Name: קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: חקור הדמיה חיה של דינמיקה ציטופלסמית בביצי Xenopus laevis באמצעות תמציות ציטופלזמה לא מדוללות. שיטה זו מאפשרת מחקר של ארגון תאי ודפוסים מרחביים בציטופלזמה בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'יי קמנץ, י' צ'ן וו' י' סי הואנג על הערותיהם על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM110564, P50 GM107615 ו- R35 GM131792) שהוענקו לג'יימס א. פרל הבן.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת סטנפורד.
1. הכנת שקופיות וכיסויים
<ol><li>החל שכבה של סרט דבק אתילן פרופילן פלואוריד (FEP) על מגלשת זכוכית עם אפליקטור רולר. חותכים סרט הדבקה מוגזם על הקצוות בעזרת סכין גילוח נקי. הכינו כיסויים מצופים בנייר דבק FEP באותו אופן (איור 1A).</li>
	<li>החל מרווח הדמיה דביק דו-צדדי על הצד המצופה בסרט FEP של השקופית. השאירו את תוחם המגן בחלק העליון ללא כיסוי (איור 1A). הערה: יש להכין את השקופיות והכיסויים לפני הניסוי. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן אותם בקופסאות כדי למנוע הצטברות אבק על משטחים. עומק הבאר במרווח ההדמיה הוא 120 מיקרומטר וקוטרה 9 מ"מ.</li>
</ol>2. הכנה והדמיה חיה של תמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה
הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מדמינג וקורנבלות'19, מאריי20, סמיית' וניופורט25 עם שינויים. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת.
<ol><li>שלושה עד עשרה ימים לפני איסוף הביצים, יש להזריק נקבות בוגרות של צפרדעי Xenopus laevis באופן תת-עורי לתוך שק הלימפה הגבי עם 100 יחב"ל של גונדוטרופין בסוסה הרה (PMSG).</li>
	<li>שש עשרה עד שמונה עשרה שעות לפני איסוף הביצים המתוכנן, הזריקו לצפרדעים משלב 2.1 500 יחב"ל של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). השאירו צפרדעים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס במאגר הטלת ביצים (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2·2H2 O, 0.5 mMHEPES, 0.1 mM EDTA, הכינו כפתרון מלאי 20x ב- pH7.4 ודללו עם מי מיכל צפרדע נקיים עד פי 1 לפני השימוש) עד לאיסוף הביצים.</li>
	<li>ביום הניסוי, אספו ביצים בצלחת פטרי זכוכית גדולה ובדקו את איכות הביצים. השליכו את כל הביצים שנראות כמו כדורים לבנים נפוחים או מופיעות בחוט (איור 1B). בחנו את הביצים תחת סטריאוסקופ, שמרו על הביצים בעלות מראה תקין (איור 1C), והשליכו אותן עם פיגמנט לא סדיר או מנומר (איור 1D). הערה: פרוטוקול זה עובד עם ביצים שנאספו מצפרדע בודדת, אשר בדרך כלל מטילה 25 מ"ל של ביצים על ידי 16 שעות לאחר הזרקת hCG. בדרך כלל, סך של 3 עד 6 צפרדעים מושרות על ידי hCG, ואת הצפרדע עם איכות הביצים הגבוהה ביותר נבחר לניסוי הכנת תמצית.</li>
	<li>מעבירים ביצים לכוס זכוכית של 400 מ"ל, ומסירים כמה שיותר חיץ מטיל ביצים על ידי פירוק.</li>
	<li>לדגום את הביצים ב-100 מ"ל של תמיסת דג'ל טרייה (2% עם L-ציסטאין במים, להסתגל ל-pH 8.0 עם NaOH) ולסובב אותן בעדינות מעת לעת. לאחר כ-3 דקות, יוצקים את התמיסה, ומוסיפים 100 מ"ל של תמיסת דג'לי טרייה. ממשיכים את הדגירה עד שהביצים ארוזות היטב (אין רווח בין הביצים), אך הימנעו מהשארת ביצים בתמיסת הפסולת למשך יותר מ-5 דקות בסך הכל.</li>
	<li>הסר כמה שיותר מתמיסת ההרגעה על ידי פירוק, ושטוף את הביצים בחיץ MMR 0.25x (25 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.25 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl2, 0.025 mM EDTA, 1.25 mM HEPES, מוכן כתמיסת מלאי 10x, מותאם ל- pH 7.8 עם NaOH, ומדולל במי Milli-Q לפני השימוש) על ידי הוספת המאגר, מערבלים את הביצים, ואז שופכים את החיץ. חזרו על הפעולה מספר פעמים עד לשימוש כולל של 1 ליטר מהמאגר לשטיפה.</li>
	<li>שטפו את הביצים מספר פעמים עם סך של 400 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים (250 מ"מ סוכרוז, 10 מ"ל HEPES, 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl2, 1 mM DTT, עשוי טרי ומותאם ל- pH 7.7 עם KOH). הסר ביצים עם מראה חריג באמצעות פיפטה פסטר בין השטיפות. הערה: ביצים עם מראה לא תקין מתייחסות לאלה שנראות כמו כדורים נפוחים לבנים (איור 1B), שיש להן פיגמנטציה מנומרת (איור 1D), מתדרדרות עם אזור לבן שגדל (איור 1E), או מראות אזור פיגמנטי כהה ומכווץ בחצי הכדור של בעלי החיים (איור 1F).</li>
	<li>באמצעות פיפטה העברה עם קצה פתוח לרווחה, מעבירים את הביצים לצינור צנטריפוגה עגול-תחתון 17 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים. סובבו את הצינור בצנטריפוגה קלינית בגודל 400 x גרם למשך 15 שניות כדי לארוז את הביצים.</li>
	<li>הסירו כמה שיותר ממאגר התסיסה של הביצים מהחלק העליון של ביצים ארוזות בעזרת פיפטה של פסטר. הערה: חשוב להסיר כמה שיותר חיץ מהביצים הארוזות, על מנת למזער את דילול תמצית הביצית. לפעמים יש צורך להסיר כמה ביצים רופפות יחד עם החיץ השיורי כדי להשיג זאת.</li>
	<li>קבעו את הנפח המשוער של הביצים הארוזות, ולאחר מכן הוסיפו 5 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל לאופטין, 5 מיקרוגרם/מ"ל ציטוכלזין B ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד ישירות על גבי הביצים הארוזה. הערה: אפרוטינין ולאופפטין הם מעכבי פרוטאז. ציטוכלזין B מעכב פולימריזציה של אקטין, ומונע מהתמצית להתכווץ ולג'ל26. ציקלוהקסימיד מעכב סינתזת חלבונים, ובכך שומר על התמצית באינטרפאזה של מחזור התא.</li>
	<li>מרסקים את הביצים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב 12,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות, ברוטור דלי מתנדנד. הערה: בסוף הצנטריפוגה, הביצים היו צריכות להיקרע והליזאט הופרד לשלוש שכבות עיקריות: שכבת שומנים צהובה למעלה, תמצית ציטופלסמית (הנקראת גם תמצית גולמית) באמצע, ושכבה צפופה כהה המכילה את גרגירי הפיגמנט בתחתית (איור 1G).</li>
	<li>חברו מחט באורך 18 מ"מ למזרק. כאשר שיקוע קצה המחט פונה כלפי מעלה, לנקב את הצינור מהצד בתחתית השכבה הציטופלסמית, ולשחזר את התמצית על ידי ציור לאט. הערה: יש לשאוב את התמצית הציטופלסמית באיטיות כדי למנוע הכללה של תוכן מזהם משכבת השומנים הצהובה.</li>
	<li>העבירו את התמצית הציטופלסמית המשוחזרת לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והחזיקו אותה על קרח. השתמש בתמצית תוך שעה.</li>
	<li>כשאתם מוכנים לתמונה, השלימו את התמצית עם הריאגנטים הרצויים ובדיקות הדמיה פלואורסצנטיות. הערה: בדיקות הדמיה פלואורסצנטיות מסמנות מבנים ציטופלסמיים ספציפיים כך שניתן לדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>הסר את תוחם המגן העליון ממרווח ההדמיה בשקופית שהוכנה בשלב 1.2, והפקיד כ -7 μL של תמצית במרכז הבאר. יש למרוח מיד את הכיסוי המצופה בנייר דבק של FEP כאשר צד ה-FEP פונה לתמצית כדי לאטום את הבאר. המשיכו במהירות להדמיה (איור 1H,I).</li>
	<li>הנח את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך או זקוף עם במה ממונעת ומצלמה דיגיטלית. צלמו את החלציות במיקומים המרחביים ובמרווחי הזמן הרצויים, הן בערוצי השדה הבהיר והן בערוצים הפלואורסצנטיים. הערה: בדרך כלל, מטרה פי 5 משמשת להדמיה. השלב הממונע מאפשר קליטת תמונה אוטומטית במספר מיקומים מרחביים מוגדרים. מיקרוסקופיית שדה בהיר מדמיינת מבנים ציטופלסמיים עם דרגות שונות של שקיפות. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ממחישה את המבנים הציטופלסמיים שסומנו במיוחד על ידי בדיקות ההדמיה הפלואורסצנטיות שנוספו בשלב 2.14. המצלמה מתעדת תמונות בהילוך מהיר של מבנים אלה, ובכך לוכדת את הדינמיקה של הארגון הציטופלסמי.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li>
<li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF%2C+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li>
<li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li>
<li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li>
<li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li>
<li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+polymerization+dynamics%2C+opposed+motors%2C+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li>
<li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li>
<li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).</li>
<li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly%2C+DNA+replication%2C+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li>
<li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li>
<li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li>
<li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li>
<li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li>
<li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li>
<li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li>
<li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li>
<li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li>
<li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תמציות הביצים של Xenopus laevis התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקרים מבוססי הדמיה של מבנים תת-תאיים שונים 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 וארגון ציטופלסמי בכללותו</sup...

הציטופלסמה מהווה את הנפח העיקרי של התא ויש לה ארגון מובחן. המרכיבים של הציטופלסמה האאוקריוטית יכולים להרכיב את עצמם למגוון רחב של מבנים מרחביים, כגון אסטרים מיקרוטובולים ומנגנון גולג'י, אשר בתורם מסודרים באופן דינמי ומתהפכים בהתאם לזהות התא ולמצבו הפיזיולוגי. הבנת הארגון המרחבי של הציטופלסמה והקשר שלה לתפקודים תאיים חשובה אפוא להבנת אופן הפעולה של התא. תמציות ביצים של Xenopus laevis שימשו באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת 1,2,3,4,5,6,7,8, אך עבודה אחרונה מבססת אותן כמערכת הדמיה חיה רבת עוצמה למחקרים מכניסטיים של מבנים ציטופלסמיים ותפקודם התאי 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. תמציות לא מדוללות אלה משמרות מבנים ותפקודים רבים של הציטופלסמה, תוך שהן מאפשרות מניפולציות ישירות של תוכן ציטופלסמי שאינו ניתן להשגה במודלים קונבנציונליים מבוססי תאים19,20. זה הופך אותם לאידיאליים לאפיון תופעות ציטופלסמיות ולניתוח היסודות המכניסטיים שלהם.
שיטות קיימות להדמיה של תמציות דורשות שינויים כימיים בפני השטח, או ייצור של התקנים מיקרופלואידיים. שיטה אחת המבוססת על כיסוי דורשת פסיבציה של פוליאתילן גליקול (PEG) של כיסויי זכוכית21. שיטה מבוססת מיקרו-אמולסיה דורשת תצהיר אדים של טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן על משטחי זכוכית22,23. מערכות מבוססות מיקרופלואידיקה מאפשרות שליטה מדויקת בנפח, בגיאומטריה ובהרכב של טיפות החילוץ, אך דורשות מתקני מיקרו-פבריקציה מיוחדים11,12,24.
כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיית תמציות ביצים קלה ליישום ומשתמשת בחומרים זמינים ובעלות נמוכה. זה כולל הכנת תא הדמיה עם שקופית וכיסוי מצופה בסרט אתילן פרופילן פלואוריד (FEP). התא יכול לשמש להדמיית תמציות עם מגוון מערכות מיקרוסקופיה, כולל סטריאוסקופים ומיקרוסקופים זקופים והפוכים. שיטה זו אינה דורשת טיפול כימי במשטחים תוך השגת בהירות אופטית דומה המתקבלת בשיטות קיימות מבוססות זכוכית שנדונו לעיל. הוא נועד לדמות שכבה של תמציות בעובי אחיד על פני שדה דו-ממדי, וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לדמות נפח תלת-ממדי של תמציות. הוא מתאים היטב להדמיה בהילוך מהיר של התנהגות ציטופלסמית קולקטיבית על פני שדה ראייה גדול.
השתמשנו בתמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה כדי להדגים את שיטת ההדמיה שלנו. הכנת התמצית עוקבת אחר הפרוטוקול של דמינג וקורנבלות'19. בקצרה, ביצים שנעצרו באופן טבעי במטאפאזה של מיוזה II נמעכות על ידי ספין במהירות נמוכה. ספין זה משחרר את הציטופלסמה ממעצר מיוטי ומאפשר לתמצית להמשיך לאינטרפאזה. בדרך כלל, ציטוכלזין B מתווסף לפני ספין הריסוק כדי לעכב היווצרות F-אקטין. עם זאת, ניתן להשמיט אותו אם רוצים F-actin. ציקלוהקסימיד מתווסף גם לפני ספין הריסוק כדי למנוע מתמצית האינטרפאזה להיכנס למיטוזה הבאה. התמציות ממוקמות לאחר מכן בתאי ההדמיה הנ"ל ומונחות על מיקרוסקופ. לבסוף, תמונות מתועדות לאורך זמן במרווחי זמן מוגדרים על ידי מצלמה המחוברת למיקרוסקופ, ומייצרות סדרות תמונות בהילוך מהיר הלוכדות את ההתנהגות הדינמית של התמצית בשדה דו-ממדי.

<table><tbody><tr><td>17 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>22x22 מ"מ מרובע #1 כיסוי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>284522</td><td></td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>מיליפורסיגמא</td><td>מעכב פרוטאז</td><td>10236624001</td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד</td><td>MilliporeSigma</td><td>01810</td><td>מעכב סינתזת חלבון</td></tr><tr><td>ציטוכלזין B</td><td>MilliporeSigma</td><td>C6762</td><td>אקטין מעכב פילמור</td></tr><tr><td>נקבה Xenopus laevis צפרדעים</td><td>Nasco</td><td>LM00535MX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent HiLyte 488 עם תווית חלבון טובולין</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL488M-A</td><td>להמחשת שלד התא של המיקרו-צינוריות</td></tr><tr><td>פלואורסצנטי HiLyte 647 שכותרתו חלבון טובולין</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M-A</td><td>להמחשת שלד הציטו של המיקרו-צינוריות</td></tr><tr><td>אתילן פרופילן פלואור (FEP) קלטת שקופה אופטית</td><td>CS Hyde Company</td><td>23-FEP-2-5</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית פסטר</td><td>פיפטה פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>מרחב הדמיה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70327-8S</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>MilliporeSigma</td><td>11017101001</td><td>מעכב פרוטאז</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>12-518-100B</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>MilliporeSigma</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker אדום CMXRos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7512</td><td>להדמיית מיטוכונדריה</td></tr><tr><td>סוסה בהריון סרום גונדוטרופין (PMSG)</td><td>BioVendor</td><td>RP1782725000</td><td></td></tr><tr><td>מוליך רולר</td><td>אמזון</td><td>B07HMBJSP8</td><td>למריחת סרט ה-FEP על שקופיות הזכוכית והכיסויים</td></tr><tr><td>סכיני גילוח חד-פיפיות</td> פישר <td>סיינטיפיק</td><td>12-640</td><td>להסרת קלטת FEP מוגזמת</td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr></tbody></table>

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

תמציות הביצים של Xenopus laevis , המשמשות באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת, התגלו ככלי רב עוצמה המבוסס על הדמיה לחקר תופעות ציטופלסמיות, כגון ציטוקינזיס, היווצרות צירים מיטוטיים והרכבת הגרעין. בהתבסס על שיטות מוקדמות שדיימו תמציות קבועות שנדגמו בנקודות זמן דלילות, גישות אחרונות לתמציות חיות של תמונות באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן, וחושפות תכונות דינמיות יותר עם רזולוציה טמפורלית משופרת. שיטות אלה דורשות בדרך כלל טיפולי שטח מתוחכמים של כלי ההדמיה. כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיה חיה של תמציות ביצים שאינן דורשות טיפול כימי בפני השטח. הוא פשוט ליישום ומשתמש בחומרים מתכלים מעבדתיים בייצור המוני להדמיה. אנו מתארים מערכת שיכולה לשמש הן למיקרוסקופיה רחבת שדה והן למיקרוסקופיה קונפוקלית. הוא מיועד להדמיית תמציות בשדה דו-ממדי (דו-ממדי), אך ניתן להרחיבו בקלות להדמיה בתלת-ממד. הוא מתאים היטב לחקר היווצרות תבניות מרחביות בתוך הציטופלסמה. בעזרת נתונים מייצגים, אנו מדגימים את הארגון הדינמי הטיפוסי של מיקרוטובולים, גרעינים ומיטוכונדריה בתמציות אינטרפאזה שהוכנו בשיטה זו. נתוני תמונה אלה יכולים לספק מידע כמותי על דינמיקה ציטופלסמית וארגון מרחבי.

ניתן להשתמש בתמציות ביצים של Xenopus laevis כדי לחקור את הארגון העצמי של הציטופלסמה במהלך interphase. איור 2A מראה תוצאות מניסוי מוצלח. הוספנו תמציות אינטרפאזה עם גרעיני זרע 19 שעברו דה-ממברן של Xenopus laevis בריכוז של 27 גרעינים/μL ו-GST-GFP-NLS מטוהרים בנפח של 0.38 מיקרומטר בריכוז של 27,28,29,30 (חלבון היתוך המורכב מגלוטתיון-S-טרנספראז</su...

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

שיטה זו מתאימה להדמיה חיה של דינמיקה ציטופלסמית באמצעות תמציות ביצי צפרדע, ומאפשרת לחקור מידע על תבניות מרחביות בציטופלסמה. ניתן לעצב דגימות לשכבה בעובי אחיד וניתן לכוונון, ולהצטלם על פני שדה דו-ממדי או אמצעי אחסון תלת-ממדי. שיטה זו היא חסכונית וקלה ליישום.התחל על ידי החלת שכבה של סרט דבק FEP על שקופית זכוכית עם אפליקטור רולר. חותכים סרט הדבקה מוגזם על הקצוות בעזרת סכין גילוח נקי. לאחר מכן, הכינו תלושי כיסוי מצופים בנייר דבק FEP באותו אופן.לאחר מכן החל מרווח הדמיה דביק דו-צדדי על הצד המצופה בנייר דבק FEP של המגלשה והותיר את תוחם המגן ללא כיסוי. מעבירים ביצים לכוס זכוכית של 400 מיליליטר ומסירים כמה שיותר חיץ מטיל ביצים על ידי דקנטינג. לאחר מכן לדגור את הביצים ב 100 מיליליטר של פתרון dejellying מוכן טרי בעדינות לסובב אותם.לאחר כשלוש דקות, לשפוך את הפתרון ולהוסיף 100 מיליליטר של תמיסת dejellying טרי. ממשיכים את הדגירה עד שהביצים ארוזות היטב, אך הימנעו מהשארת ביצים בתמיסת הפסולת למשך יותר מחמש דקות בסך הכל. לאחר הדגירה, להסיר את תמיסת dejellying ככל האפשר ולשטוף את הביצים במאגר MMR 0.25x.מערבבים את הביצים, ואז שופכים את החיץ. חוזרים על הפעולה כמה פעמים עד שמשתמשים בסך הכל בליטר אחד של החיץ לשטיפה. לאחר מכן, לשטוף את הביצים כמה פעמים עם סך של 400 מיליליטר של ביצה lysis buffer, הסרת ביצים חריגות בין שטיפות.לאחר מכן השתמש בפיפטה העברה עם קצה חתך רחב כדי להעביר את הביצים לצינור צנטריפוגה תחתון עגול של 17 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ תזה של ביצה. סובבו את הצינור בצנטריפוגה קלינית במשקל 400 גרם למשך 15 שניות כדי לארוז את הביצים. לאחר מכן להסיר כמה שיותר של חיץ תזה ביצה באמצעות פיפטה פסטר.קבע את הנפח המשוער של הביצים הארוזה. לאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוגרם למיליליטר כל אחד של אפרוטינין, leupeptin ו cytochalasin B ו 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר של cyclohexamide ישירות על גבי הביצים הארוזה. לרסק את הביצים על ידי centrifusing את הצינור במשך 15 דקות ב 12, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.לאחר מכן, חבר מחט 18 מד למזרק. כאשר שיקוע קצה המחט פונה כלפי מעלה לנקב את הצינור מהצד בתחתית השכבה הציטופלסמית ולשחזר את התמצית על ידי ציור איטי. מעבירים את התמצית הציטופלסמית המשוחזרת לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ושומרים אותה על הקרח.כאשר אתם מוכנים לתמונה, השלימו את התמצית עם הריאגנטים הרצויים ובדיקות הדמיה פלואורסצנטיות. הסר את תוחם המגן העליון ממרווח ההדמיה על המגלשה המוכנה והפקיד כשבעה מיקרוליטרים של תמצית במרכז הבאר. יש למרוח מיד את הכיסוי המצופה בנייר דבק FEP כאשר צד ה-FEP פונה לתמצית כדי לאטום את הבאר ולהמשיך במהירות להדמיה.הנח את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך או זקוף עם במה ממונעת ומצלמה דיגיטלית. צלמו את החלצות במיקומים המרחביים הרצויים במרווחי זמן הן בערוצי שדה בהיר והן בתעלות פלואורסצנטיות. כאן מוצג ניסוי בהילוך מהיר תוך שימוש בתמציות ביצים של xenopus laevis כדי לחקור את הארגון העצמי של הציטופלסמה במהלך אינטרפאזה.לאחר כ-20 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר נראו אזורים שהתרוקנו מאור מפזר רכיבים ציטופלסמיים הן בשדה הבהיר והן בתעלות המיטוכונדריה. בטמפרטורת החדר של כ-60 דקות, יש לבסס היטב תבנית מרחבית המורכבת מתאים דמויי תאים, כאשר מיקרוטובולים יוצרים מבנה חלול דמוי זר ומיטוכונדריה מחולקת בבירור לכל תא. השוואה של ביצועי התמצית בתאי הדמיה עם ובלי קלטות FEP על זכוכית מוצגת כאן.בתא העשוי מזכוכית מודבקת FEP התמצית מאורגנת בעצמה לתבניות רגילות דמויות תאים. בתא שבו משטחי הזכוכית לא כוסו על ידי סרט ה-FEP, התמצית הראתה תבניות חריגות של שדה בהיר ומיקרוטובולים שהשתבשו יותר ויותר עם הזמן. לא נצפו הבדלים משמעותיים ביבוא הגרעיני של חלבון GST-mCherry-NLS.הדברים החשובים שיש לזכור הם להעביר את משטחי הזכוכית עם סרט הדבקה FEP ולהסיר את כל הביצים הרעות במהלך הכנת החילוץ. בעזרת מערכת זו אנו יכולים לשלוט בקלות בעובי דגימת החילוץ, ובכך לסלול את הדרך להדמיית תבניות ציטופלסמיות בתלת-ממד, באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור.

xenopus-laevis-egg-extract-preparation-live-imaging-methods-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גולמי ו מופרדים תמציות Xenopus ביצה יכול לשמש כדי לספק חומרי ומשחזר תהליכים תאיים לניתוח מורפולוגיים ביוכימיים. תמוגה ביצה צנטריפוגה ההפרש משמשים להכנת תמצית גולמי אשר בתורו בתוך המשמשים להכנת תמציות מופרדים וההכנות קרום אור.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

מנגנונים של קנה מידה תאי ותוך-תאי נותרו חמקמקים. השימוש בתמציות עוברי קסנופוס הפך נפוץ יותר ויותר כדי להבהיר מנגנונים של ויסות גודל האברונים. שיטה זו מתארת הכנת תמצית עובר ובדיקת קנה מידה גרעינית חדשה שבאמצעותה ניתן לזהות מנגנונים של ויסות גודל גרעיני.

Assay חינם-נייד באמצעות<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

חקור הדמיה חיה של דינמיקה ציטופלסמית בביצי Xenopus laevis באמצעות תמציות ציטופלזמה לא מדוללות. שיטה זו מאפשרת מחקר של ארגון תאי ודפוסים מרחביים בציטופלזמה בזמן אמת.

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

גלה סרטונים נוספים