הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את המנגנונים המסדירים את הפלישה של תאים סרטניים לתוך המטריצה חוץ תאית בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במכשיר הדמיה ספרואידי פשוט, מה שהופך את הפלישה הספרואידית לקלות יותר להקים ומשפר את יעילותה ועלותה. בעוד אנו מדגימים באמצעות מבחני הפלישה ספרואידית מודל קרצינומה mammary, זה assay הוא מודל מצוין לפלישה של כל גידול מוצק לתוך הרקמה הבריאה שמסביב.

לאחר הדפסה תלת-ממדית של המרווח, משקלל יחס של 10:1 של פולימר בסיס לקישור צולב בספינת פלסטיק והשתמש בפיפט חד פעמי כדי לערבב ביסודיות את פתרון ה- PDMS שנוצר בסל. מניחים את ה לתוך תא ואקום במהירות לשחרר את לחץ ואקום כדי להסיר את כל האוויר לכוד על פני השטח של התערובת כדי לפזר את בועות האוויר הנותרות. דגירה מרווח מודפס 3D ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להגדיל את הגמישות שלה לנקות שתי צלחות זכוכית עם 100% איזופרופנול.

מניחים את המרווח כך שהוא סומק בין שתי הצלחות שנוקו ומניחים שני קליפי קלסר גדולים בקצה התחתון ואחד על הפינה העליונה כדי לאטום את התבנית על הקצוות החיצוניים של הצלחות. בדוק את החלק העליון של התבנית כדי לוודא כי המרווח הוא סומק עם לוחות הזכוכית ולהשתמש פיפטה חד פעמית עם כ 2 ס"מ לחתוך מהקצה לאט אבל ברציפות להוסיף את תערובת PDMS לפינה השמאלית העליונה של התבנית. כאשר התבנית כולה כבר מלא, למקם את התבנית לתוך תא ואקום כדי להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו, לפני ריפוי PDMS במשך שעה אחת ב 100 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, מניחים את התבנית בטמפרטורת החדר. כאשר הוא קריר למגע, להסיר את קליפי קלסר ולוחות זכוכית מן מרווח המכיל PDMS נרפא ולהשתמש סכין גילוח לחתוך דרך החותם שנוצר על כל ארבעת הצדדים של התבנית בין מרווח צלחת זכוכית. לפרק את התבנית כדי לחשוף את גיליון PDMS במרווח ולהשתמש פינצטה לקלף בזהירות את גיליון PDMS את המרווח.

מניחים את הסדין על מחצלת חיתוך ומשתמשים בניקוב ביופסיה כדי להכניס לדיסק דיסק PDMS בקוטר 17.5 מ"מ, ולאחר מכן מכניסים לדיסק שלושה חורים בהפצה שווה של 5.5 מ"מ. השתמש בסרט הדבקה כדי להסיר את כל חלקיקי האבק מכל הכנס ולתקוע את מוסיף ניקה על פיסת סרט דו צדדי. עוטפים את הסרט סביב המכסה של צלחת פטרי 10 ס"מ ומניחים את המכסה לתוך מכונת פלזמה יחד עם פתוח 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות.

הפעל את מוסיף וזכוכית עם דקה אחת של טיפול פלזמה ב 300 מיליטורים ולהשתמש פינצטה לחבר במהירות את הצד המטופל של כל הכנס לחלק הזכוכית של צלחת אחת זכוכית תחתונה מטופלים לכל הכנס. כאשר כל התוספות הוחלו, השתמש באצבע ובאגודל המצביע כדי להפעיל לחץ שווה על כל הכנס תוך סיבוב המנה כדי לחבר את התוספות בצורה מאובטחת לכלים. כאשר כל התוספות אובטחו, דגירה את התקני הדמיה ספירואיד וכתוצאה מכך במשך 20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, לפני ביצוע סיבוב שני של טיפול פלזמה כפי שהוכח.

לאחר הטיפול השני, להוסיף 35 microliters של פתרון ציפוי מוכן טרי לכל חור הכנס. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, יש להסיר את תמיסת הציפוי ולשטוף את המכשיר שלוש פעמים במים מזוקקים. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 35 מיקרוליטרים של פתרון קישור צולב לכל חור עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף את המכשיר שלוש פעמים עם מים מזוקקים כפי שהוכח, לפני מילוי כל מכשיר עם 70% אתנול עבור דגירה של 30 דקות תחת אור UV. בסוף העיקור, לשטוף את המכשירים שלוש פעמים עם מים מזוקקים ולהוסיף 2.5 מיליליטר של פתרון אחסון לכל מכשיר. כדי להטמיע את הכדורואידים בקולגן, לשטוף את המכשירים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של PBS לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, אפשרו למכשירים להתייבש לחלוטין, לפני הוספת ספרואיד אחד ב-30 מיקרוליטרים של פתרון אחד שהוכן זה עתה לחור אחד של הכנס והתחלת טיימר. לאחר אישור נוכחותו של הכדורואיד בחור, מוסיפים ספרואידים לשני החורים האחרים כפי שהוכח. השתמש קצה פיפטה 10 microliter כדי להחליק את כל spheroids הממוקמים קרוב לגבול PDMS, או להפריד את spheroids אם ספירואידים מרובים מחלקים ולעצור את שעון העצר.

כדי למרכז אנכית את הכדוריד בשכבת הקולגן, לאחר הזריעה, הפוך את המכשיר הפוך והדגיר את המכשיר ב-37 מעלות עד שהקולגן יתרבה, היפוך כיוון המכשיר כל שתי דקות למשך 30 דקות בסך הכל, ולאחר מכן הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום לכל מכשיר ורכוש תמונה של הכדורואידים בנקודת זמן של אפס שעות. שימוש במכשיר תמונה ספרואידי מקל על הטבעה יעילה והקלטת זמן לשגות של פלישת תאים סרטניים בתוך הקולגן או באמצעות הדמיה אורך. בעוד ספרואיד זה היה בתמונה לאורך שישה ימים הדורשים ביטוי יציב של חלבונים ציטופלזמיים ו / או גרעיניים פלואורסצנטיים, הדמיה אורך דומה יכול להתבצע על פני פרק זמן קצר יותר באמצעות תיוג צבע.

ניתן גם לתקן את הכדורים ולקבע אימונולה. לדוגמה, ספירואידים אלה היו immunolabeled עבור אפיתל-cadherin, קורטקטין, ו F-actin. בתמונות אלה, ניתן להבחין באיור שלב אחר שלב של הליך עיבוד התמונה באמצעות המאקרו של פיג'י כדי למדוד את אזור הכדורואיד לאורך זמן.

הקפידו לחלק ספרואיד יחיד לכל חור של מכשיר ההדמיה הכדורואידי ולמקם את הכדורואיד במרכז החור בשני הכיוונים XY ו- Z. ניתן לשנות בקלות את עיצוב המכשיר על-ידי שינוי הגודל והסידור של החורים, התוספות והמנות התחתונות מזכוכית כך שיתאימו לתפוקה כדורית גבוהה יותר.