Name: הערכת ההשפעה של שבירה הידראולית על נחלים באמצעות חתימות מולקולריות מיקרוביאליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: חקור את השפעת שבירה הידראולית על קהילות מיקרוביאליות בנחלים באמצעות שיטת 16S rRNA. פרוטוקול זה מספק גישה שלמה לאיסוף דגימות, חילוץ חומצות נוקליאיות וניתוח ביואינפורמטי לבחינת שינויים אקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר במקורות המימון של הפרויקטים שהובילו לפיתוח שיטות אלה, כאשר מקורות אלה הם: המכון הרפואי הווארד יוז (http://www.hhmi.org) באמצעות תוכנית חינוך מדעית Precollege ותואר ראשון, כמו גם על ידי הקרן הלאומית למדע (http://www.nsf.gov) באמצעות פרסי NSF DBI-1248096 ו- CBET-1805549.

<ol><li>The process of unconventional natural gas production. US EPA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production">https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production</a> (2013).</li>
<li>Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+risks+of+shale+oil+and+gas+development+to+wildlife%2C+aquatic+resources%2C+and+their+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats.</a> Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).</li>
<li>McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+erosion+and+surface+water+quality+impacts+of+natural+gas+development+in+East+Texas%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Water%22%5BJournal%5D)">Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA.</a> Water. 4 (4), 944-958 (2012).</li>
<li>Maloney, K. O., Weller, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthropogenic+disturbance%2C+and+streams%3A+land+use+and+land-use+change+affect+stream+ecosystems+via+multiple+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+Biology%22%5BJournal%5D)">Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways.</a> Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).</li>
<li>Meyer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+headwater+streams+to+biodiversity+in+river+networks1%5BTitle%5D)+AND+%22JAWRA+Journal+of+the+American+Water+Resources+Association%22%5BJournal%5D)">The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1.</a> JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).</li>
<li>Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+headwater+streams+in+downstream+water+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Water+Resources+Association%22%5BJournal%5D)">The role of headwater streams in downstream water quality.</a> Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).</li>
<li>Ulrich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+aquatic+bacterial+communities+to+hydraulic+fracturing+in+Northwestern+Pennsylvania%3A+A+five-year+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5683(2018).</li>
<li>Chen See, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biomarkers+of+Marcellus+shale+activity+in+Pennsylvania%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1697(2018).</li>
<li>Rausch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+amplicon+and+metagenomic+sequencing+methods+reveals+key+features+in+the+evolution+of+animal+metaorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms.</a> Microbiome. 7 (1), 133(2019).</li>
<li>Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+16S+rRNA+gene+copy+numbers+in+microbiome+surveys+remains+an+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem.</a> Microbiome. 6 (1), 41(2018).</li>
<li>Trexler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+impacts+of+unconventional+natural+gas+extraction+on+microbial+communities+in+headwater+stream+ecosystems+in+Northwestern+Pennsylvania%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 522(2014).</li>
<li>Mumford, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shale+gas+development+has+limited+effects+on+stream+biology+and+geochemistry+in+a+gradient-based%2C+multiparameter+study+in+Pennsylvania%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).</li>
<li>JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation">https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation</a> (2020).</li>
<li>Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality">https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality</a> (2011).</li>
<li>ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html</a> (2020).</li>
<li>QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation</a> (2020).</li>
<li>ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit">https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit</a> (2020).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/">https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/</a> (2018).</li>
<li>Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/v/5063/gel-purification">https://www.jove.com/v/5063/gel-purification</a> (2020).</li>
<li>New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki">https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki</a> (2020).</li>
<li>Anderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permutational+multivariate+analysis+of+variance+%28PERMANOVA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+StatsRef%3A+Statistics+Reference+Online%22%5BJournal%5D)">Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA).</a> Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטות המתוארות במאמר זה פותחו ושוכללו במהלך מספר מחקרים שפרסמה הקבוצה שלנו בין השנים 2014-20187,8,10 והועסקו בהצלחה בפרויקט שיתופי כדי לחקור את ההשפעות של סדיקה על קהילות מימיות בפרויקט בן שלוש שנים שיגיש בקרוב מאמר לפרסום. שיטות אלה ימשיכו להיות מנוצלות במהלך המשך הפרויקט. בנוסף, ספרות עדכנית אחרת החוקרת את ההשפעה של סדיקה על נחלים ומערכות אקולוגיות מתארות שיטות דומות לאיסוף, עיבוד וניתוח מדגם7,8,10,11. עם זאת, אף אחד מהניירות הללו לא השתמש בניתוח metatranscriptomic, מה שהופך את המאמר הזה הראשון לתאר כיצד ניתן להשתמש בניתוחים אלה כדי להבהיר את השפעת הסדיקה על נחלים סמוכים. יתר על כן, השיטות המוצגות כאן לאיסוף דוגמאות מפורטות יותר, כמו גם הצעדים שננקטו כדי למנוע זיהום.
אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול שלנו הוא איסוף ושימור מדגמים ראשוניים. דגימת שטח ואיסוף מגיע עם אתגרים מסוימים, כמו שמירה על סביבה אספטית או סטרילית במהלך האיסוף יכול להיות קשה. במהלך שלב זה, זה חיוני כדי למנוע דגימות מזהמות. כדי לעשות זאת, כפפות צריך להיות משוחק, ורק מכולות סטריליות וכלים צריך להיות מותר לבוא במגע עם דגימות. דגימות צריך גם להיות ממוקם מיד על קרח לאחר איסוף כדי להקל על השפלת חומצת גרעין. הוספת חומר משמר חומצת גרעין מסחרי על גבי האוסף יכול גם להגדיל את תפוקת חומצת גרעין ולאפשר דגימות להיות מאוחסן לתקופות ארוכות יותר של זמן לאחר האיסוף. בכל פעם מיצוי חומצת גרעין מבוצע, חשוב להשתמש בכמות המתאימה של מדגם, יותר מדי יכול לסתום מסנני ספין המשמשים לחילוץ (עבור אותם פרוטוקולים שעושים בהם שימוש) אבל מעט מדי יכול לגרום לתפוקות נמוכות. הקפד לבצע את ההוראות עבור כל ערכה בשימוש.
בדומה לאיסוף שדה, הימנעות או מזעור זיהום חשוב גם במהלך מיצוי חומצת גרעין והכנת מדגם, במיוחד כאשר עובדים עם דגימות תפוקת חומצת גרעין נמוכה, כגון דגימות משקעים תת-אופטימליים (דגימות המכילות כמות גדולה של חצץ או סלעים) או דגימות מים. לכן, כמו עם איסוף מדגם, כפפות יש ללבוש במהלך כל השלבים האלה כדי להפחית את הזיהום. בנוסף, כל משטחי העבודה המשמשים במהלך הליכי מעבדה צריך להיות מעוקר מראש על ידי ניגוב עם פתרון אקונומיקה 10%, ואחריו פתרון אתנול 70%. עבור צעדי צנרת (3-6), יש להשתמש בטיפים לסינון כדי למנוע זיהום עקב הפיפטה עצמה, עם טיפים משתנים בכל פעם שהם נוגעים במשטח לא סטרילי. יש לנגב את כל הכלים המשמשים לעבודות מעבדה, כולל פיפטות, לפני ואחרי עם פתרונות אקונומיקה ואתנול. כדי להעריך זיהום, ריקים מיצוי ושליליות (נוזל סטרילי) צריך להיכלל במהלך כל קבוצה של עקירות חומצת גרעין ותגובות PCR. אם כימות לאחר עקירות חושף כמות ניתנת לזיהוי של DNA / RNA בשליליות, עקירות ניתן לחזור על אם יש מדגם מספיק עזב. אם דגימות שליליות עבור PCR להראות הגברה, פתרון בעיות צריך להתבצע כדי לקבוע את המקור ולאחר מכן הדגימות יש להפעיל מחדש. כדי להסביר רמות נמוכות של זיהום, מומלץ כי ריקים החילוץ ו PCR שלילי להיות רצף, כך המזהמים ניתן לזהות ולהסיר, במידת הצורך, במהלך ניתוח חישובי. לעומת זאת, הגברה PCR יכול להיכשל גם בשל מגוון רחב של סיבות. עבור דגימות סביבתיות, עיכוב תגובת PCR הוא לעתים קרובות האשם, אשר יכול להיות בשל מגוון רחב של חומרים מפריעים טאק פולימראז23. אם יש חשד לעיכוב, ניתן להשתמש במים בדרגתPCR (ראה טבלת חומרים) כדי לדלל את תמציות ה- DNA.
לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות בולטות וקשיים פוטנציאליים. איסוף דוגמאות יכול להיות מאתגר הן עבור דגימות מים והן עבור משקעים. על מנת לקבל מספיק ביומסה, באופן אידיאלי 1 ליטר של מי נחל צריך להידחף דרך מסנן. הנקבוביות של המסנן צריכות להיות קטנות כדי ללכוד חיידקים, אך יכולות גם ללכוד משקעים. אם הרבה משקעים הוא במים בשל הגשמים האחרונים, המסנן יכול לסתום מה שמקשה לדחוף את כל הנפח דרך המסנן. עבור איסוף משקעים, זה יכול להיות מאתגר להעריך את עומק המ משקעים במהלך האיסוף. יתר על כן, חשוב לוודא כי המשקעים שנאספו הוא בעיקר אדמה, כמו חלוקי נחל וסלעים יוביל תשואה נמוכה יותר של חומצת גרעין ולא יכול להיות ייצוג מדויק של הקהילה המיקרוביאלית. לבסוף, זה חיוני גם כי דגימות נשמרים על קרח לאחר איסוף, במיוחד אם חומר משמר אינו בשימוש.
למרות פרוטוקול זה מכסה הן metatranscriptomics ו 16S פרוטוקולי מעבדה, יש להדגיש כי שתי שיטות אלה שונות מאוד הן בתהליך והן בסוג הנתונים שהם מספקים. הגן 16S rRNA הוא אזור ממוקד בדרך כלל, שמור מאוד בחיידקים ו archaea, ושימושי לאפיון הקהילה החיידקית במדגם. למרות גישה ממוקדת וספציפית, רזולוציית רמת המינים היא לעתים קרובות בלתי מושגת, ואפיון מינים או זנים חדשים שהתפצלו קשה. לעומת זאת, metatranscriptomics היא גישה רחבה יותר הלוכדת את כל הגנים והמיקרואורגניזמים הפעילים הקיימים בתוך מדגם. בעוד ש- 16S מספק נתונים בלבד לזיהוי, metatranscriptomics יכול לספק נתונים פונקציונליים כגון גנים מבוטאים ומסלולים מטבוליים. שניהם בעלי ערך וכאשר הם משולבים, הם יכולים לחשוף אילו חיידקים קיימים ובאיו גנים הם מבטאים.
מאמר זה מתאר שיטות לאיסוף שדות ועיבוד מדגמי עבור ניתוחי 16S rRNA ו- metatranscriptomic בהקשר של לימוד fracking. בנוסף, הוא מפרט שיטות איסוף עבור DNA / RNA באיכות גבוהה מדגימות ביומסה נמוכה לאחסון לטווח ארוך. השיטות המתוארות כאן הן שיאן של החוויות שלנו עם איסוף ועיבוד דגימות במאמצינו ללמוד כיצד סדיקה משפיעה על נחלים סמוכים באמצעות בחינת המבנה והתפקוד של קהילות המיקרואורגניזמים שלהם. חיידקים מגיבים במהירות להפרעות, וכתוצאה מכך, אילו חיידקים קיימים והגנים שהם מבטאים יכולים לספק מידע על ההשפעות של סדיקה על מערכות אקולוגיות. באופן כללי, שיטות אלה יכולות להיות יקרות ערך בהבנתנו כיצד סדיקה משפיעה על מערכות אקולוגיות חשובות אלה.

שבירה הידראולית (HF), או "סדיקה", היא שיטה להפקת גז טבעי, שהפכה נפוצה יותר ויותר ככל שהביקוש לדלקים פוסיליים ממשיך לעלות. טכניקה זו מורכבת משימוש בציוד קידוח רב עוצמה כדי להזריק תערובת של מים, חול וכימיקלים למרבצי פצלי שמן עשירים במתאן, בדרך כלל כדי לשחרר גזים לכודים1.
מכיוון שטכניקות קציר לא קונבנציונליות אלה חדשות יחסית, חשוב לחקור את ההשפעות של פרקטיקות כאלה על נתיבי מים סמוכים. פעילויות סדיקה מחייבות פינוי של חלקות גדולות של קרקע להובלת ציוד ובניית רפידות היטב. יש לפנות כ-1.2-1.7 דונם של קרקע עבור כל כרית באר2, מה שעלול להשפיע על נגר ואיכות המים של המערכת3. יש חוסר שקיפות סביב ההרכב הכימי המדויק של נוזל fracking, כולל מה biocides משמשים. בנוסף, שפכים סדוקים נוטים להיות מלוחים מאוד2. יתר על כן, השפכים עשויים להכיל מתכות וחומרים רדיואקטיביים טבעיים2. לכן, האפשרות של דליפות ושפיכות של נוזל fracking עקב טעות אנוש או תקלה בציוד הוא מדאיג.
ידוע כי מערכות אקולוגיות של נחלים רגישות מאוד לשינויים בנופים הסובביםאת 4 וחשובות לשמירה על המגוון הביולוגי5 ועל רכיבה נכונה על אופניים מזינים6 בתוך קו פרשת המים כולו. חיידקים הם האורגניזמים הנפוצים ביותר בנחלי מים מתוקים ולכן חיוניים לרכיבה על אופניים מזינים, להתכלות ולייצור ראשוני. הרכב ותפקוד קהילתי מיקרוביאלי משמשים ככלים מעולים להשגת מידע על המערכת האקולוגית בשל רגישותם להטרדות, ומחקרים שנערכו לאחרונה הראו שינויים ברורים במכלולים חיידקיים שנצפו בהתבסס על קרבה לפעילות סדיקה7,8. לדוגמה, בייג'רינקיה, Burkholderia, ומתנובקטריום זוהו כמועשרים בנחלים ליד fracking בעוד פסאודונוקרדיה, Nitrospira, ו Rhodobacter הועשרו בנחלים לא ליד fracking7.
הדור הבא של רצף ה-RNA ריבוזומלי 16S (rRNA) הוא שיטה סבירה לקביעת הרכב קהילת חיידקים מהיר וזול יותר מאשר רצף גנום שלם מתקרב9. מנהג נפוץ בתחום האקולוגיה המולקולרית הוא להשתמש באזור V4 המשתנה מאוד של גן 16S rRNA לרזולוציה רצף, לעתים קרובות עד לרמת הסוג עם היקף רחב של זיהוי 9 , כפי שהוא אידיאלי עבורדגימותסביבתיות בלתי צפויות. טכניקה זו יושמה באופן נרחב במחקרים שפורסמו ונוצלה בהצלחה כדי לזהות את ההשפעה של פעולות fracking על סביבות מימיות7,8. עם זאת, ראוי לציין כי חיידקים יש מספרי העתקה שונים של הגן 16S rRNA, אשר משפיע על השפע שזוההשלהם 10. ישנם כמה כלים להסביר את זה, אבל היעילות שלהם מוטלת בספק10. פרקטיקה נוספת הגדלה במהירות בשכיחות וחסרה חולשה זו היא רצף מטטרני, שבו כל הרנ"א רצף, ומאפשר לחוקרים לזהות הן חיידקים פעילים והן את ביטוי הגנים שלהם.
לכן, בניגוד לשיטות במחקרים שפורסמו בעבר7,8,11,12, פרוטוקול זה מכסה גם איסוף מדגמים, שימור, עיבוד וניתוח לחקירת פונקציית הקהילה המיקרוביאלית (metatranscriptomics). השלבים המפורטים כאן מאפשרים לחוקרים לראות איזו השפעה, אם בכלל, הייתה לפיצוח על הגנים והמסלולים שבאים לידי ביטוי על ידי חיידקים בזרמים שלהם, כולל גנים של התנגדות מיקרוביאלית. יתר על כן, רמת הפירוט המוצגת עבור איסוף מדגם משופרת. למרות כמה צעדים הערות עשוי להיראות ברור לחוקרים מנוסים, הם יכולים להיות לא יסולא בפז לאלה רק מתחילים מחקר.
כאן, אנו מתארים שיטות לאיסוף ועיבוד דגימות כדי ליצור נתונים גנטיים חיידקיים כאמצעי לחקור את ההשפעה של fracking על נחלים סמוכים בהתבסס על המעבדות שלנו כמה שנות ניסיון. ניתן להשתמש בנתונים אלה ביישומים במורד הזרם כדי לזהות הבדלים המתאימים למצב fracking.

<table><tbody><tr><td>יש להוסיף 200 הוכחות אתנול</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>400 מ"ל ל-Buffer PE (ראה פרוטוקול ערכת מיצוי ג'ל Qiagen QIAQuck) ויש להוסיף 96 מ"ל למאגר שטיפת ה-DNA/RNA (ראה פרוטוקול ערכת Miniprep של ZymoBIOMICS DNA/RNA). יש צורך באתנול נוסף עבור ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep ו-NEBNext&reg; אולטרה ומסחר; II הכנת ספריית RNA עם ערכות חרוזי טיהור לדוגמא.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>100 גרם לבקבוק. יהיה צורך ב-0.6 גרם אגרוז כדי להכין ג'ל אחד של 2% 30 מ"ל.</td></tr><tr><td>חיטוי אקונומיקה</td><td>וולמארט (קלורוקס)</td><td>אין מספר קטלוגי</td><td>השתמש בתמיסת אקונומיקה של 10% לניקוי אזור העבודה לפני ואחרי הליכי מעבדה</td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>כל תוצרת משתמש (כלומר לא e-gel) צריכה לכלול טעינת צבע עם כל הדגימות ביחס של 1 ומיקרו; L צבע עד 5 ומיקרו; </td></tr><tr><td>סולם DNA</td> מדגם L <td>MilliporeSigma</td><td>D3937-1VL</td><td>יש להפעיל סולם על כל מגן DNA / RNA ג'ל / ג'ל</td></tr><tr><td>אלקטרוני (2x)</td> <td>Zymo Research</td><td>R1200-125</td><td>3 מ"ל לדגימת משקעים (50 מ"ל חרוטי) ו -2 מ"ל לדגימת מים (מסנן)</td></tr> <tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>BP1302-10</td><td>משמש לצביעה של e-gels מתוצרת המשתמש</td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies ( IDT)</td><td>51-01-19-06</td><td>0.5 ומיקרו; L לכל תגובת PCR</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>MilliporeSigma</td><td>563935-1L</td><td>בדרך כלל פחות מ-2 מ"ל לספרייה. הנפח הדרוש משתנה לפי מסת שבר הג'ל שנכרת (ראה פרוטוקול ערכת מיצוי ג'ל Qiagen QIAQuick).&nbsp;</td></tr><tr><td>מים בדרגת PCR</td><td>MilliporeSigma</td><td>3315932001</td><td>13 ומיקרו; L לכל תגובת PCR (בהנחה של 1 ומיקרו; L של תבנית DNA לדוגמה משמשת)</td></tr> <tr><td>פלטינה התחלה חמה PCR מאסטר מיקס (2x)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>13000012</td><td>10 ומיקרו; L לכל תגובת PCR</td></tr><tr><td>פריימר הפוך</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות (IDT)</td> <td>51-01-19-07</td><td>0.5 ומיקרו; L לכל תגובת PCR</td></tr><tr><td>מאגר TBE (Tris-borate-EDTA)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B52</td><td>1 ליטר של מאגר TBE 10x (30 מ"ל של מאגר TBE 1x יהיה צורך כדי ליצור ג'ל אחד של 30 מ"ל)</td></tr> <tr><td>בקבוק 1 ליטר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-893-4E</td><td>אחד דרוש לכל זרם (ניתן להשתמש באותו בקבוק למספר זרמים אם הוא מעוקר בין השימושים)</td></tr> <tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780400-450EA</td><td>יש צורך ב-5 צינורות מיקרו-צנטריפוגה לכל מיצוי DNA ו-3 נוספים נדרשים לטיהור RNA (ראה פרוטוקול ערכת Miniprep של ZymoBIOMICS DNA/RNA)</td></tr><tr><td>2% ג'ל אלקטרוני של אגרוז</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G401002</td><td>כל ג'ל יכול להריץ 10 דגימות (אז 9 עם PCR שלילי ו-8 אם המיצוי שלילי מופעל על אותו ג'ל)</td></tr> <tr><td>50 מ"ל חרוטי</td><td>CellTreat</td><td>229421</td><td>1 50 מ"ל חרוטי דרוש לכל דגימות משקע</td></tr><tr><td>500 מ"ל</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z740580</td><td>רק 1 דרוש (לעיקור להבה)</td></tr> <tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>Walmart (Reynolds KITCHEN)</td><td>אין מספר</td><td>ניתן לקפל ולבצע חיטוי של נייר אלומיניום. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלק שאינו חשוף לסביבה כמשטח סטרילי, נטול DNA ו-RNA לעיבוד מסננים (חתיכה מקופלת אחת לכל מסנן כדי למנוע זיהום צולב)</td></tr><tr><td>חיטוי</td><td>Gettinge</td><td>LSS 130</td><td>רק צנטריפוגה אחת דרושה</td></tr><tr><td></td><td>MilliporeSigma</td><td>EP5404000138-1EA</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>מצנן</td><td>ULINE</td><td>S-22567</td><td>ניתן להשתמש כמעט בכל צידנית. זה רשום בשל היותו עשוי מקצף, מה שהופך אותו לקל יותר ולכן קל יותר לקחת אותו לדגימת שטח.</td></tr><tr><td>Disruptor Genie</td><td>Bio-Rad</td><td>3591456</td><td>רק אחד דרוש</td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td>1664000EDU</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>ספק כוח אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>מקפיא (-20 C)</td><td>K2 SCIENTIFIC</td><td>K204SDF</td><td>אחד דרוש לאחסון תמציות DNA</td></tr><tr><td>מקפיא (-80 C)</td><td>K2 SCIENTIFIC</td><td>K205ULT</td><td>אחד הדרוש לאחסון תמציות RNA</td></tr><tr><td>כפפות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-020-352</td><td>המספר הקטלוגי הוא עבור כפפות בינוניות.</td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z741333-1EA</td><td>רק</td></tr><tr><td>מבער מעבדה</td> אחד דרוש <td>Sterlitech</td><td>177200-00</td><td>רק אחד צריך</td></tr><tr><td>מערכות AirClean קולט אדים למינארי</td><td></td><td>AC624LFUV</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>ערכת טיהור ספרייה</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ערכה אחת מספיקה ל-50 תגובות</td></tr><tr><td>לוחית מגנט</td><td>Alpaqua</td><td></td><td>A001219 רק אחת דרוש</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>75004061</td><td>רק אחד צריך</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה (1000 ומיקרו; נפח L)Pipette.com</td><td></td> <td>L-1000</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה (2 ומיקרו; L נפח)</td><td>Pipette.com</td><td>L-2</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה (20 ומיקרו; נפח L)Pipette.com</td><td></td> <td>L-20</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה (200 ומיקרו; נפח L)Pipette.com</td><td></td> <td>L-200R</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II הכנת ספריית RNA עם חרוזי טיהור לדוגמא</td><td>ניו אינגלנד BioLabs Inc.</td><td>E7775S</td><td>בערכה אחת יש מספיק ריאגנטים ל-24 דגימות.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7793-1EA</td><td>דרושים 2 ריבועים בגודל 1 אינץ' x 1 אינץ' לכל מסנן</td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12230</td><td>דרוש צינור אחד לכל תגובה</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (עבור 1000 ומיקרו; נפח L)Pipette.com</td><td></td> <td>LF-1000</td><td>חבילה של 576 טיפים</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (ל-20 ומיקרו; L נפח)Pipette.com</td><td></td> <td>LF-20</td><td>חבילה של 960 טיפים</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (עבור 200 ומיקרו; L נפח)</td><td>Pipette.com</td><td>LF-250</td><td>חבילה של 960 טיפים</td></tr><tr><td>אשכול מחשבים PowerWulf ZXR1+</td><td>מעבדות PSSC</td><td>אין מספר</td><td>זו רק דוגמה למחשב-על חזק מספיק כדי לבצע ניתוח מטא-טרנסקריפטומיקה בזמן. צריך רק אחד.&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת התחלה של פלואורומטר קיוביט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>Q33239</td><td>מגיע עם פלואורומטר קיוביט 4, מספיק מגיב ל-100 בדיקות DNA, ו-500 צינורות קיוביט</td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>רק אחד דרוש</td></tr><tr><td>להבים סטריליים</td><td>AD כירורגי</td><td>A600-P10-0</td><td>אחד דרוש לכל מסנן</td></tr><tr><td>יחידת מסנן לחץ Sterivex-GP</td><td>MilliporeSigma</td><td>SVGP01050</td><td>1 מסנן דרוש לכל דגימת מים</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>רק אחד דרוש</td></tr><tr><td>Vise-grip</td><td>Irwin</td><td>2078500</td><td>רק אחד דרוש (לפיצוח המסננים)</td></tr> <tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z258415-1EA</td><td>רק 1 דרוש</td></tr><tr><td>שקיות WHIRL-PAK</td><td>ULINE</td><td>S-22729</td><td>1 דרוש לכל מסנן</td></tr><tr><td>ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2002</td><td>ערכה אחת מכילה מספיק ריאגנטים ל-50 דגימות.</td></tr></tbody></table>

הערכת ההשפעה של שבירה הידראולית על נחלים באמצעות חתימות מולקולריות מיקרוביאליות

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

שבירה הידראולית (HF), המכונה בדרך כלל "fracking", משתמש בתערובת של מים בלחץ גבוה, חול, וכימיקלים לשבור סלעים, שחרור נפט וגז. תהליך זה חולל מהפכה בתעשיית האנרגיה האמריקאית, שכן הוא מעניק גישה למשאבים שבעבר לא ניתן היה להשיגם וכיום מייצר שני שלישים מכלל הגז הטבעי בארצות הברית. למרות סדיקה יש השפעה חיובית על כלכלת ארה"ב, מספר מחקרים הדגישו את ההשפעות הסביבתיות המזיקות שלה. מדאיג במיוחד הוא ההשפעה של סדיקה על נחלי מי ראש, אשר חשובים במיוחד בשל השפעתם הגדולה באופן לא פרופורציונלי על בריאות קו פרשת המים כולו. החיידקים בתוך זרמים אלה יכולים לשמש כאינדיקטורים לבריאות הזרם, שכן החיידקים הקיימים והשפע שלהם בזרם מופרע צפויים להיות שונים מאלה בזרם דומה אך ללא הפרעה. לכן, פרוטוקול זה נועד להשתמש בקהילת החיידקים כדי לקבוע אם נחלים הושפעו על ידי fracking. עד לכאן, יש לאסוף משקעים ודגימות מים, מזרמים הסמוכים לפיצוח (שעלול להיות מושפע) ומעלה או בקו פרשת מים שונה של פעילות סדיקה (חד-צבעית). דגימות אלה כפופות לאחר מכן להפקת חומצת גרעין, הכנת ספריה, ורצף לחקור הרכב הקהילה מיקרוביאלית. לאחר מכן ניתן להשתמש בניתוח קורלציה ומודלים של למידת מכונה כדי לזהות אילו תכונות מסבירות את השונות בקהילה, כמו גם זיהוי סמנים ביולוגיים חזויים להשפעת הסדיקה. שיטות אלה יכולות לחשוף מגוון הבדלים בקהילות המיקרוביות בין נחלי מי ראש, בהתבסס על הקרבה לפיצוח, ולשמש בסיס לחקירות עתידיות על ההשפעה הסביבתית של פעילויות סדיקה.

ניתן להעריך את ההצלחה של עקירות DNA ו- RNA באמצעות מגוון רחב של ציוד ופרוטוקולים. בדרך כלל, כל ריכוז ניתן לזיהוי של אחד מהם נחשב מספיק כדי להסיק כי החילוץ היה מוצלח. בחינת טבלה 1 אז, כל החילוצים, למעט אחד, ייקרא מוצלח. כישלון בשלב זה נובע לעתים קרובות ביומסה ראשונית נמוכה, שימור מדגם לקוי, או טעות אנוש במהלך החילוץ. במקרה של מסננים, החילוץ עשוי להיות מוצלח גם אם הריכוז הוא מתחת לזיהוי. אם תמציות אלה אינן מניבות רצועות עבור PCR (אם עושים 16S) או ריכוז ניתן לזיהוי לאחר הכנת הספרייה (metatranscriptomics), אז הם ככל הנראה באמת להיכשל.
אם מתבצע פרוטוקול 16S, רצועות בהירות בעקבות הגברת PCR, כפי שניתן לראות בבארות 4 ו -6 באיור 1, מצביעות על הצלחה, בעוד מחסור בלהקות, כפי שניתן לראות בבארות האחרות בשורה העליונה, מצביע על כישלון. יתר על כן, פס בהיר בנתיב הג'ל המכיל בקרת PCR שלילית יצביע גם על כשל שכן זה יהיה מסוכן להניח כי הזיהום המשפיע על פקדים שליליים(ים) לא השפיע על הדגימות.
הן עבור 16S והן עבור metatranscriptomics, ניתן להעריך את הצלחת הרצף על ידי התבוננות במספר הרצפים שהושגו (איור 2). דגימות 16S צריכות למינימום של 1,000 רצפים, כאשר לפחות 5,000 הם אידיאליים(איור 2A). כמו כן, דגימות metatranscriptomics צריך להיות מינימום של 500,000 רצפים, עם לפחות 2,000,000 להיות אידיאלי(איור 2B). דגימות עם פחות רצפים מאשר מינימום אלה לא צריך לשמש עבור ניתוחים, כפי שהם לא יכולים לייצג במדויק את הקהילה החיידקית שלהם. עם זאת, דגימות הנופלות בין המינימום לאידיאל עדיין ניתן להשתמש אם התוצאות יש לפרש בזהירות רבה יותר אם דגימות רבות נופלות בטווח זה.
ההצלחה של ניתוח במורד הזרם הבא ניתן לקבוע פשוט על בסיס אם קבצי הפלט הצפויים הושגו או לא. בכל מקרה, תוכניות, כגון QIIME2 ו-R (איור 3),אמורות לאפשר הערכה של הבדלים משמעותיים פוטנציאליים בין קהילות החיידקים המבוססות על סדיקה. הנתונים עבור איור 3 התקבלו על ידי איסוף דגימות משקעים מעשרים ואחד אתרים שונים ב-13 זרמים שונים עבור 16S וניתוח מטטרן-ראת-ראולוגי. מתוך אותם עשרים ואחד אתרים, 12 מהם היו במורד הזרם של פעילות fracking מסווג HF +, ותשעה מהם היו גם במעלה הזרם של פעילות fracking או בקו פרשת מים שבו סדיקה לא התרחשה; נחלים אלה סווגו כ- HF-. מלבד נוכחות של פעילות fracking, הנחלים היו דומים אחרת.
הבדלים אלה יכולים ללבוש צורה של משמרות קומפוזיציה עקביות המבוססות על מצב סדיקה. אם זה היה המקרה, דגימות HF+ ו- HF היו צפויות להתקבץ זו מזו בחלקת PCoA, כפי שקורה באיור 3A ובאיור 3B. כדי לאשר כי משמרות לכאורה אלה אינם רק חפץ של שיטת ההסמכה, ניתוח סטטיסטי נוסף נדרש. לדוגמה, בדיקת PERMANOVA22 במטריצת המרחק שאיור 3A ואיור 3B מבוססות עליהן התגלתה קיבוץ משמעותי בהתבסס על מצב הסדיקה, כלומר ההפרדה שנצפו בעלילה עולה בקנה אחד עם הבדלים בין קהילות החיידקים של הדגימות, במקום חפץ של הסמכה. תוצאה משמעותית PERMANOVA או ANOSIM היא אינדיקציה חזקה של הבדלים עקביים בין HF + ו- HF - דגימות, אשר יצביעו על כך דגימות HF + הושפעו על ידי fracking, בעוד ערך p גבוה יצביע על כך הדגימות לא הושפעו. ניתן גם לדמיין ולהעריך נתונים מטטרניים באמצעות אותן שיטות.
בחינת תכונות דיפרנציאליות (חיידקים או פונקציות) יכולה לחשוף ראיות לכך שגם דגימות הושפעו. שיטה אחת לקביעת תכונות דיפרנציאליות היא ליצור מודל יער אקראי. ניתן להשתמש במודל היער האקראי כדי לראות עד כמה ניתן לסווג כראוי את מצב הסדיקה של הדגימות. אם המודל מבצע טוב מהצפוי במקרה, זו תהיה עדות נוספת להבדלים התלויים במצב הסדיקה. יתר על כן, המנבאים החשובים ביותר יחשפו אילו תכונות היו החשובות ביותר להבחנה נכונה של דגימות (איור 3C). תכונות אלה גם אז היו ערכים שונים באופן עקבי המבוססים על מצב fracking. לאחר שתכונות דיפרנציאליות אלה נקבעות, ניתן לסקור את הספרות כדי לראות אם הן קושרו בעבר לפיצוח. עם זאת, זה עשוי להיות מאתגר למצוא מחקרים שקבעו פונקציות דיפרנציאליות, כמו רוב השתמשו רק 16S rRNA קומפוזיציה נתונים. לכן, להערכת ההשלכות של פונקציות דיפרנציאליות, שיטה אפשרית אחת תהיה לראות אם הם היו קשורים בעבר עם עמידות פוטנציאלית biocides נפוץ נוזל fracking או אם הם יכולים לסייע בסובלנות תנאים מלוחים מאוד. יתר על כן, בחינת הפרופיל התפקודי של טקסון של עניין יכולה לחשוף ראיות להשפעת הסדיקה (איור 3D). לדוגמה, אם טקסון מזוהה כדיפרנציאלי על ידי מודל היער האקראי, פרופיל ההתנגדות האנטי מיקרוביאלית שלו בדגימות HF + ניתן להשוות לפרופיל שלו בדגימות HF ואם הם שונים מאוד, זה יכול להציע כי נוזל fracking המכיל biocides נכנס לזרם.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>דוגמהID</td>
			<td>ריכוז (ng/μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>0.745</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>0.805</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>7.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>0.053</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>0.248</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>0.945</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>1.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>0.804</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>0.551</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>1.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>4.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Below_Detection</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>7.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>0.346</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>2.64</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>1.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>0.951</td>
		</tr>
</tbody></table> טבלה 1: ריכוזי DNA לדוגמה המבוססים על פלואורומטר 1x DS DNA רגישות גבוהה . עקירות עבור כל הדגימות האלה, למעט 14, ייחשב מוצלח בשל שיש כמויות לגילוי של DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig01.jpg"> איור 1:ג'ל אלקטרוני לדוגמה עם מוצרי PCR. הג'ל היה מוכתם מראש ודמיינו תחת אור UV, מה שגרם לכל DNA הנוכחי עליו לזהור. PCR עבד עבור הדגימות בבארות 4 ו 6 בשורה הראשונה, שכן לשניהם הייתה רצועה בהירה אחת בגודל הצפוי (בהתבסס על הסולם). PCR עבור הדגימות בשש בארות האחרות נכשל, כפי שהם לא לייצר כל להקות. השליטה החיובית (טוב ראשונה, שורה שנייה) הייתה להקה בהירה, המציין כי PCR בוצע כראוי, ואת הפקדים השליליים (בארות 6 ו 7, שורה שנייה) לא היו כל רצועות, המציין כי דגימות לא היו מזוהמות. אם שלילי היה להקה בהירה כמו הדגימות, PCR היה נחשב כישלון שכן זה יהיה מסוכן להניח כי הדגימות היו amplicons כי לא היו רק תוצאה של זיהום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig02.jpg"> איור 2: רצף לדוגמה סופר. (A) 16S רצף דוגמאות נחשב. כמעט לכל דגימות 16S אלה היו מעל 1,000 רצפים. יש להחריג את המעטים שהיו להם פחות מ-1,000 רצפים מניתוחים במורד הזרם, מכיוון שלא היו להם רצפים מספיקים כדי לייצג במדויק את קהילות החיידקים שלהם. בכמה רצפים היו בין 1,000 ל-5,000 רצפים; אמנם לא אידיאלי, הם עדיין יהיו שמיש שכן הם עולים על המינימום החשוף, ורוב הדגימות עולה על המינימום האידיאלי של 5,000 גם כן. (ב)דוגמה של מטטרן- כתבות נחשבת. כל הדגימות חרגו הן ממספר הרצפים המינימלי (500,000) והן ממספר המינימום האידיאלי (2,000,000) של רצפים. לכן, הרצף הצליח עבור כולם, וכולם יכולים לשמש בניתוח במורד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61904/61904fig03.jpg"> איור 3: ניתוח לדוגמה. (A)התוויית PCoA המבוססת על קואורדינטות שחושבו באמצעות מטריצת מרחק חד-גזעית משוקללת שנוצרה וחושאתה באמצעות QIIME2. (B)התוויית PCoA המבוססת על קואורדינטות שחושבו עם מטריצת המרחק המשוקלל של איחוד משוקלל שיוצאת מ- QIIME2. הקואורדינטות הוצגו באמצעות חבילות Phyloseq ו- ggplot2 בווקטורים R. Metadata הותקנו לחלקה באמצעות החבילה הטבעונית. כל נקודה מייצגת את קהילת החיידקים של הדגימה, עם נקודות קרובות יותר המצביעות על הרכבים קהילתיים דומים יותר. קיבוץ באשכולות בהתבסס על מצב fracking עבור דגימות משקעים אלה 16S נצפתה (PERMANOVA, p = 0.001). יתר על כן, הווקטורים חושפים כי דגימות HF + נטו להיות רמות גבוהות יותר של בריום, ברומיד, ניקל, ואבץ, אשר תואמים הרכב קהילת חיידקים שונים לעומת דגימות HF. (C)עלילה של המנבאים הטובים ביותר למודל יער אקראי שבדק היכן ניתן להשתמש בשפע חיידקי כדי לחזות מצב סדיקה בין הדגימות. מודל היער האקראי נוצר באמצעות R באמצעות חבילת היער האקראית. 20 המנבאים המובילים מוצגים, כמו גם את הירידה המתקבלת בזומאה (מדד של מספר HF + ו- HF - דגימות מקובצים יחד) בצורה של ירידה ממוצעת במדד ג'יני כאשר הם מנוצלים לדגימות נפרדות. (D)תרשים עוגה המציג את פרופיל ההתנגדות האנטי-מיקרוביאלית של פרופיל Burkholderiales המבוסס על נתונים metatranscriptomic. רצפים היו תחילה ביאורים עם Kraken2 כדי לקבוע לאיזה מסה הם שייכים. BLAST שימש אז עם רצפים מבואורים אלה ואת מסד הנתונים MEGARes 2.0 כדי לקבוע אילו גנים התנגדות מיקרוביאלית (בצורה של "MEG_#") היו מבוטאים באופן פעיל. גנים של התנגדות מיקרוביאלית שבאו לידי ביטוי על ידי חברי Burkholderiales חולצו אז כדי לראות אילו מהם היו הנפוצים ביותר בקרב מסה זו. בעוד יקר יותר וגוזל זמן רב יותר, metatranscriptomics מאפשר ניתוחים פונקציונליים, כגון זה אשר לא ניתן לעשות עם נתונים 16S. ראוי לציין, Kraken2 שימש לניתוח לדוגמה זו, במקום HUMAnN2. Kraken2 מהיר יותר מ HUMAnN2; עם זאת, הוא מפיק רק מידע קומפוזיציה, במקום קומפוזיציה, תרומה ופונקציות (גנים) ומסלולים כמו HUMAnN2 עושה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/61904fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים: דוגמה לצינור metatranscriptomics. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61904/Supplemental%20File_61904_R2_RE.docx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של שבירה הידראולית על נחלים סמוכים על ידי ניתוח קהילות המים והמשקעים שלהם.

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על השאלה אם וכיצד שבירה הידראולית משפיעה על חיידקים בנחלים סמוכים ובהרחבה על הנחלים עצמם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אופיה ההוליסטי, שכן היא לוקחת את החוקר מאיסוף דגימות לאורך כל הדרך דרך ניתוח נתונים. מדגים את ההליך יהיה ג'רמי Chansee, bioinformatician במעבדה שלי, סידני ריגל, סטודנט לתואר ראשון במכללת Juniata, וג'יליאן לייסטר, מנהל המעבדה שלי.כדי לאסוף דגימות משקעים להפקת חומצת גרעין, השתמש בכפפות כדי להטביע צינור חרוט 50 מיליליטר כתרים וסטרילי לתוך מי הנחל מהחוף. בזמן שהצינור שקוע, הסירו את המכסה והשתמשו במכסה כדי לגרוף כשלושה מיליליטרים של משקעים מעומק של ס"מ עד שלושה סנטימטרים לתוך הצינור. לאחר איסוף הדגימה, לזרוק את כל אבל כמיליליטר אחד של מים מתוך הצינור ולהשתמש 1, 000 פיפטה מיקרוליטר להוסיף שלושה מיליליטר של חומר משמר DNA / RNA לדגימה.מערבבים את הצינור החרוט במשך חמש שניות כדי לערבב ביסודיות את החומר המשמר ולדגום ולאחסן את הדגימה על קרח. עם החזרה למעבדה, לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח DNA 16S או מינוס 70 מעלות צלזיוס לניתוח RNA metatranscriptomics. לאוסף מסננים, מלאו וריקון בקבוק סטרילי שלם של ליטר אחד במי נחל שלוש פעמים כדי להתנות את הבקבוק לפני מילוי הבקבוק בפעם האחרונה.על משטח יציב, צייר נפח מלא של מי נחל לתוך מזרק מנעול luer סטרילי ולחבר את המזרק לסטרילי DNA / RNA חינם 1.7 ס"מ קוטר פוליאתרסולפון מסנן עם גודל נקבובית 0.22 מיקרון. לשטוף את כל הנפח של מי הנחל דרך המסנן. כאשר נפח המדגם כולו מסונן באותו אופן, למשוך כ 20 מיליליטר של אוויר לתוך המזרק ולדחוף את האוויר דרך המסנן כדי להסיר כל עודפי מים מהמסנן.לאחר מכן, השתמש במיקרופיט P1000 כדי להוסיף שני מיליליטר של חומר משמר DNA / RNA לפתיחה הגדולה יותר של המסנן תוך החזקת המסנן אופקית עם קצה הפיפטה בחבית המסנן כדי להבטיח כי החומר המשמר נכנס למסנן. לאחר מכן לאטום את המסנן עם ריבועים עטופים היטב של סרט פרפין סביב כל פתח ומניחים את המסנן לתוך שקית מדגם סטרילי על קרח. עם החזרה מדגימה, לאחסן את המסננים עבור 16S או עבור ניתוח metatranscriptomic כפי שהודגם.לפני תחילת העברת דגימה, לנקות את אזור העבודה עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול. להפקת חומצת גרעין מדגם מ משקעים, השתמש בכלי מתכת מעוקר להבה ואתנול כדי להעביר כ -250 מיליגרם של דגימה לצינור microcentrifuge. להפקת חומצת גרעין מדגם מסנן, השתמש באחיזת סגן מעוקרת 70% אתנול ולהבה כדי לשבור את מעטפת המסנן על המשטח הסטרילי ולהסיר את הליבה מהמעטפת.השתמש באזמל סטרילי כדי לפרוס בחלק העליון, התחתון, ולאורך התפר של הליבה ולהשתמש פינצטה סטרילית לקפל את נייר המסנן לפני חיתוך אותו לחתיכות קטנות עם האזמל. לאחר מכן מניחים בזהירות את חלקי המסנן לתוך צינור microcentrifuge מבלי ליצור קשר עם משטחים לא סטריליים. עבור תמותה של התאים בתוך כל סוג של מדגם, לחשוף את הצינור לשבש תא במהירות גבוהה.לאחר חמש דקות לפחות, צנטריפוגה הדגימות ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. הוסף מאגר תמה לסופר-נט ביחס של אחד לאחד והעבר את הפתרון למסנן שסופק. מניחים את המסנן לתוך צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 400 microliters של חוצץ הכנה לצינור.לאחר צנטריפוגה, להוסיף 700 microliters של חוצץ לשטוף לצינור צנטריפוגה המסנן שוב. לאחר השלכת הזרימה דרך, להוסיף 400 microliters של חוצץ לשטוף לצינור עבור צנטריפוגה נוספת ולהעביר את המסנן לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. כדי לחמוק מהדנ"א, יש לטפל במסנן ב-50 מיקרוליטרים של מים נטולי DNase/RNase למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.בינתיים, הניחו מסנן HRC של שלושה לתוך צינור איסוף והוסיפו 600 מיקרוליטרים של פתרון הכנה HRC. לאחר צנטריפוגה, להעביר את המסנן לתוך צינור microcentrifuge סטרילי חדש ולהעביר את ה- DNA eluted למסנן עבור צנטריפוגה. הזרימה דרך מכיל את ה- DNA שחולץ.כדי ליצור ספריית DNA 16S RNA, השתמש תחילה במוצר ה- DNA שחולץ זה עתה להגברת RNA ריבוזומלית 16S עם פרוטוקול PCR סטנדרטי. מערבבים שבעה מיקרוליטרים של מוצר ה-PCR שנוצר ו-13 מיקרו-לייטרים של מים נטולי DNase ומעמיסים את תמיסת ה-PCR על ג'ל אגרוז של 2%. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 90 וולט במשך 60 עד 90 דקות כדי לבדוק גודל רצועה של 386 זוגות בסיס כעדות להגברה מוצלחת.כדי לטהר את ספריית ה- DNA 16S ribosomal RNA, מאגר 10 מיקרוליטרים של מוצרי PCR שהניבו רצועות בהירות ו -13 מיקרוליטרים של הדגימות שהניבו רצועות חלשות בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וטענו סביב 150 עד 200 ננוגרם של כל דגימה משולבת לבארות בודדות של ג'ל חדש של 2%. לאחר הפעלת הג'ל כפי שהודגם, יש לסלק את 386 רצועות זוג הבסיס מהג'ל ולהשתמש בערכה מסחרית כדי לטהר את הדנ"א. לאחר מכן לחמוק DNA מטוהר עם 30 microliters של 10 מילימולר טריס הידרוכלוריד ולארוז את הספריות המטוהרות בקרח יבש לפני משלוח לרצף הדור הבא.בניתוח מייצג זה, כל החילוצים למעט אחד ייקראו מוצלחים. רצועות בהירות שנצפו בעקבות הגברת PCR מצביעות על הצלחה לפרוטוקול 16S. דגימות 16S צריכות להיות מינימום של 1,000 רצפים עם לפחות 5, 000 להיות אידיאלי, בעוד דגימות metatranscriptsomic צריך להיות מינימום של 500, 000 רצפים עם לפחות 2 מיליון להיות אידיאלי.דגימות משקעים מ-21 אתרים שונים ב-13 זרמים שונים עבור 16S וניתוח מטטרן-ראת-תיאום מוצגים. מתוך אותם 21 אתרים, 12 היו במורד הזרם של פעילות סדיקה וסיווגו כשבירה הידראולית חיובית, ותשעה היו במעלה הזרם של פעילות סדיקה או בקו פרשת מים שבו סדיקה נעדרה ומסווגת כשלילית שבירה הידראולית. כפי שהוערך על ידי ניתוח PERMANOVA, ההפרדה שנצפתה בין שבירה הידראולית חיובית ונתונים שליליים עולה כי דגימות חיובי שבירה הידראולית הושפעו על ידי fracking.מנבאי היער האקראיים החשובים ביותר היו חושפים אילו תכונות היו חיוניות ביותר להבחנה נכונה של דגימות. אם טקסון מזוהה כחשוב על ידי מודל היער האקראי, פרופיל ההתנגדות האנטי מיקרוביאלית שלו בדגימות חיוביות שבירה הידראולית ניתן להשוות לפרופיל שלה בדגימות שליליות שבירה הידראולית. אם הם שונים מאוד, זה יכול להציע כי נוזל fracking המכיל biocides נכנס לזרם.חיידקים נמצאים בכל מקום, כך זיהום הוא בעיה פוטנציאלית משמעותית עם סוג זה של עבודה. שלבי ההעברה הראשוניים לדוגמה נוטים במיוחד לכך. אם מישהו מעוניין בהתכלות מיקרוביאלית או בחילוף חומרים אחר, ניתן להשתמש ברצף רובה ציד של RNA כדי לחקור ביטוי גנים מיקרוביאליים פעילים.טכניקה זו מאפשרת סטנדרטיזציה של טכניקות מולקולריות לחקירת קהילות חיידקים in-situ, כמו גם ניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני רצף חיידקים.

evaluating-impact-hydraulic-fracturing-on-streams-using-microbial

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להערכת זמינות החומרים המזינים האורגניים והאנאורגניים ואת השפע והמבנה של קהילות מיקרוביאליות וויראליות בסביבות ימיות מרוחקות.

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס ​​- מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

מחקר זה מציג שיטה החפירה לחקירת הידרולוגיים מתחת לפני הקרקע, גיאוכימיים, וההטרוגניות מיקרוביולוגיות של lysimeter אדמה. Lysimeter מדמה hillslope המלאכותי שהיה בתחילה בתנאי הומוגניות היה נתון כ -5,000 מ"מ של מים במשך שמונה מחזורים של השקיה ב תקופה של 18 חודשים.

חפירה באדמה Lysimeter עבור ההידרולוגי מצמידים, גיאוכימיות, וחקירות מיקרוביולוגיות

Cytometry זרימה בשילוב עם קיבוץ באשכולות חזותית מציע שיטה קלה לשימוש ומהיר עבור הלומדים biofilms הימית. זה יכול לשמש biofilm אפיון, זיהוי שינויים במבנה הקהילה biofilm, וזיהוי של חלקיקים והאביוטיים שמוטבע על biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

הפרוטוקול מזהה גנים מרכזיים של מחזור מתאן בביצות החוף של דרום טקסס ומדמיין את התפוצה המרחבית שלהם כדי לשפר את ההבנה של ויסות המתאן והשפעותיו הסביבתיות במערכות אקולוגיות דינמיות אלה.

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

מינרלים תגובתיים חשובים רבים נוצרים במהלך שיקום מי תהום במקום ; עם זאת, שיטות קידוח קונבנציונליות מבוססות ליבות לעיתים מציבות אתגרים באיסוף מינרלים אלו. מאמר זה מציע טכניקות לשימוש ב-Min-Trap, מכשיר דגימה פסיבי חדשני, לאיסוף ומדידה יעילה של מינרלים תגובתיים מבארות ניטור קונבנציונליות.

פריסה ושליפת דגמי מינרלים

צורות אמינות ומדויקות של ניתוח DNA שניתן לפרוס בשטח הן קריטיות לתעשיות רבות. מאמר זה מציע שתי שיטות לניתוח מיקרוביאלי סביבתי בשטח: 1) בידוד DNA מיקרוביאלי מדגימות סביבתיות באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית, ו-2) ניתוח DNA באמצעות יחידת qPCR בשטח.

ניתוח DNA מיקרוביאלי בשטח באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית ויחידת qPCR שדה

חקור את השפעת שבירה הידראולית על קהילות מיקרוביאליות בנחלים באמצעות שיטת 16S rRNA. פרוטוקול זה מספק גישה שלמה לאיסוף דגימות, חילוץ חומצות נוקליאיות וניתוח ביואינפורמטי לבחינת שינויים אקולוגיים.

הערכת ההשפעה של שבירה הידראולית על נחלים באמצעות חתימות מולקולריות מיקרוביאליות

גלה סרטונים נוספים