Name: זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינגקציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: למדו מיקרו-אינג'קציה של CRISPR/Cas9 בזבובי חול (Phlebotomus papatasi) ליצירת מוטציות מכוונות. פרוטוקול זה מסביר איסוף עוברים, הזרקה וגידול חרקים לחקר גנים בבעלי חיים מעבירי מחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לוונסה מלדנר-הארל על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

השימוש בעכברים כמקור דם להאכלת זבוב חול נעשה בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIAID, NIH (מספר פרוטוקול LPD 68E). חסרי חוליות אינם מכוסים תחת הנחיות NIH.
1. הכנת מחט (איור 1)
<ol><li>משוך מחטים ושיפוע כמתואר ב Meuti והארל19. בקצרה, משוך מחטים על משיכת מיקרופיפט זכוכית דו-שלבית, באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט.</li>
	<li>לחדד את המחטים על ידי שיפוע רטוב על שיפוע micropipette, באמצעות אבן עדינה נוספת.</li>
</ol>2. אוסף עוברים ומיקרומניפולציה (איור 2)
<ol><li>חמישה ימים לפני יום ההזרקה, נקבות חול מאכילות דם עפות כפי שהן מבוצעות באופן שגרתי לתחזוקת המושבה. לפרטים על מושבות זבוב חול גידול נהלים וחומר נדרש, אנא עיין עו"ד ואח'1 לשמור על החרקים באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל התפתחותם.<ol>
<li>יום אחד לאחר האכלת הדם, ללכוד נקבות שניזונו בדם על ידי קבוצות של 100-150 בסירי גבס עם נמל צדדי. לשמור על הנקבות על ידי האכלת אותם עם תמיסת סוכר (30% סוכרוז – נפח מספיק כדי להשרות כדור כותנה קטן) וזה הרגיל לתחזוקת המושבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 2-3 לאחר האכלת הדם, אין להרטיב את סירי הגבס. שמירה על הנקבות על מצע יבש תמנע הטלת ביצים מוקדמת, שכן הנקבות מעדיפות להטיל ביצים על סביבה לחה.</li>
	<li>ביום 5 לאחר האכלת הדם, לבצע את אוסף העובר, מיקרומניפולציה, microinjection. הכניסו נייר סינון לח לתא הטלת הביצים. לעוברים טריים אין כוריון מפותח לחלוטין והם נראים לבנים. השתמש בנייר סינון שחור במהלך ההליך כדי להקל על הדמיית העוברים הלבנים.</li>
	<li>מעבירים קבוצה קטנה של נקבות מסיר הגבס לתא הטלת הביצים דרך היציאות הצדדיות באמצעות שאיפת פה. נוכחותו של מצע לח (נייר הסינון) גורם לנקבות לביצית.</li>
	<li>לאחר 30-60 דקות, בזהירות לאחזר את נייר המסנן עם עוברים שהונחו לאחרונה מן התא. שומרים את נייר הסינון והעוברים בצלחת פטרי עד 3 שעות. במהלך תקופה זו, להעריך באופן קבוע את רמת הלחות של נייר המסנן כדי להבטיח שהוא נשאר לח. במהלך תקופה זו, לחזור על שלבים 2.4 כדי 2.6 עם קבוצות חדשות של נקבות ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר.</li>
	<li>מכינים שקופיות מיקרוסקופ להזרקה: אוספים ידנית את הביצים אחת אחרי השנייה עם מברשת צבע עדינה מאוד ומעבירים אותן בזהירות לחתיכה אחרת של נייר סינון שחור לח שהונח על מגלשת מיקרוסקופ ומעליה כיסוי זכוכית.<ol>
<li>מוסיפים מים לנייר הסינון, מספיק כדי לשמור על העוברים לחים אך לא גורמים להם לצוף הרחק מהכיסוי או להישאב מתחת לכיסוי. תסדר את העוברים כנגד הכיסוי. העטיפה משמשת כפסע אחורי המונע מהביצים להתגלגל במהלך ההזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. זריקות עוברים (איור 3)
<ol><li>התחל זריקות 2.5 עד 3 שעות לאחר תחילת איסוף הביצים. בצעו זריקות בטמפרטורת החדר ובלחות המעבדה הסביבתית.</li>
	<li>ודאו שלעוברים המיושרים יש מספיק מים כדי שהם יישמרו לחים. הערה: זה קריטי כי העוברים נשמרים לחים במהלך הזריקות. אם הם לא לחים במהלך תהליך ההזרקה, זריקות להיות קשה כי המחט מתקשה פירסינג העובר. כמות המים הנכונה היא הנקודה שבה לעוברים יש מניסקוס של מים סביבם, אך הכיסוי אינו צף על גבי המים וגורם לעוברים לדחוף מתחת לכיסוי. זה קריטי כדי לפקח על כמות המים סביב העוברים במהלך זריקות. מוסיפים מים לפי הצורך כדי לשמור על העוברים לחים.</li>
	<li>מוסיפים מים בזהירות על ידי הרטבת מברשת עם מים והעברת המים לקצה האחורי של נייר המסנן. הוספת מים בצורה זו מאפשרת להוסיף מים בצורה איטית ומבוקרת, כך שרק מספיק מתווסף כדי לשמור על העוברים לחים. יותר מדי מים יכולים לגרום לעוברים לצוף מחוץ ליישור, מה שמקשה על הזרקת העוברים.</li>
	<li>תערובת הזרקת עומס גב לתוך מחט microinjection. הוסף כ 0.5 כדי 1 μL של תערובת הזרקה לתוך המחט באמצעות מילוי מחט borosilicate מצויר ביד, טיפים צינור טעינת ג'ל ניתן להשתמש גם. תערובת ההזרקה מורכבת RNA מדריך אחד או יותר (80 ng / μL כל אחד) שנועד למקד לוקוס ספציפי מעורבב עם חלבון Cas9 רקומביננטי מסחרי (300 ng / μL).</li>
	<li>החל מלחץ ההזרקה ב 30 psi, לחץ על ההדק ההזרקה כדי לגרש אוויר מקצה המחט. זה יאלץ את תערובת ההזרקה לקצה המחט ומאפשר לתערובת ההזרקה לזרום. בשלב זה, לאט להגדיל את הלחץ להחזיק / קבוע עד חומר ההזרקה מתחיל לזרום, ולאחר מכן לסגת להחזיק / לחץ קבוע, כך שהוא ממש מתחת לנקודת תערובת ההזרקה זורם מן המחט. ההגדרה מגודרת צריך לספק רק מספיק חומר הזרקה, כך כמות קטנה של חומר ניתן לראות להיכנס העובר. הערה: הזרקת עוברים זבוב חול תחת שמן halocarbon דומה לפרוטוקולים אחרים המשמשים Drosophila ו יתושים נבדק בתחילה, אולם אחוז ההישרדות עבור זריקות אלה היה נמוך מאוד. ההישרדות שופרה על ידי מעבר לזריקות על נייר סינון לח כמתואר לעיל.</li>
	<li>הכנס את המחט לצד העובר. השתמש בכיסוי מאחורי העובר כמו backstop אשר יסייע המחט לנקב את העובר. לספק כמות קטנה של תערובת הזרקה לתוך העובר לפני בעדינות להסיר את המחט.</li>
	<li>מיד לאחר הסרת המחט, לחץ על המזרק כדי להסיר כל חומר ממולא לאחור מקצה המחט. זה יעזור למנוע את המחט סתימת.</li>
	<li>המשך לעובר הבא. בין כל זריקה, ודא כי נייר המסנן לח והמחט אינה סתומה.</li>
	<li>לאחר שכל העוברים הוזרקו, לספור את מספר העוברים מוזרקים כדי לשמור על ספירת ריצה.</li>
	<li>הסר את הכיסוי על-ידי הוספת מים לנייר הסינון כך שהכיסוי יצוף. בשלב זה, השתמש בבדיקה (מקל אפליקטור עץ עם סיכת חרק מודבק לקצה) כדי להחזיק את נייר המסנן במקום בעוד אצבע משמשת כדי למשוך את הכיסוי מן העוברים מוזרקים.</li>
	<li>מחק מים עודפים מנייר הסינון לאחר הסרת העטיפה.</li>
</ol>4. גידול לאחר הזרקה (G0) (איור 4)
<ol><li>מעבירים את נייר המסנן עם העוברים על גבי מספר שכבות של נייר סינון לח הממוקם בצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. שמור את העוברים כאן בזמן הדרוש כדי להזריק עוברים אחרים. עוברים יכולים להיות מוחזקים לכל היותר 3 שעות כאלה. לאחר ההזרקה הם יהפכו לאט חום.</li>
	<li>לאחר כל העוברים הוזרקו, להעביר אותם באופן ידני על סירי גבס בגודל קטן לח בעבר. אין לשים יותר מדי עוברים בכל סיר ולשמור על מרחק ביניהם, כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי בין אנשים. מכסים את הסירים במסך ומאחסנים אותם כפי שנעשה בדרך כלל עבור ביצי מושבת זבוב חול, המתוחזקות באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל הפיתוח שלהם.</li>
	<li>ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הסר את כל העוברים הפגומים והמתים עם מברשת צבע. הוסף 100 μL של 0.5% חומצה propionic, טיפה אחר טיפה, על סירי טיח המכילים את העוברים מוזרקים להגביל זיהום פטרייתי. שחרור ציטופלסמה מעוברים שנפגעו במהלך תהליך ההזרקה הוא חיובי במיוחד לצמיחה פטרייתית.</li>
	<li>בדוק את סירי הגבס כל יום ולהסיר את כל העוברים רעים או מתים. אם פטרייה קיימת, להסיר את כל העוברים הנגועים ולהוסיף כמה טיפות של 0.5% חומצה propionic.</li>
	<li>הזחלים בוקעים בין היום ה-8 ל-12 לאחר ההזרקה. פעמיים ביום, להעביר את הזחלים החדשים הגיח על סירי גבס חדשים, בקבוצות של 5-10 מקסימום. מוסיפים כמות קטנה של מזון ולבדוק את האוכל 2-3 פעמים בשבוע.<ol>
<li>בזהירות לפקח על כמות המזון הזחל, כמו יותר מדי מגדיל מאוד את הסיכון לזיהום פטרייתי. זחלי זבוב חול לשרוד טוב יותר בקבוצות עם זאת הם יכולים להיות קניבליים אם אין מספיק מזון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר הזחלים גורים, להפריד אותם על ידי מין כדי לשמור על הנקבות כמו בתולות. אם יש הרבה ניצולים, להשליך את הזכרים ולשמור רק את הנקבות. הערה: זכרים ונקבות כאחד יכולים לשאת ולהעביר מוטציות. עם זאת, כמו נקבות צריך להישמר בתולות לפני שהם להיות חצה, קל יותר להשתמש רק G0 מוזרק נקבות, כדי למנוע צורך להפריד wt חרקים על ידי מין. זכרי G0 יכולים להישמר כגיבוי אם מספר הניצולים הבוגרים נמוך ובמקרה זה יוזדווגו עם נקבות בתולות ממוינות.</li>
</ol>5. בחירה והקרנה של אללים מוטנטים (איור 5)
<ol><li>המוני לחצות את נקבות G0 עם זכרים wt בכלוב. דם להאכיל אותם לגמרי, כפי שנעשה לתחזוקת מושבה נורמלית.</li>
	<li>יום אחד לאחר האכלת הדם, להעביר כל נקבת G0 עם 2-3 זכרים wt לתוך צינורות גבס בודדים באמצעות שאיפה בפה. להאכיל את הזבובים עם סוכר על כדור כותנה קטן השתנה כל יום ולהשתמש במזרק מים כדי להבטיח את לחות הטיח מתאים הטלת ביצה.</li>
	<li>לאחר נקבות G0 הטילו ביצים (המקביל G1), לאסוף את גופם בודדים, מבואר צינורות Eppendorf עבור genotyping מאוחר יותר. לשמור על העוברים כפי שנעשה בדרך כלל עבור מושבות wt.</li>
	<li>לחלץ את ה-DNA מן הנקבות G0 בשיטת הבחירה.</li>
	<li>לסנן את ה-DNA לנוכחות של מוטציות, למשל על ידי עיצוב PCR assay באמצעות פריימרים המקיפים את האזור של חתכים CRISPR צפוי.</li>
	<li>שמור רק את עוברי G1 שהונחו על ידי נקבות G0 מראה ראיות לשינוי. כאשר עוברים אלה G1 לפתח גלמים, להפריד אותם על ידי מין ולשמור רק את הנקבות. לחצות את נקבות G1 מאותה נקבת G0 לזכרים wt, להאכיל אותם בדם, ואז להעביר בקבוצות קטנות של 2-3 נקבות ו 4-5 זכרים לתוך מיכלים בגודל קטן. הערה: כל האנשים G1 יש סיכוי לשאת מוטציה ייחודית, אז אם מספר האנשים ששרדו הוא לא גבוה מדי אז עדיף לחצות G1 נקבות בנפרד עם זכרים wt. המקרה של מספר נקבות הנושאות מוטציה שונה נוכח בצינור זהה הוא נדיר אבל יכול להתרחש. אם מקרה כזה נצפה לאחר genotyping, נקבות צאצאי G2 אז צריך להיות מזדווג בנפרד עם זכרים wt. ערכת הזדווגות זו מונעת את האפשרות של מוטציות מרובות בצאצאים.</li>
	<li>לאחר הטלת ביצים, לאסוף את הגופות הנשיות G1 ולסנן אותם מוטציות. שמור רק את הצינורות שבהם לפחות נקבה אחת הראתה ראיות למוטציה.</li>
	<li>במשך דורות מאוחרים יותר לעשות זוג אחד בצלבים. לאחר הטלת ביצים, הורים מסך לנוכחות של מוטציה. חזרו על הפעולה בכל דור עד ששני ההורים יהיו הומוזיגיים לאותה מוטציה. ברגע שזוהו, הם יהיו המייסדים של מלאי מוטנטים הומוזיגי.</li>
</ol>

<ol><li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42(2017).</li>
<li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9%3A+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li>
<li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li>
<li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098(2008).</li>
<li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542(2009).</li>
<li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li>
<li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li>
<li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies%3A+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li>
<li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62(2009).</li>
<li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486(2011).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li>
<li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769(2018).</li>
<li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651(2020).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+%28Bemisia+tabaci%29%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li>
<li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes+and+Genetics+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li>
</ol>

אנו מציגים כאן שיטת מיקרו-אינג'ינג עובר שפותחה לאחרונה עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 בפליבוטומוס פאפטאסי חול זבובים. מיקרו-לינקציה של עוברים לשינוי גנטי של חרקים פותחה בדרוסופילה באמצע שנות ה-80 של21 וכיום נעשה בה שימוש שגרתי במגוון רחב של חרקים. שיטות אחרות להעברת חומרים לשינוי גנטי פותחו לשימוש חרקים, כגון ReMOT20,21,22,23 ו electroporat...

מחלות המועברות על ידי וקטור מהוות איום מרכזי על בריאות הציבור באבולוציה מתמדת. מאות מינים וקטוריים הפרוסים על פני משפחות פילוגניות שונות מאוד (למשל, יתושים, קרציות, פרעושים) אחראים להעברת מספר עצום של פתוגנים מיקרוביאליים, וכתוצאה מכך יותר מ -700,000 מקרי מוות של בני אדם בשנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. בין חרקים וקטוריים, זבובי חול פלבוטומין (דיפטרה, פסיכודידיה) מהווים קבוצה עצומה, עם 80 מינים וקטורים מוכחים המציגים תכונות פנוטיפיות מובהקות ויבולות וקטוריות שנמצאו באזורים גיאוגרפיים שונים. הם וקטורים עבור טפילי פרוטוזואן של הסוג לישמניה, גורם סביב 1.3 מיליון מקרים חדשים של לישמניאסים בין 20,000 ל 30,000 מקרי מוות בשנה. התוצאות הקליניות של לישמניאס מגוונות, עם תסמינים הנעים בין נגעים עוריים המגבילים את עצמם ועד להפצה הקרביים שהיא קטלנית בהיעדר טיפול.
זבובי חול הם חרקים יבשתיים לחלוטין. מחזור החיים שלהם, ארוך יחסית לדיפטרה אחרת, נמשך עד שלושה חודשים, בהתאם לפרמטרים שונים כגון טמפרטורה, לחות ותזונה. הוא מורכב משלב עוברי אחד (6 עד 11 ימים), ארבעה שלבי זחל (הנמשכת בסך הכל 23 עד 25 ימים) ושלב פופי אחד (9 עד 10 ימים) ואחריו מטמורפוזה ולאחר מכן בגרות. זבובי חול דורשים סביבה לחה וחמה לגידול. זכרים ונקבות כאחד ניזונים מסוכרים, המתקבלים בטבע מצוף פרחים. רק נקבות הן מאכילות דם, שכן הן דורשות חלבונים המתקבלים מארוחת הדם לייצור ביצים1.
מוקד מחקר חשוב הוא לזהות את אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות המובילות להתפתחות זיהומים הניתנים להעברה. כמו חרקים וקטוריים אחרים, פרמטרים מהותיים לזבובי חול הוכחו כמשפיעים על יכולתם הווקטורית, המוגדרת כיכולתם לשאת ולהעביר פתוגנים למארחיהם. לדוגמה, הביטוי של גלקטינים על ידי חול פפטאסי Phlebotomus לטוס תאים midgut, מתנהג כמו קולטנים זיהוי רכיבים משטח טפיל, יכול להשפיע ישירות על היכולת הווקטורית שלהם עבור Leishmania גדול2,3. מסלול התגובה החיסונית חרקים, מחסור במערכת החיסון (IMD), הוא גם חיוני עבור Phlebotomus papatasi חול זבוב וקטור יכולת עבור לישמניה גדול4. תפקיד קריטי עבור מסלולי תגובה חיסונית חרקים וקטוריים בשליטה על העברתם של פתוגנים זיהומיות דווח באופן דומה יתושים Aedes aegypti 5,6,7, ב tsetse לטוס Glossina morsitans8, וב Anopheles gambiae יתושים 9,10.
מחקרים על זבוב חול / אינטראקציותלישמניה הוגבלו על ידי היעדר שיטות לשינוי ביטוי גנים המותאמות לשימוש בחרקים אלה. רק הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA)בוצעה 11,12,13,14 עד לאחרונה. הטכניקה, המוגבלת על ידי התמותה הקשורה למיקרו-אינג'ים של נקבות בוגרות, מובילה רק לאובדן חלקי של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקר הגנומי הפונקציונלי באורגניזמים שאינם מדגמים כגון זבובי חול. שונה ממערכת החיסון האדפטיבית בפרוקריוטים להגנה מפני בקטריופאג'ים15,16, מערכת CRISPR Cas9 הותאמה במהירות ככלי לעריכת גנום לאורגניזמים אוקריוטיים מעולים, כולל חרקים. העיקרון של עריכת גנום ממוקד CRISPR/Cas9 מבוסס על המשלימות של RNA מדריך יחיד (sgRNA) לוקוס גנומי ספציפי. גרעין Cas9 נקשר לסגנ"א ויוצר שבירת דנ"א דו-גדילי (dsDNA) בדנ"א הגנומי שבו הסג'רנה מתחבר לרצף המשלים שלו. קומפלקס Cas9-sgRNA מונחה לרצף היעד על ידי 17 עד 20 בסיסים משלימים בסגנ"א למוקד הנבחר, ניתן לתקן את הפסקת dsDNA על ידי שני מסלולים עצמאיים: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)17. תיקון NHEJ כרוך בסגירה פשוטה של ההפסקה אך לעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. תיקון דנ"א באמצעות HDR משתמש במולקולת דנ"א תורמת החולקת הומולוגיה עם הדנ"א של המטרה כתבנית לתיקון. חרקים מחזיקים בשתי המכונות.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 יכולה ליצור מוטציות בלוקוס שנבחר, דרך מסלול התיקון של NHEJ; או לאסטרטגיות מורכבות יותר לעריכת גנום, כגון דפיקות או כתבי ביטוי, דרך מסלול HDR עם תבנית תורמת מתאימה. בזבובי חול, אללים מוטנטים ריקים של גורם התגובה החיסונית Relish נוצרו באמצעות CRISPR בתיווך NHEJ בפלבוטומוס פאפטאסי4. עוברי זבוב חול הוזרקו גם במחקר אחר עם תערובת CRISPR/Cas9 המכוונת לגן המקודד צהוב. ובכל זאת, לא היו מבוגרים הנושאים את המוטציה18. אנו מתארים כאן שיטה מפורטת של זבוב חול mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR /Cas9 בתיווך NHEJ, עם דגש מסוים על microinjection העובר, צעד קריטי של הפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>נייר סינון שחור 4.25 ס"מ PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>חתוך למלבנים בגודל של כ-46 X 22 מ"מ. אלה ממוקמים בין השקופית לכיסוי ומשמשים כשכבת בסיס לחה לעוברים במהלך ההזרקה.</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ליישור עוברים</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>שכבת בסיס של המיקרו-הזרקה הוקמה איור 2A</td></tr><tr><td>כלוב חרקים</td><td>בהתאמה אישית או מספר אפשרויות מסחריות</td><td></td><td>כלוב פוליקרבונט למבוגרים אוחזים ומזדווגים עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. &ldquo; קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. גישה ל-6 באוגוסט 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>מזון זחלים</td><td>בהתאמה אישית הכין</td><td></td><td>תערובת של צ'או ארנב וצואת ארנב עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. " קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>מיקרוקאפ 100 מ"ל</td><td>דראמונד</td><td>1-000-1000</td><td>משמש למילוי חוזר של מחטי מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>שואב פה</td><td>ג'ון וו. הוק חברת</td><td>דגם 612</td><td>שואב פה עם מסנן HEPA</td></tr><tr><td>אולימפוס SZX12</td><td>אולימפוס מדעי</td><td></td> החיים <td>מיקרוסקופ מיקרוסקופ הזרקה</td></tr><tr><td>חברת Ovipots</td><td>Nalge</td><td></td><td>ביצים עשויות מצנצנות פלוליפרופילן של 125 מ"ל או 500 מ"ל ששונו על ידי קידוח חורים של 2.5 ס"מ בתחתית וממולאות בטיח של 1 ס"מ של פריז. עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. &ldquo; קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. גישה ל-6 באוגוסט 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>מברשת צבע 6-0</td><td>כל חברת אספקת אמנות</td><td>n/a</td><td>משמש ליישור עוברים</td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>402907</td><td>חומר אנטי פטרייתי</td></tr><tr><td>נימי זכוכית סטנדרטיים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>1B100-3</td><td>משמש לייצור מחטי מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>בקר Trio-MPC100 ומניפולטור MP845</td><td>מכשירי סאטר</td><td></td><td>בקר מיקרו-הזרקה ו מיקרומניפולטור</td></tr></tbody></table>

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור crispr/cas9 מוטגנזה

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

זבובי חול הם הווקטורים הטבעיים של מיני לישמניה, טפילי פרוטוזואן המייצרים קשת רחבה של תסמינים החל בנגעים עוריים ועד פתולוגיה קרבית. פענוח אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של שידור לישמניה למארחיהם. בין הפרמטרים השולטים ביכולת וקטור זבוב החול (כלומר היכולת שלהם לשאת ולהעביר פתוגנים), פרמטרים מהותיים לחרקים אלה הוצגו לשחק תפקיד מפתח. תגובת חיסון חרקים, למשל, משפיעה על יכולת וקטור זבוב חול לישמניה. המחקר של פרמטרים כאלה הוגבל על ידי היעדר שיטות של שינוי ביטוי גנים מותאם לשימוש באורגניזמים אלה שאינם מודל. הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA) אפשרית, אך בנוסף להיותה מאתגרת מבחינה טכנית, ההשתקה מובילה לאובדן חלקי בלבד של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור. mutagenesis ממוקד על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 הותאם לאחרונה זבוב חול פפטאסי Phlebotomus. טכניקה זו מובילה ליצירת מוטציות הניתנות להעברה במקום שנבחר במיוחד, ומאפשרת לחקור את הגנים המעניינים. מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על אינדוקציה של הפסקות דנ"א דו-גדילי ממוקדות, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או על ידי תיקון מונחה הומולוגיה (HDR). NHEJ מורכב מסגירה פשוטה של ההפסקה ולעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. לעומת זאת, HDR משתמש בנוכחות של מולקולת DNA תורמת שיתוף הומולוגיה עם ה-DNA היעד כתבנית לתיקון. כאן, אנו מציגים שיטת microinjection עובר זבוב חול עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 באמצעות NHEJ, שהיא טכניקת שינוי הגנום היחידה המותאמת וקטורים זבוב חול עד כה.

פרוטוקול המיקרו-injection CRISPR/Cas9 המתואר כאן ליצירת מוטנטים של זבוב חול הוקם בפרסום הקודם4. גישה זו יצרה mutagenesis יעיל מאוד, כמו 11 מתוך 540 אנשים שרדו את ההליך, מתוכם 9 היו מוטנטים. בעת תכנון מדריכים למוטציה CRISPR/Cas9, צעד ראשון קריטי הוא לרצף את האזור סביב האזור שיש לפלח. התבנית לריצוף צריכה להיות מהזן שישמש כמקור לעוברים להזרקה. מסוכן להסתמך רק על רצפי גנום שפורסמו כדי לעצב מדריכים. זה לא יוצא דופן שיש הבדלים בין הגנום שפורסם ורצפי עיצוב מראש מדריך. במקרים מסוימים, מדריכים שעוצבו מרצף ...

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

מוטגנזה ממוקדת הותאמה לזבובי חול רק לאחרונה והיא טכניקה חיונית להבנת התפקיד והתפקוד של גנים מעניינים בחרקים וקטוריים אלה. מיקרו-הזרקה של עוברים היא שלב חשוב מאוד בעריכת גנום של חרקים, אבל היא צריכה להיות מותאמת למינים שאתם עובדים איתם, במקרה שלנו, זבובי חול. בהשוואה למיני החרקים האחרים, עוברי זבוב החול קטנים מאוד.לוקח זמן רב להתפתח והם רגישים במיוחד לרמת הלחות. חמישה ימים לפני ההזרקה, נקבות זבובי חול ניזונות בדם לצורך תחזוקה שוטפת של המושבה. יום אחד לאחר ההאכלה, לכוד את הנקבות הניזונות מדם בתרמילי גבס עם פתח צדדי בקבוצות של 100 עד 150 והאכילו את הזבובים בתמיסת סוכרוז של 30%.ביום החמישי לאחר האכלת הדם, הניחו פיסה לבנה של נייר סינון לח בתא ההטלה. והשתמש בשואב פה כדי לאסוף ולהעביר כ -10 נקבות מתרמיל הגבס לתא ההטלה. לאחר 30 עד 60 דקות, הוציאו את צלחת הפטרי ונייר הסינון מתא הביצה.דואגים לכך שנייר הסינון נשאר לח וממשיך לאסוף קבוצות חדשות של נקבות ועוברים לאורך תקופה זו. לאחר איסוף כל העוברים, השתמשו במיקרוסקופ סטריאו ובמברשת צבע עדינה מאוד כדי להעביר בזהירות כ-50 עוברים על פיסות בודדות של נייר פילטר שחור לח, והניחו על שקופיות מיקרוסקופ, ומעליהן כיסוי יחיד לכל שקופית. הוסף מספיק מים לכל נייר סינון כדי לשמור על לחות העוברים מבלי לצוף או להישאב מתחת להחלקות הכיסוי ולרפד את העוברים כנגד פתקי הכיסוי.שעתיים-שלוש לאחר תחילת איסוף הביצים, הניחו שקופית מתחת למיקרוסקופ מנתח והשתמשו במכחול כדי להוסיף בזהירות מים לקצה האחורי של נייר המסנן. עומס אחורי של 0.5 עד מיקרוליטר אחד של הזרקת עומס מערבב למחט מיקרו הזרקה והתקן את המחט לבקר הזרקה פנאומטי, המוגדר ל-30 פאונד לאינץ' מרובע של לחץ מתחת למיקרוסקופ. לחץ על ההדק כדי להוציא אוויר מקצה המחט.כאשר האוויר השתחרר, הגדל לאט את לחץ האחיזה. כאשר חומר ההזרקה מתחיל לזרום, הפחת את לחץ האחיזה עד שהוא נמצא ממש מתחת לנקודת תערובת ההזרקה הזורמת מהמחט והכנס את המחט לצד העובר הראשון. השתמש בהחלקת הכיסוי מאחורי העובר כמעצור אחורי, העביר כמות קטנה של תערובת הזרקה לעובר לפני הסרת המחט בעדינות.מיד לאחר הסרת המחט, לחץ על המזרק כדי להסיר כל חומר מלא בחזרה מקצה המחט והמשך לעובר הבא. לאחר שכל העוברים הוזרקו, ספרו את מספר העוברים שהוזרקו כדי לשמור על ספירה רציפה והוסיפו מים לנייר הסינון כך שתלוש הכיסוי יצוף. לאחר מכן השתמש בבדיקה כדי להחזיק את נייר הסינון במקומו תוך כדי משיכת החלקת הכיסוי מהעוברים.והוא היה נייר סינון כדי למחוק את עודפי המים מהמגלשה. העבירו את נייר הסינון על ערימת נייר סינון לח בצלחת פטרי חדשה והעבירו ידנית כל עובר על תרמילי גבס לחים בגודל קטן ללא צפיפות. לאחר מכן מכסים את התרמילים במסך ומאחסנים את התרמילים באינקובטור של 26 מעלות בלחות של 70%.כמו ברוב פרוטוקולי המיקרו-הזרקה המוצלחים ביותר, מחט מיקרו-הזרקה טובה המתאימה לעוברים המוזרקים חשובה. מחטים חדות וטובות יכולות לחדור בקלות לעובר מבלי לאפשר לחומר לברוח לאחר ההזרקה. המחטים המשוכות לא צריכות להיות מתחדדות ארוכות מדי.אחרת, לומן המחט הופך צר מאוד עבור חלק גדול מהמתחדד, מה שמקשה על לחץ ההזרקה גבוה מספיק כדי לאלץ את החומר דרך המחט. יש לשמור על עוברים בריאים שגודלו לאחר ההזרקה, בעוד שיש להשליך עוברים פגומים מזוהמים, מיובשים או מעוותים. ניתן לזהות אללים מוטנטיים פוטנציאליים בפרטים שגודלו לאחר הזרקה על ידי ניתוח PCR של האזור המקיף את אתרי החיתוך הצפויים.לאחר הקמת קו מוטנטי באמצעות העוברים המוזרקים, גנוטיפ PCR מאפשר זיהוי של הצלבות אחים מוטנטיות הומוזיגוטיות. חיוני שתהיה לך מחט טובה כדי להיות עדין ולתמרן ולהזריק את העוברים. ולוודא שהעוברים מקבלים לחות לאורך כל ההליך.עריכת גנום בחלק מהזבובים רק מתחילה. טכניקה זו היא למעשה צעד ראשון שצריך לבוא אחריו אסטרטגיות מורכבות יותר לשינוי גנום.

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים שלב אחר שלב עבור מוטגנזה של CRISPR/Cas9 של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis. צעדים מפורטים המסופקים על ידי פרוטוקול סטנדרטי זה ישמשו כמדריך שימושי ליצירת זבובים מוטנטים למחקרי גנים פונקציונליים ב - B. dorsalis.

פרוטוקולים עבור CRISPR/Cas9 Mutagenesis של זבוב הפירות המזרחי Bactrocera dorsalis

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

למדו מיקרו-אינג'קציה של CRISPR/Cas9 בזבובי חול (Phlebotomus papatasi) ליצירת מוטציות מכוונות. פרוטוקול זה מסביר איסוף עוברים, הזרקה וגידול חרקים לחקר גנים בבעלי חיים מעבירי מחלות.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

גלה סרטונים נוספים