צואה (מיקרו) בידוד RNA

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד RNA מדגימות צואה כדי לחקור מיקרו-רנ"א. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבודד RNA מצואה באיכות ובכמות גבוהה. זה ממזער רנ"א מחיידקים חיים.

חשוב להדגיש כי והמאגר המחייב אינו משמש בפרוטוקול זה. פרוטוקול זה הוא פשוט וישיר. התחל בהשעיה מחדש של 25 עד 100 מיליגרם של דגימות צואה ב-600 מיקרוליטר של 1X DPBS סטרילי בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.

דגרו את הצינור המכיל את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן מועכים את התערובת עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד ומערבולת היטב. השעו מחדש את התערובת בהומוגנייזר עם הגדרה למחזור אחד ב-4,000 סיבובים לדקה למשך 45 שניות כדי לייעל ולהגדיל את כמות ואיכות ה-RNA.

הוסף לדגימה 600 מיקרוליטר של תמיסת פנול כלורופורם חומצה ומערבל את התערובת למשך 60 שניות. לחלופין, כדי לייעל כמות מוגברת של RNA בתפוקה, ערבבו אותו עם הומוגנייזר. צנטריפוגה של הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי להפריד בין השלב המימי לאורגני.

חזור על הצנטריפוגה עד שהממשק קומפקטי. העבירו את השלב המימי העליון בזהירות מבלי להפריע לשלב התחתון לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר עם מכסה ציר. הוסף אתנול בדרגת ACS 100% ב-1.25 x נפח הפאזה המימית הנרכשת והמערבולת למשך שלוש שניות.

הנח את מחסנית המסנן לתוך צינורות האיסוף. טען 600 מיקרוליטר מכל אחת מהדגימות במחסנית המסנן המסופקת בערכת בידוד המיקרו-RNA. צנטריפוגה בטמפרטורה של 10, 000 x גרם למשך 90 שניות לסינון התערובת דרך המחסנית.

ואז השליכו את המסנן. חזור על פעולה זו עד שכל נפח התערובת יסונן דרך אותו קרום פילטר ביישומים עוקבים. אחרי כל הדגימה מסוננת.

הוסף 700 מיקרוליטר של תמיסת שטיפת microRNA 1 לאותה מחסנית מסנן. צנטריפוגה למשך 60 שניות לסינון תמיסת הכביסה דרך מחסנית המסנן. השליכו את המסנן והניחו את מחסנית המסנן על אותו צינור איסוף.

שטפו את מחסנית המסנן עם 700 מיקרוליטר תמיסת כביסה 2/3 שהוכנה בדרגת ACS 100% אתנול וצנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה. השלך את המסנן שהתקבל והנח את מחסנית המסנן באותו צינור. שטפו את מחסנית המסנן עם 500 מיקרוליטר תמיסת כביסה 2/3 וצנטריפוגה בטמפרטורה של 10, 000 x גרם למשך דקה.

השלך את המסנן שהתקבל והנח את מחסנית המסנן באותו צינור איסוף. שטפו את מחסנית המסנן עם 250 מיקרוליטר תמיסת כביסה 2/3 שהוכנה בדרגת ACS 100% אתנול וצנטריפוגה ב-10, 000 x גרם למשך דקה. השלך את המסנן שהתקבל והנח את מחסנית המסנן באותו צינור איסוף.

לבסוף, העבירו את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש וסובבו את המכלול למשך חמש דקות כדי להסיר את הנוזל שנותר. העבירו את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז למרכז המסנן וכסו את הצינור. דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן סובב את השפופרת למשך חמש דקות ב-8,000 x g כדי לשחזר את ה-RNA לצינור איסוף חדש. בדיקת אלקטרופורזה מבוססת שבב של RNA מצביעה על כך שמבודדי RNA מייצגים מצואת עכברים ובני אדם נמוכים או חסרים בהרכבי 18S ו-28S rRNA וגודל מבודדי ה-RNA נופל באזור ה-RNA הקטן. אלקטרופורזה קטנה נוספת של RNA עם אלקטרופורזה מבוססת שבב גילתה שחלק גדול מה-RNA הם בגודל microRNA.

טוהר ה-RNA המופק היה גבוה כפי שצוין על ידי יחס הספיגה של 2.0 עבור אורכי גל של 260 ו-280 ננומטר וערך יחס של 1.8 לספיגה ב-260 ו-230 ננומטר. כדי להבטיח את הצלחת המיצוי האורגני, יש לוודא שהפנים ברורות ולהעביר רק את הפאזה המימית העליונה מבלי להפריע לשלב התחתון, גם במחיר של נפח מופחת של הפאזה המימית שלנו.