פרופיל מטבולי בעל תפוקה גבוהה לעידון מודלים של אצות מיקרו
December 4th, 2021
פרוטוקול זה מדגים את השימוש בפלטפורמת טכנולוגיית microarray פנוטיפ (PM) כדי להגדיר דרישות מטבוליות של כלמידומונס ריינהרדטי, מיקרו-ריאלגה ירוקה, ולחדד מודל רשת מטבולית קיים.
טכנולוגיית מיקרו-מערך פנוטיפ היא שיטה יעילה בתפוקה גבוהה הקובעת פונקציונלית פעילויות מטבוליות הסלולר בתגובה למגוון רחב של מטבוליטים כניסה. הניצול בטכנולוגיה זו נמדד בצורה של נשימה תאית שנקבעת על ידי כמות התפתחות הצבע המיוצרת על ידי הפחתת NADH של צבע אדום מבוסס טטרזוליום. בעבודה זו, נציג את השימוש של בדיקות מערך מיקרו פנוטיפ בהקשר של מיקרו אצות באמצעות מינים מודל כלמידומונס reinhardtii.
מטרת מחקר זה היא ליצור שיטה אמינה לאפיון פנוטיפינג מטבולי של מיקרו-אצות שניתן להשתמש בהן כדי להרחיב את מודלי הרשת המטבולית של האצות הקיימים או להנחות את השחזור של מודלים חדשים. זן כלמידומונס ריינהרדטי CC-503 ניתן להשיג ממרכז המשאבים כלמידומונס באוניברסיטת מינסוטה ארה"ב. לגדל את התאים טריס אצטט שומן מדיה שומן עד לשלב באמצע יומן.
בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם במצב טוב וללא כל זיהום. סובב את התרבות ב 2000 G-כוח במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
הכן מדיה ברז טרי המכיל 0.1% טטרזוליום סגול צבע D"הוסף אנטיביוטיקה שונה כולל טיימטין, אמפיצילין, וקנמיצין לתקשורת כדי לעכב צמיחה חיידקית. מדיה שמנה וצעד זה צריך להיות מושמט מחומרים מזינים, בהתאם לכל סוג צלחת. להשעות מחדש את הכדור ואת מדיית הברז הטרי לריכוז סופי של 1 מיליון תאים למיליליטר.
השתמש בלוחות בדיקה של מערך תרכובות כימיות, כגון מקורות פחמן, מקורות חנקן, זרחן ומקורות גופרית, ומקורות החנקן הפפטידים. לחסן 100 מיקרוליטר מספיק של מדיה עצמאית לתוך כל באר של לוחות החיבור. הקפד לשכפל את ההסתה.
יש לציין כי בשלב זה, תאים צריכים להיבדק עם כתמים גרם שלילי לפני ואחרי בדיקה כדי לפקח על זיהום חיידקי. הכנס את תרכובת כימית אזור assay לוחות לתוך מערכת קורא microplate. לדגור על כל הלוחות ב 30 מעלות עד שבעה ימים, ולתכנת את מערכת קורא המיקרו-לוח לקרוא את שינוי צבע הצבע כל 15 דקות.
כמו רוב קוראי microplate אינם מספקים מקור של אור מתמשך במהלך הדגירה, האצות צריך להיות מסוגל לבצע נשימה הטרוטרופית. לייצא את הנתונים הקינטיים גלם מקורא microplate כקבצי CSV, אשר לאחר מכן ישמש קלט לחבילת התוכנה microarray phenotype והתוכנה שלנו. כדי לבצע את ניתוח הנתונים microarray פנוטיפ, להשתמש בחבילת התוכנה מיקרו אריק OPM OmniLog הפנוטיפ הפועל בתוך סביבת תוכנת R.
ב- R studio, ממשק המשתמש הגרפי עבור R, התקן את חבילת OPM ואת יחסי התלות שלה באמצעות הפקודות המפורטות בכתב היד. נווט לספריה המכילה את קבצי ה- CSV של הנתונים הקינטיים וייבוא הנתונים באמצעות הפונקציה קרא OPM. ניתן לצבור את הנתונים הקינטיים ולהסתגר באמצעות הערכת פרמטרי pref.
השימוש ב- XY plot מאפשר למפות את מדידות ההחלמה או הצמיחה כפונקציה של זמן עבור לוחות 96-בארות. ניתן לדמיין את הנתונים כמפת חום באמצעות התוויית רמת הפונקציה כדי לאפשר סקירה השוואתית מהירה של הנתונים הקינטיים. השלב הבא הוא לזהות את התגובות והגנים הקשורים למטבוליטים החדשים.
במקרה של נוכחות של מודל קיים עבור האצות, ניתוח הנתונים ממערכת microarray פנוטיפ יכול לשמש כדי לחדד מודל זה. כאן אנו מציגים את הצינור בו השתמשנו לעידון רשת מטבולית בקנה מידה גנום עבור מודל כלמידומונס באמצעות נתוני מיקרו-array פנוטיפ. כאשר בדיקה מורכבת חדשה חיובית לניצול, פרופילי התגובה הרלוונטיים של המתחם מוגדרים באמצעות בסיס ידע מטבולי, מתן מספרי ועדת האנזים הקשורים.
הצעד הראשון הוא לחפש Kegg ו MetaCyc לזהות מספרי עמלת אנזימים, ECs, לתגובות באמצעות חילוף חומרים נמצאו מערכי תרכובות כימיות. לאחר מכן, אנו משתמשים במספרי EC המזוהים כבסיס חיפוש במשאבי ביאור אצות זמינים מרובים, כגון מכון הגנום המשותף, JGI, Phytozome ופרסומים ביקורת עמיתים. התגובות והמטבוליטים מתווספים למודל הרשת המטבולית של כלמידומונס reinhardtii מבוסס COBRA, iRC1080, כדי להרחיב ולזקק את המודל.
אם לא נמצאו ראיות גנטיות התומכות במספר EC, ניתן לבצע חיפוש מבוסס פרופיל כגון איטרטיבי ספציפי למיקום NCBI, NCBI PSI-BLAST, כדי לזהות גנים מועמדים הקשורים לתגובה. לאחר מכן התוצאות מוערכים באופן ידני. אלה העוברים שלב QC זה עם ערכי E פחות מ- 0.05 לרלוונטיות למספרי EC של החיפוש, מתווספים לאחר מכן למודל המדדי.
השלב האחרון בפרוטוקול זה הוא עידון המודל, הערכה והשוואה של המודלים. השתמש בארגז הכלים העדכני ביותר של COBRA גירסה 3.0 ובפלטפורמת MATLAB כדי לבצע את השלבים לעידון הדגם. לאחר התקנת ארגז הכלים קוברה, ניתן להוריד את דגם iRC1080.
לאחר מכן ב MATLAB, הדבר הראשון לעשות הוא לנווט לתיקיה המכילה את מודל הייחוס, iRC1080. הוסף את התגובות המזוהות עם הגנים המשויכים שלהם למודל המטבולי, כגון iRC1080, באמצעות פונקציות ארגז הכלים קוברה. הוסף תגובה ושנה שיוך גנים.
נווט לספריה המכילה את מודל iRC1080 והפעל את הפקודות כדי לטעון את המודל. שנה את שמו והוסף תגובה חדשה ואת הגן המשויך אליה. במקרים מסוימים כאשר המטבוליט אינו מיוצר תאיים, אבל נלקח מן המדיום, תגובות תחבורה עבור מטבוליטים חדשים צריך להיות נוסף למודל באמצעות פונקציית תגובת הוספה / חילופי להזין או פלט את המטבוליט לתוך המדיום החוץ תאי.
בדוק את ההתנהגות של התוצאה והמודל החדשים, לדוגמה, iBD1106, על ידי ביצוע ניתוח איזון שטף, FBA, באמצעות הפונקציה לייעל מודל CB בתנאים בהירים וכהים למקסם את הביומסה כפונקציית האובייקט. בין היתר, פתרון ה-FBA מפיק שלושה וקטורים את שטפי התגובה, את מחירי הצל של חילוף החומרים ואת התגובה מופחתת עלויות. כאן, דוגמה מסופקת כאשר מודל iRC1080 מושווה עם הגירסה המעודנת שלה, iBD1106, על ידי קבלת מחירי הצל המייצגים את הרגישות של הפונקציה האובייקטיבית ביומסה לשינויים ומטבוליטים בחשבון בכל דגם.
כאן אנו מראים עלילות XY נשימה וחלקות רמה של מקורות הפחמן ומקורות החנקן בוחנים לוחות ריקים ו- CC-503 בצבע צהבהב וסגול, בהתאמה. בתוך כל באר, עקומות נשימה מייצגות המרת צבע על ידי הפחתה כפונקציה של זמן. הפסגה המודגשת בלוח A מייצגת את גילוי אצטט כמקור הפחמן היחיד מלוח זה, אשר עולה בקנה אחד עם ספרות כלמידומונס.
ההשוואה בין מספר המטבוליטים שזוהו באמצעות שלוש שיטות שונות, iRC1080, שהוא המודל המטבולי של כלמידומונס שאוצר היטב, זמן כרומטוגרפיה הגז של הטיסה GC-TOF, ומסת המיקרו-array הפנוטיפ מראה כי רק שישה חפיפות מטבוליט בין שלושת הסטים, בעוד 149 היו נפוצים בין iRC1080 לבין ערכת הבדיקה של מיקרוארי הפנוטיפ. זה מראה כי בעוד כל טכנולוגיה יש כוח לקראת מחקר פרופיל מטבולי, ערכת בדיקות microarray פנוטיפ יכול להיות מקור משמעותי של מידע מטבולי חדש. המידע המתקבל שימש להרחבה ולחידוד מודל הרשת המטבולית iRC1080.
כאן, אנו משווים את התוכן של מודל iRC1080 ואת המודל המורחב iBD1106, כולל מספר התגובות, מספר חילוף החומרים ומספר הגנים. אנו מראים כי זיקוק המודל שלנו הוסיף מעל 254 תגובות לרשת החדשה שנוצרה. תגובות אלה מסווגות חומצות אמינו, dipeptides, tripeptides ותגובות תחבורה.
המטבוליטים שזוהו לאחרונה שימשו להרחבת רשת מטבולית ועידון המודל המטבולי הקיים של כלמידומונס ריינהרדטי. בדיקות microarray פנוטיפ יכול לשמש כדי לאפיין פנוטיפים מטבוליים של זנים קיימים ומבודדים. בנוסף, הפרוטוקול שבו השתמשנו בהקשר של אצות מיקרו יכול להנחות את עידון המודלים המטבוליים של מינים אחרים.
סקירה כללית
מחקר זה משתמש בטכנולוגיית מערך פנוטיפים כדי להעריך את הדרישות המטבוליות של Chlamydomonas reinhardtii, אצות מיקרו ירוקות לדוגמה. המחקר שואף לשפר מודלים קיימים של רשת מטבולית על ידי אפיון הפנוטיפינג המטבולי של אצות מיקרו.
רכיבים מרכזיים במחקר
תחום המחקר
- פרופיל גנטי מטבולי
- פיזיולוגיה של אצות מיקרו
- שיפור רשת מודל
רקע
- חשיבות של Chlamydomonas reinhardtii במחקר ביולוגי
- טכנולוגיית מערך פנוטיפים כשיטה מרובת תפוקה
- יישום של רשתות מטבוליות בביולוגיה של אצות
שיטות ששימשו
- ניסויי מערך פנוטיפים
- Chlamydomonas reinhardtii כאורגניזם מודל
- שימוש בצבע אוקסידציה-רדוקציה ובקורא לוחות מיקרו לאיסוף נתונים
תוצאות עיקריות
- אופיין תגובות מטבוליות למגוון מטבוליטים נכנסים
- שופר המודל המטבולי של Chlamydomonas reinhardtii
- זוהו תגובות חדשות ופרופילי אנזימים רלוונטיים
מסקנות
- פרוטוקול זה מציע גישה שיטתית לשיפור רשתות מטבוליות באצות מיקרו.
- הממצאים תורמים לקידום מודלים מטבוליים בביולוגיה של אצות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput metabolic profiling using phenotype microarray technology enables rapid refinement of genome-scale metabolic models for microalgae, addressing gaps in genomic annotation with functional biochemical evidence. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early-stage discovery by providing quantitative phenotypic data that improves model predictive confidence. The methodology is directly applicable to biopharma R&D workflows focused on algal-based bioproduction systems and metabolic engineering initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of metabolic hypotheses by linking metabolite utilization to specific reactions and genes.
- Operational Value: Provides high-throughput phenotypic data to de-risk target selection in algal metabolic engineering.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in pathway validation through experimental evidence for over 254 reactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative respiration-based readouts across diverse metabolite arrays to assess metabolic capabilities.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using NADH-dependent tetrazolium dye reduction for reproducible metabolic phenotyping.
- Strategic Value: Creates scalable, reusable platforms for screening algal strains under defined chemical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges genomic predictions with functional metabolic activity to improve model-to-phenotype translation.
- Operational Value: Enables iterative model refinement using phenotype microarray data to enhance predictive accuracy.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by identifying metabolic bottlenecks and auxotrophies in engineered strains.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional data that informs metabolic model reconstruction, guiding strain optimization and pathway validation efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating metabolite utilization with specific enzymatic reactions and gene associations.
- Screening: Delivers standardized, quantitative phenotypic outputs for assessing metabolic fitness across compound libraries.
- Analytics: Generates kinetic data suitable for flux balance analysis and shadow price calculations to identify metabolic sensitivities.
- Translational Research: Enhances model-to-phenotype continuity by incorporating experimental evidence into constraint-based models.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable protocol for metabolic profiling applicable to diverse microalgal species and mutants.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic models by expanding iRC1080 with over 254 experimentally supported reactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized inoculation, incubation, and kinetic reading protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing metabolic capabilities that inform strain suitability for bioproduction.
- Portfolio Impact: Enables risk-aware prioritization of engineering targets based on validated metabolic network expansions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, metabolic modeling, and bioinformatics for EC number annotation and model integration.
- Dependent on microplate reader systems capable of kinetic absorbance measurements and anaerobic incubation compatibility.
- Necessitates cross-team standardization between wet-lab phenotyping and computational modeling groups.
- Involves adaptation considerations for varying algal species due to differences in cell wall permeability and metabolite uptake.
- Limited by the requirement for heterotrophic respiration capability during assay incubation in the absence of continuous light.
