, או באמצעות קטעי וידאו לשגות בזמן או הדמיה אורך, ולנתח פלישת תאים סרטניים. ראשית, אנו מתארים את הייצור של מכשיר הדמיה ספרואידית (SID) כדי להטמיע ספירואידים באופן אמין ובנפח קולגן I מינימלי, מה שמפחית את עלות ההסמכה. לאחר מכן, אנו מתווים את השלבים לתיוג פלואורסצנטי חזק של ספרואידים חיים וקבועים. לבסוף, אנו מציעים מאקרו פיג'י קל לשימוש לעיבוד תמונה וכימות נתונים. בסך הכל, מתודולוגיה פשוטה זו מספקת פלטפורמה אמינה ובמחיר סביר כדי לפקח על פלישת תאים סרטן קולגן I. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי להתאים לצרכים של המשתמשים.

בשל תאימות ביולוגית שלה, PDMS נמצא בשימוש נרחב עבור microfabrication של ברים מוגבלים, בולים ותבניות, אשר מהפכה micropatterning והתקנים microfluidic. בשיטה המתוארת כאן, הוא משמש ליצירת מזהי SD, בארות להתאמה אישית כי לייעל הטמעה ספרואידית הליך הדמיה. איור 1 מדגים את הרכיבים העיקריים המשמשים לייצור מזהי ה- SID. כדי להטיל את תבנית ה-PDMS, מרווח בעובי 1 מ"מ מודפס בתלת-ממד (איור 1A,B),הממוקם בין שתי לוחות הזכוכית, אטום בקליפים גדולים. מזיגה ואפייה PDM...

מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את המנגנונים המסדירים את הפלישה של תאים סרטניים לתוך המטריצה חוץ תאית בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במכשיר הדמיה ספרואידי פשוט, מה שהופך את הפלישה הספרואידית לקלות יותר להקים ומשפר את יעילותה ועלותה. בעוד אנו מדגימים באמצעות מבחני הפלישה ספרואידית מודל קרצינומה mammary, זה assay הוא מודל מצוין לפלישה של כל גידול מוצק לתוך הרקמה הבריאה שמסביב.לאחר הדפסה תלת-ממדית של המרווח, משקלל יחס של 10:1 של פולימר בסיס לקישור צולב בספינת פלסטיק והשתמש בפיפט חד פעמי כדי לערבב ביסודיות את פתרון ה- PDMS שנוצר בסל. מניחים את ה לתוך תא ואקום במהירות לשחרר את לחץ ואקום כדי להסיר את כל האוויר לכוד על פני השטח של התערובת כדי לפזר את בועות האוויר הנותרות. דגירה מרווח מודפס 3D ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להגדיל את הגמישות שלה לנקות שתי צלחות זכוכית עם 100% איזופרופנול.מניחים את המרווח כך שהוא סומק בין שתי הצלחות שנוקו ומניחים שני קליפי קלסר גדולים בקצה התחתון ואחד על הפינה העליונה כדי לאטום את התבנית על הקצוות החיצוניים של הצלחות. בדוק את החלק העליון של התבנית כדי לוודא כי המרווח הוא סומק עם לוחות הזכוכית ולהשתמש פיפטה חד פעמית עם כ 2 ס"מ לחתוך מהקצה לאט אבל ברציפות להוסיף את תערובת PDMS לפינה השמאלית העליונה של התבנית. כאשר התבנית כולה כבר מלא, למקם את התבנית לתוך תא ואקום כדי להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו, לפני ריפוי PDMS במשך שעה אחת ב 100 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, מניחים את התבנית בטמפרטורת החדר. כאשר הוא קריר למגע, להסיר את קליפי קלסר ולוחות זכוכית מן מרווח המכיל PDMS נרפא ולהשתמש סכין גילוח לחתוך דרך החותם שנוצר על כל ארבעת הצדדים של התבנית בין מרווח צלחת זכוכית. לפרק את התבנית כדי לחשוף את גיליון PDMS במרווח ולהשתמש פינצטה לקלף בזהירות את גיליון PDMS את המרווח.מניחים את הסדין על מחצלת חיתוך ומשתמשים בניקוב ביופסיה כדי להכניס לדיסק דיסק PDMS בקוטר 17.5 מ"מ, ולאחר מכן מכניסים לדיסק שלושה חורים בהפצה שווה של 5.5 מ"מ. השתמש בסרט הדבקה כדי להסיר את כל חלקיקי האבק מכל הכנס ולתקוע את מוסיף ניקה על פיסת סרט דו צדדי. עוטפים את הסרט סביב המכסה של צלחת פטרי 10 ס"מ ומניחים את המכסה לתוך מכונת פלזמה יחד עם פתוח 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות.הפעל את מוסיף וזכוכית עם דקה אחת של טיפול פלזמה ב 300 מיליטורים ולהשתמש פינצטה לחבר במהירות את הצד המטופל של כל הכנס לחלק הזכוכית של צלחת אחת זכוכית תחתונה מטופלים לכל הכנס. כאשר כל התוספות הוחלו, השתמש באצבע ובאגודל המצביע כדי להפעיל לחץ שווה על כל הכנס תוך סיבוב המנה כדי לחבר את התוספות בצורה מאובטחת לכלים. כאשר כל התוספות אובטחו, דגירה את התקני הדמיה ספירואיד וכתוצאה מכך במשך 20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, לפני ביצוע סיבוב שני של טיפול פלזמה כפי שהוכח.לאחר הטיפול השני, להוסיף 35 microliters של פתרון ציפוי מוכן טרי לכל חור הכנס. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, יש להסיר את תמיסת הציפוי ולשטוף את המכשיר שלוש פעמים במים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 35 מיקרוליטרים של פתרון קישור צולב לכל חור עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את המכשיר שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפי שהוכח, לפני מילוי כל מכשיר עם 70% אתנול עבור דגירה של 30 דקות תחת אור UV. בסוף העיקור, לשטוף את המכשירים שלוש פעמים עם מים מזוקקים ולהוסיף 2.5 מיליליטר של פתרון אחסון לכל מכשיר. כדי להטמיע את הכדורואידים בקולגן, לשטוף את המכשירים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של PBS לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, אפשרו למכשירים להתייבש לחלוטין, לפני הוספת ספרואיד אחד ב-30 מיקרוליטרים של פתרון אחד שהוכן זה עתה לחור אחד של הכנס והתחלת טיימר. לאחר אישור נוכחותו של הכדורואיד בחור, מוסיפים ספרואידים לשני החורים האחרים כפי שהוכח. השתמש קצה פיפטה 10 microliter כדי להחליק את כל spheroids הממוקמים קרוב לגבול PDMS, או להפריד את spheroids אם ספירואידים מרובים מחלקים ולעצור את שעון העצר.כדי למרכז אנכית את הכדוריד בשכבת הקולגן, לאחר הזריעה, הפוך את המכשיר הפוך והדגיר את המכשיר ב-37 מעלות עד שהקולגן יתרבה, היפוך כיוון המכשיר כל שתי דקות למשך 30 דקות בסך הכל, ולאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום לכל מכשיר ורכוש תמונה של הכדורואידים בנקודת זמן של אפס שעות. שימוש במכשיר תמונה ספרואידי מקל על הטבעה יעילה והקלטת זמן לשגות של פלישת תאים סרטניים בתוך הקולגן או באמצעות הדמיה אורך. בעוד ספרואיד זה היה בתמונה לאורך שישה ימים הדורשים ביטוי יציב של חלבונים ציטופלזמיים ו / או גרעיניים פלואורסצנטיים, הדמיה אורך דומה יכול להתבצע על פני פרק זמן קצר יותר באמצעות תיוג צבע.ניתן גם לתקן את הכדורים ולקבע אימונולה. לדוגמה, ספירואידים אלה היו immunolabeled עבור אפיתל-cadherin, קורטקטין, ו F-actin. בתמונות אלה, ניתן להבחין באיור שלב אחר שלב של הליך עיבוד התמונה באמצעות המאקרו של פיג'י כדי למדוד את אזור הכדורואיד לאורך זמן.הקפידו לחלק ספרואיד יחיד לכל חור של מכשיר ההדמיה הכדורואידי ולמקם את הכדורואיד במרכז החור בשני הכיוונים XY ו- Z. ניתן לשנות בקלות את עיצוב המכשיר על-ידי שינוי הגודל והסידור של החורים, התוספות והמנות התחתונות מזכוכית כך שיתאימו לתפוקה כדורית גבוהה יותר.

time-resolved-fluorescence-imaging-analysis-cancer-cell-invasion-3d

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה ​​תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר...

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

מיקרוסביבה הגידול הוא חלק חיוני של גידול בסרטן ופלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, צריך מטריצה אנושית רלוונטית ביולוגית. פרוטוקול זה מציג שיפור לגבי שיטת החדירה החיצונית התלת-ממדית של שלושה מימדים על-ידי החלת מטריצה אנושית המבוססת על מייומה. הפרוטוקול גם מציג ניתוח הפלישה לתא מבוסס-מחשב.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

חקור פלישת תאים סרטן בזמן אמת באמצעות מכשיר ספרואידים תלת-ממדי. השיטה מאפשרת הדמיית פלואורסצנטיות לאורך זמן ומניתוח התנהגות תאית בסרטן שד.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

גלה סרטונים נוספים