נויטרונים קריסטלוגרפיה איסוף ועיבוד נתונים למידול אטומי מימן במבני חלבון
December 1st, 2020
קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים היא טכניקה מבנית המאפשרת לוקליזציה של אטומי מימן, ובכך מספקת פרטים מכניים חשובים של תפקוד החלבון. אנו מציגים כאן את זרימת העבודה להרכבה של גבישי חלבון, איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים, עידון מבנה וניתוח של מפות צפיפות אורך הפיזור של הנויטרונים.
קריסטלוגרפיה של נויטרונים היא טכניקה מבנית לקביעת מיקומי אטומי מימן במקרומולקולות ביולוגיות. מבני נויטרונים חושפים מצבי פרוטונציה וכיווני מולקולות מים כדי להבהיר מנגנוני תגובה ואינטראקציות קשירה. בניגוד לעקיפה של קרני רנטגן, לעקיפה של נויטרונים יש יתרון בהיותה טכניקה לא הרסנית.
ניתן לחקור חלבונים עם קבוצות רגישות לאור או חיישני מתכת מבלי לסבול מנזקי קרינה. כדי לבצע קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים, גבישי חלבון שבירים גדולים מותקנים בנימי קוורץ לאיסוף נתונים בטמפרטורת החדר. הרכבה נימית קריסטל אינה מבוצעת באופן שגרתי, מה שהופך את ההדגמה של טכניקה זו למלמדת.
לקצירת גבישים, פתח את קופסת הסנדוויץ' האטומה המכילה את גבישי החלבון בצלחת זכוכית סיליקון בנפח גדול של תשע בארות והשתמש במיקרופיפטה כדי להעביר 10 עד 20 מיקרוליטר מתמיסת מאגר ההתגבשות למגלשת זכוכית. העריכו את הגבישים במיקרוסקופ. השתמש במיקרו-לולאה בגודל מתאים כדי לקצור גביש ולהניח את הגביש בטיפת תמיסת המאגר.
להרכבת גבישים, קח נימי קוורץ בקוטר שני מילימטר באורך 50 מילימטר, שאב מאגר עם פיפטה ומלא קצה אחד של הנימים במאגר מאגר. השתמש בלולאת הרכבה כדי למקם בעדינות את הגביש לתוך מאגר המאגר בתוך נימי הקוורץ. הקש על הצינור כדי להזיז את מאגר המאגר והגביש במורד הנימים והשתמש בפיפטה דקה ארוכה כדי לשאוב את התמיסה מסביב לגביש.
השתמש בפתיל נייר דק כדי לייבש בזהירות את הגביש ולייבש את דפנות הנימים ולהוסיף 20 עד 50 מיקרוליטר של תמיסת חיץ דוטרטית לקצה הנימים. השתמש בשרביט חום כדי להמיס חלק משעוות דבורים והכנס בעדינות את הנימים לשעוות הדבורים המומסת עד שנוצר אטימה אטומה. החלף את המאגר הנטול במאגר דאוטראט טרי של 20 עד 50 מיקרוליטר בימים השני, השישי והעשירי לאחר הרכבת הגביש ואטום מחדש את הנימים בשעוות דבורים מומסת טרייה לאחר כל חילופי אדים כפי שהודגם.
לאחר חילופי אדים של שבועיים לפחות, השתמש במרק כדי לאבטח את נימי הקוורץ על מקל הדגימה של גוניומטר דיפרקטומטר נויטרונים IMAGINE שאובטח לשלב דגימת המכשיר ולהוריד את הדגימה ולהדביק לתוך קרן הנויטרונים ואזור הגלאי. פתח את תוכנית רכישת הנתונים במחשב הבקרה של Beamline ולחץ על לשונית ההגדרה כדי להגדיר את אסטרטגיית איסוף הנתונים ולהזין את פרמטרי הניסוי כולל שם המכשיר ושם התמונות שיש לאסוף. לחץ על לשונית האיסוף והזן את פרמטרי איסוף הנתונים כולל זמן החשיפה ומספר הפריימים שיש לאסוף.
בתוך ממשק המשתמש הגרפי האופטי, לחץ על 2.78 עבור מינימום הלמבדה ו- 4.5 עבור המקסימום למבדה כדי להגדיר את הטווח המדומה עבור איסוף הנתונים. לחץ על התחל סריקה כדי להתחיל את איסוף הנתונים. לאחר איסוף נתוני נויטרונים, אסוף מערך נתוני רנטגן מתאים על אותו גביש באותה טמפרטורה.
לפני איסוף נתוני קריו, הסר את תמיסת המאגר מקופסת הסנדוויץ' ומלא את קופסת הסנדוויץ' בתמיסת חיץ מאגר deuterate, אפשר לאזן למשך שבוע וחזור על הפעולה שלוש פעמים. לאחר שלושה סבבים נוספים של החלפת תמיסת מאגר, קצרו את הגביש עם מיקרו-לולאה וטבלו את הגביש בתמיסה קריופרוטקנטית למשך שעתיים לפני הרכבת הגביש במיקרו-לולאה המחוברת לתושבת קריו קריו. צלול את הקריסטל המותקן ואת תושבת הקריו לחנקן נוזלי.
כאשר הגביש קפוא, הרכיב את הגביש על שלב הדגימה של דיפרקטומטר נויטרונים מקרומולקולרי המצויד בזרם קריו. ודא שהגביש מותקן וממורכז לאיסוף נתונים, השלם את פרטי ההצעה ולחץ על סמל התיקיה כדי לטעון את טבלת אסטרטגיית איסוף הנתונים, ולאחר מכן לחץ על שלח כדי להתחיל באיסוף הנתונים. נייטרונים עקיפה יהפכו לגלויים בזמן אמת כאשר הם מזוהים על ידי גלאי זמן הטיסה של MaNDi.
לחידוד נתוני רנטגן ונייטרונים משותפים, פתח תחילה את CCP4 ובחר להמיר כדי לשנות את תוכנית ההרחבה של MTZ כך שתתאים לדגלי הנתונים החופשיים R של נתוני הנויטרונים לאלה של נתוני הרנטגן. ייבא את קובץ השתקפות נתוני הנויטרונים בפורמט MTZ. בחר ייבוא נתוני R בחינם מקובץ MTZ אחר וייבא את קובץ הרנטגן MTZ.
תן שם לקובץ ה-MTZ התואם החדש ולחץ על הפעל. לאחר מכן, פתח את חבילת התוכנה של Phoenix ותחת מיקוד, לחץ על ערכה מוכנה. העלה את קובץ הקואורדינטות של החלבון, בחר להוסיף מימן למודל אם נעדר, ובחר HD באתרים הניתנים להחלפה, H במקום אחר מהתפריט הנפתח.
בחר הוסף דאוטריום למולקולות ממס ולחץ על הפעל כדי להתחיל. עבור עידון מבנה, בכרטיסיה מיקוד, פתח את עוף החול. לחדד את התוכנית כדי להגדיר את החידוד באמצעות נתוני הרנטגן והנייטרונים.
בכרטיסייה הגדרה, הזן את קובץ ה-PDB ממבנה הרנטגן הנפתר. העלה את קובץ ה-MTZ מנתוני הנויטרונים. הקצה את נתוני קובץ ה-MTZ כנתוני נויטרונים ב-neutron R free.
העלה את קובץ ה- MTZ מנתוני הרנטגן והקצה אותו כנתוני רנטגן וצילום רנטגן ללא תשלום. תחת הגדרות מיקוד, אשר שאסטרטגיית המיקוד הסטנדרטית נבחרה והגדל את מספר המחזורים לחמישה. בחר את כל הפרמטרים, מתקדם ומימן.
שנה את מודל זיקוק המימן לבודד וכבה את הכוח הרוכב על ADP, ואז חפש גרעיני. בחר השתמש במרחקים הגרעיניים מ-X-HD. לחץ על הפעל כדי להתחיל את הליטוש.
לבניית מודלים בפיניקס, לחץ על פתח ב-Coot. ב-Coot, דמיין את צפיפות האלקטרונים של קרני רנטגן ואת מפות צפיפות אורך פיזור הנויטרונים. בחר את מנהל התצוגה ומחק את מפת צפיפות אורך פיזור הנויטרונים של נייטרונים 2FOFC.
בחר פתח MTZ ובחר פתח MTZ ופתח את קובץ MTZ של נתוני נויטרונים. עבור אפשרויות המשרעת והשלבים, בחר no_fill_neutron נתונים מהתפריטים הנפתחים כדי לפתוח את מפות צפיפות אורך פיזור הנויטרונים הלא ממולאים. בצע בדיקה ויזואלית של השאריות כדי לקבוע אם המודל מתאים לנתונים ולנתח את שיאי מפת צפיפות ההפרש של אתרים הניתנים להחלפה של מימן-דאוטריום כדי לקבוע את הכיוון והתפוסה הנכונים.
כיוון מחדש את מולקולות המים בהתאם למפות הנייטרונים SLD ואינטראקציות קשרי מימן. התאם את מצב הפרוטונציה והכיוון של שאריות החלבון מימן-דאוטריום האתרים הניתנים להחלפה בהתאם למפות ה-SLD של הנויטרונים. בצע סבבים נוספים של בניית מודלים אינטראקטיביים ושכלול כדי להשיג מבנה שלם.
גבישי חלבון מוקשה הגדלים במאגר על בסיס מים הם בגודל של כ-1,000 על 900 מיקרון. ניתן להרכיב את הגבישים בנימי קוורץ להחלפת אדים עם מאגר מבוסס תחמוצת דאוטריום למשך שלושה שבועות לפני איסוף נתוני עקיפה של נויטרונים. נתוני עקיפה של נויטרונים נאספו במשך מספר ימים ברזולוציה של 2.30 אנגסטרום ומערך נתונים של עקיפה של קרני רנטגן נאסף על אותו גביש.
פסגות ב- FO מינוס FC מפות צפיפות אורך פיזור נויטרונים מספקות מידע רב ערך על כיוון שאריות כגון כגון פרגין ופסגות חיוביות ב- FO מינוס FC צפיפות אורך פיזור נויטרונים מפות השמטה הן גם אינפורמטיביות מאוד בקביעת מצבי הפרוטונציה של שאריות עם קבוצות הניתנות לטיטרציה כגון היסטידין. שכבות-על של מפות צפיפות אורך פיזור אלקטרונים ונויטרונים עבור מולקולות מים מצביעות על כך שבעוד שניתן להסיק אינטראקציות של קשרי מימן מנתוני קרני רנטגן, נויטרונים מספקים מידע ברור על מיקומם של קשרי מימן אלה. ניתן להשתמש במפות השמטת צפיפות אורך פיזור נויטרונים כדי לקבוע כיווני קבוצה פונקציונליים של שרשרת צד מימן-דאוטריום.
מפות צפיפות אורך פיזור נויטרונים שבהן אטומי מימן שאינם ניתנים להחלפה קשורים לפחמן נראות לא שלמות בהשוואה לעמיתיהם במפת צפיפות האלקטרונים עקב ביטול צפיפות. לכן עדיף לבצע חידוד משותף של דגימה עם נתוני רנטגן ונייטרונים שבהם ניתן להשתמש בנתוני הרנטגן כדי לקבוע את מיקום עמוד השדרה של החלבון. קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים דורשת גבישים גדולים.
יש לנקוט בזהירות במהלך הטיפול וההרכבה של הגבישים כדי למנוע פגיעה בגבישים שעלולים להיסדק בקלות, ולפגוע באיכות הנתונים. קריסטלוגרפיה של חלבון נויטרונים מספקת תובנה לגבי מנגנון תגובת החלבון, ועלולה לחשוף שאריות רלוונטיות קטליטית או מולקולות מים שניתן לחקור את תפקידן עוד יותר על ידי קינטיקה, מוטגנזה או ספקטרוסקופיה.
סקירה כללית
קריסטלוגרפיה של חלבון נייטרונים היא טכניקה מבנית המאפשרת איתור של אטומי מימן בחלבונים, ומספקת תובנות קריטיות לגבי תפקודם. מאמר זה מתאר את תהליך ההרכבה של גבישי חלבון, איסוף נתוני עקיפת נייטרונים וניתוח המפות המתקבלות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- קריסטלוגרפיה של נייטרונים
- ניתוח חלבונים
רקע
- קריסטלוגרפיה של נייטרונים עוזרת לקבוע את מיקומי אטומי המימן במקרומולקולות ביולוגיות.
- טכניקה זו חושפת מצבי פרוטונציה וכיווני מולקולות מים.
- היא אינה הרסנית, מה שהופך אותה למתאימה לחלבונים רגישים.
- טכניקות הרכבת גבישים אינן מבוצעות כשגרה, מה שהופך את ההדגמה הזו לבעלת ערך.
מטרת המחקר
- להדגים את תהליך קריסטלוגרפיה של חלבון נייטרונים.
- לספק תהליך מפורט לאיסוף נתונים וניתוחם.
- להדגיש את היתרונות של עקיפת נייטרונים לעומת עקיפת קרני רנטגן.
שיטות בשימוש
- הרכבת גבישי חלבון בנימיות קוורץ.
- איסוף נתוני עקיפת נייטרונים באמצעות גוניומטר.
- ביצוע חידוד נתונים עם ערכות נתונים של נייטרונים וקרני רנטגן.
- שימוש בתוכנה לבניית מודלים והדמיה של מפות צפיפות.
תוצאות עיקריות
- הרכבה ואיסוף נתונים מוצלחים מניסויי עקיפת נייטרונים.
- הדגמה של תהליך חידוד נתונים משותף של קרני רנטגן ונייטרונים.
- הדמיה של מפות צפיפות אורך פיזור נייטרונים.
- תובנות לגבי הפרטים המבניים של חלבונים המתקבלים בשיטה זו.
מסקנות
- קריסטלוגרפיה של חלבון נייטרונים היא כלי רב עוצמה לביולוגיה מבנית.
- הטכניקה מספקת תובנות ייחודיות לגבי תפקוד ואינטראקציות של חלבונים.
- מתודולוגיה נכונה היא חיונית לאיסוף נתונים וניתוח מוצלחים.
