Name: מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: חקור שיטת טרנספקציה הפוכה לשינוי ביטוי חלבונים ומיקרו-RNA באדיפוציטים מבודדים מ-3T3-L1. שיטה זו מאפשרת ניסויים תפקודיים על תאי שומן בוגרים לחקר מחלות מטבוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת חוף ד'אזור, וסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות התוכנית השקעות למעבדת המצוינות העתידית (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ויוזמת המצוינות (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. נתמך על ידי מענקים מן Société Francophone du Diabète (SFD), האגודה Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), המכון Thématique Multi-Organismes טכנולוגיות לשפוך לה סנטה (ITMO), ואת פונדציה בנג'מין-Delessert. J.G. נתמך על ידי ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. נתמך על ידי מענק ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ומענק מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M הממומן על ידי קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-ימיים ו- Région PACA, הנתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופיה והדמיה GIS IBiSA חוף ד'אזור (MICA).

הערה: השתמש בטכניקות סטריליות כדי לבצע את כל שלבי הפרוטוקול במכסה המנוע של תרבית תא זרימה למינארית. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים אודות כל הריאגנטים והציוד.
1. הבחנה של פיברובלסטים מורין 3T3-L1 לאדיפוציטים
<ol><li>לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מ"מ בתרבות בינונית DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל שזה עתה נולד, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין(איור 1A). מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות (7% CO2 ו 37 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף עם DMEM ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל עוברי (FCS), ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0.25 mM 3-Isobutyl-1-מתילקסנתין (IBMX), 0.25 μM דקסמתזון, 5 מיקרוגרם / mL אינסולין, ו 10 μM רוזיגליצון. הערה: זה לוקח 5 ימים כדי להגיע למפגש כאשר התאים נזרעים ב 300,000 תאים לכל צלחת 100 מ"מ.</li>
	<li>יומיים לאחר מכן, להחליף את המדיום התרבותי עם DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 5 מיקרוגרם / mL אינסולין ו 10 מיקרומטר רוזיגליטזון ודגרה במשך יומיים. לאחר מכן, הזן את התאים כל יומיים עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 mM, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין (איור 1B).</li>
	<li>מעבירים את אדיפוציטים 3T3-L1 7-8 ימים לאחר תחילת פרוטוקול הבידול. הערה: חשוב להגיע לרמה גבוהה של בידול (>80%) לפני transfection כדי למנוע את התפשטות של פיברובלסטים הנותרים לאחר transfection, אשר יוביל לאוכלוסייה מעורבת של תאים שעלולים להטות את התוצאות.</li>
</ol>2. הכנת צלחות מראש
<ol><li>ביום שלפני או כמה שעות לפני transfection, להכין פתרון של סוג קולגן אני ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 30% אתנול מפתרון מלאי ב 1 מ"ג / מ"ל. הוסיפו 250 מיקרו-אל של קולגן לבאר של צלחת של 12 בארות ו-125 מיקרול לבאר של צלחת של 24 בארות, ומפזרים את הפתרון על פני הבאר.</li>
	<li>השאירו את הצלחת ללא המכסה מתחת למכסה המנוע התרבותי עד שהקולגן יתייבש. יש לשטוף פעמיים עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (D-PBS) של דולבק. הערה: לוחות מראש זמינים לרכישה.</li>
</ol>3. הכנת תערובת הטרנס-זיהום
הערה: הריכוז הסופי של siRNA הוא בין 1 ל 100 nM (1 עד 100 pmol של siRNA לכל באר של צלחת 12-באר). הריכוז הסופי של חיקוי miR הוא 10 ננומטר (10 pmol / well). קבע את הריכוז הטוב ביותר של כל siRNA, מחקה miR או אוליגונוקלאוטיד אחר לפני תחילת הניסוי כדי למנוע השפעות מחוץ למטרה. בצע ניסויי טרנספטיציה במשולש כדי להקל על ניתוח סטטיסטי של התוצאות. הכן את כל הריאגנטים עודף כדי להסביר אובדן נורמלי במהלך pipetting.
<ol><li>ערבבו לפי צנרת (נפח/נפח) את ה-siRNA (או אוליגונוקלאוטידים אחרים) עם מדיום מינימלי חיוני משופר(טבלה 1). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף את ריאגנט transfection ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר לסירנ"א, וצינור לערבב (טבלה 1). דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (במהלך תקופה זו, המשך לסעיף 4). מוסיפים את תערובת התמהיל לכל באר של הצלחת מצופה הקולגן.</li>
</ol>4. הכנת אדיפוציטים 3T3-L1
<ol><li>לשטוף את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסף 5x טריפסין לתאים (1 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ), הקפד לכסות את כל פני השטח עם טריפסין. המתן 30 s ולהסיר בזהירות את טריפסין.</li>
	<li>לדגור על צלחת פטרי במשך 5-10 דקות ב 37 °C (57 °F) באינקובטור. הקישו על צלחת 100 מ"מ כדי לנתק את התאים.</li>
	<li>יש להוסיף 10 מ"ל של DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מ"מ, 10% FCS ו-1% פניצילין וסטרופומיצין כדי לנטרל את הטריפסין. בזהירות pipet המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה ההשעיה של התא.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי, ולהתאים את הריכוז של התאים ל 6.25 x 105 תאים / מ"ל של בינוני. זרע 800 μL של השעיית התא / באר של צלחת 12-well (5 x 105 תאים) או 400 μl של השעיית התא / באר של צלחת 24-well (2.5 x 105 תאים) המכיל את תערובת transfection. הערה: צלחת פטרי אחת 100 מ"מ של אדיפוציטים תאפשר הכנת צלחת אחת 12-well או צלחת אחת 24-well. צלחת 100 מ"מ מכילה בדרך כלל 6-7 x 106 אדיפוציטים, אשר תואמים 5 x 105 אדיפוציטים לכל באר של צלחת 12-well.</li>
	<li>לדגור על הלוחות באינקובטור תרבית תאים (7% CO2 ו 37 °C (37 °C), ולא להפריע לתאים במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין. הערה: ניתן גם לזרוע את התאים לתוך קולגן מראש 48 ו 96-באר צלחות אבל לנקוט אמצעי זהירות נוספים בעת החלפת התקשורת כדי למנוע ניתוק של אדיפוציטים.</li>
</ol>5. ניתוח פונקציונלי של אדיפוציטים 3T3-L1 שהודבקו
<ol><li>מטרת המחקר 24-48 שעות ו-48-96 שעות לאחר siRNA או miR מחקים משלוח עבור mRNA וחלבון, בהתאמה.</li>
	<li>בצע ניתוחים פונקציונליים של אדיפוזיטים שהודבקו כדי לחקור איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, הפרשת אדיפוקין, ליפוזיס וליפוגנזה.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידול ולהדבקה של אדיפוציטים בוגרים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להדבקת אוליגונוקלאוטידים כגון, אך לא רק, siRNAs, מיקרו-RNA מחקה, ואנטי מיקרו-RNAs לתוך אדיפוציטים 3T3-L1, שהוא אחד מקווי התא הקשים ביותר לבצע תעתיק. לשיטה זו יש כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון. פרוטוקול זה אינו יעיל עבור transfection עם DNA plasmid, אשר מגביל את התועלת של טכניקה זו עבור מחקרים רווח של פונקציה. למרות קווי תאים מורינים, כולל קו התא 3T3-L1, שימשו בדרך כלל כדי ללמוד תפקוד אדיפוציטים ...

השמנת יתר נחשבת לגורם סיכון מרכזי למחלות מטבוליות רבות, כולל תנגודת לאינסולין (IR), סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות לב וכלי דם1. הטיפולים הנוכחיים לא הצליחו לעצור את השכיחות הגואה המתמדת של מחלות אלה, וניהול IR של חולי שמנים וחולי סוכרת נותר נושא קליני חשוב. רקמת השומן ממלאת תפקיד מכריע בשליטה על הומאוסטזיס אנרגיה, וההתרחבות הפתולוגית שלה במהלך השמנת יתר תורמת להתפתחות של IR ו- T2D2,3. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. מחקרים רבים חקרו את התפקיד של RNAs קידוד חלבון בפיזיולוגיה אדיפוציטים ואת הקשר שלהם עם השמנת יתר.
לאחרונה, הגילוי של RNAs שאינם קידוד (ncRNAs), במיוחד מיקרו-RNAs (miRs), זייף מושגים חדשניים הקשורים למנגנון הרגולציה של תוכניות ביטוי גנים. מחקרים הראו כי ncRNAs הם רגולטורים חשובים של תפקוד אדיפוציטים, וכי dysregulation שלהם ממלא תפקיד חשוב במחלות מטבוליות4. לכן, מניפולציה של חלבונים ו NCRNAs ב adipocytes הוא חיוני כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת השפעתם על פתולוגיות כגון T2D. עם זאת, מניפולציה של ביטוי של חלבונים ו ncRNAs ב vivo, כמו גם adipocytes ראשוני נשאר מאתגר מאוד, העדפת השימוש במודלים אדיפוציטים במבחנה.
פיברובלסטים מורין 3T3-L1 בקלות להבדיל לתוך adipocytes בוגר, פונקציונלי, תנגודת לאינסולין, שהם קו תאים מאופיין היטב המשמש לחקר תפקוד אדיפוזיט (למשל, איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipolysis והפרשת אדיפוקינים)5,6,7,8,9,10. מאפיינים אלה הופכים את 3T3-L1 לאידיפוציטים מודל אטרקטיבי כדי לווסת את הביטוי של קידוד חלבונים ו- NC-RNAs כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת תפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר. למרבה הצער, בעוד 3T3-L1 פיברובלסטים קל להעביר באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית, מודיפוציטים 3T3-L1 מובחנים הם אחד מקווי התא הקשים ביותר כדי להעביר. זו הסיבה שמחקרים רבים המתמרנים ביטוי גנים בתאי 3T3-L1 התמקדו בבידול אדיפוציטים ולא בתפקוד אדיפוציטים.
במשך זמן רב, הטכניקה היעילה היחידה כדי טרנספקט adipocytes היה electroporation5, וזה מייגע, יקר, והוא יכול לגרום נזק לתא. מאמר זה מדווח על טכניקת טרנס-טרנס-זיהום באמצעות ריאגנט תעתיק נפוץ, אשר מפחית את הזמן מעשי עבור transfection, אין השפעה על הכדאיות התא, והוא הרבה פחות יקר מאשר electroporation. פרוטוקול זה מתאים באופן מושלם לתרגום של siRNA ואוליגונוקלאוטידים אחרים כגון מיקרו-RNA מחקה (מחקה miR) ואנטי-miRs. העיקרון של פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הפוך הוא לדגור על ריאגנט הטרנס-זיהום ואת האוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בצלחת תרבית התא ואז לזרוע את אדיפוציטים בוגרים לתוך הבארות. לאחר מכן, אדיפוציטים לחבר מחדש את פני הלוח דבק בנוכחות קומפלקס ריאגנט אוליגונוקלאוטידים / transfection. מתודולוגיה פשוטה, יעילה וזולה זו מאפשרת לחקור את תפקידם של RNAs ו- miRs קידוד חלבונים בתפקוד אדיפוציטים ותפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר.

<table><tbody><tr><td>12 באר צלחת תרבית רקמות</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2.5% טריפסין (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>מדולל ל-5x עם D-PBS</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell לא ממוקד Pool</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>קולגן סוג I מעור עגל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; מדיום נשרים מותאם (DMEM)</td><td>ג'יבקו</td><td>41965062</td><td>4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז; ל-גלוטמין; ללא פירובט</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>תווית FAM בקרה שלילית si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>מגיב גליצרול חופשי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה סטנדרטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-131119</td><td>דילול : 0.5 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי משופר (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין, רקומביננט אנושי</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA מחקה</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer בדיקות Hs_RNU6-2_11</td><td>בדיקות פריימר Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript ערכת PCR ירוקה SYBR סרום עגל</td><td>יילוד Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>יילוד</td><td>סרום Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus עכבר Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon דיסקברי</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פריליפין-1</td><td>איתות תאים</td><td>3470</td><td>דילול: 1/1000</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ x 20 מ"מ</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>9272</td><td>דילול: 1/1000</td></tr><tr><td>PKB פוספו Thr308 תא נוגדן</td><td> איתות</td><td>9275</td><td>דילול: 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה (INTERFERin)</td> <td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin נוגדן</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>דילול: 0.5 &micro; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן Vamp2</td><td>R& D מערכות</td><td>MAB5136</td><td>דילול : 0.1 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr></tbody></table>

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-rna על תפקוד אדיפוציטים

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

שינוי בתפקוד אדיפוזיטים תורם לפתוגנזה של מחלות מטבוליות כולל סוכרת מסוג 2 ועמידות לאינסולין. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. אפנון הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים נותר מאתגר מאוד. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להבדיל בין פיברובלסטים מורין לאדיפוציטים בוגרים ולווסת את הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים בוגרים באמצעות תעתיק הפוך באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA) ומיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים. פרוטוקול תעתיק הפוך זה כרוך בדגורה של ריאגנט טרנס-זיהום והאוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בלוח תרביות התא שאליו מתווספים האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, אדיפוציטים מורשים לחבר מחדש למשטח הלוח החסידי בנוכחות קומפלקס הריאגנט אוליגונוקלאוטידים/טרנספקטריון. ניתוחים פונקציונליים כגון המחקר של איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ליפוליזה יכול להתבצע על אדיפוזיטים בוגרים 3T3-L1 כדי לחקור את ההשפעה של חלבון או מניפולציה מיקרו-RNA על תפקוד אדיפוזיט.

באמצעות ההליך של טרנס-טרנס-זיהום הפוך המתואר כאן כדי לווסת את הביטוי של חלבונים או מיקרו-RNAs ב 3T3-L1 adipocytes, adipocytes הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection (איור 1B,C). ואכן, 2 ימים לאחר transfection, adipocytes היו מפוזרים היטב מחוברים לצלחת והציג טיפות שומנים רב לשוניות כי הם אופייניים של adipocytes 3T3-L1 בוגר. תכולת השומנים לא הייתה שונה בין אדיפוזיטים שהודבקו ללא עבירות(איור 1D,<strong...

מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

פרוטוקול זה מאפשר לתפעל חלבונים, או ביטוי מיקרו-רנ"א, באדיפוציטים מובחנים כדי לחקור את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להעביר אוליגונוקלאוטידים לאדיפוציטים של עכבר 3T3-L1. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על preadipocytes אנושיים מובחנים אדיפוציטים.מי שתדגים את ההליך תהיה מלאני גודפרין, טכנאית מהמעבדה שלנו. לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מילימטר ב- DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, סרום עגל שזה עתה נולד, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין. מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס ושבעה אחוז פחמן דו חמצני.יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף אותו עם DMEM ללא pyruvate, גלוקוז 25 מילימולר, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0.25 מילימטר IBMX, 0.25 מיקרומולר דקסמתזון, חמישה מיקרוגרם לאינסולין מיליליטר, ו 10 מיקרומולר רוזיגליטזון. לדגור על הכלים במשך יומיים. יומיים לאחר מכן, להחליף את המדיום התרבותי עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת חמישה מיקרוגרם לאינסולין מיליליטר ו 10 מיקרומולר רוזיגליצון ודגרה במשך יומיים נוספים.להאכיל את התאים כל יומיים עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין ולשמור על התאים באינקובטור. יום אחד או כמה שעות לפני ההדבקה, להכין פתרון של סוג קולגן אני ב 100 מיקרוגרם למיליליטר ב 30% אתנול מפתרון מלאי במיליגרם אחד למיליליטר. הוסיפו 250 מיקרוליטרים של קולגן לבאר של צלחת של 12 בארות או 125 מיקרוליטרים לבאר של צלחת של 24 בארות ומפזרים את הפתרון על פני השטח של הבאר.השאירו את הצלחת ללא המכסה מתחת למכסה המנוע התרבותי עד שהקולגן יתייבש. ואז לשטוף אותו פעמיים עם D-PBS. מזלפים את siRNA עם בינוני חיוני מינימלי משופר לערבב ודגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.מוסיפים את ריאגנט הטרנס-זיהום ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר לסירנ"א ופיפטה לערבב. לדגור אותו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מוסיפים את תערובת הטרנספקטיון לכל באר של הצלחת מצופה הקולגן.לשטוף את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסף טריפסין 5x לתאים, הקפד לכסות את כל פני השטח עם טריפסין. המתן 30 שניות והסיר בזהירות את טריפסין.לדגור את צלחת פטרי במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור. לאחר מכן הקש על המנה כדי לנתק את התאים, תוך הימנעות מנזק לתא. הוסף 10 מיליליטר של DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולר, 10% FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין כדי לנטרל את טריפסין.בזהירות pipette המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה ההשעיה של התא. לספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי ולהתאים את הריכוז של התאים ל 0.625 מיליון תאים למיליליטר של בינוני. זרע 800 מיקרוליטרים של השעיית התא לבאר של צלחת 12-well או 400 microliters של השעיית התא לכל באר של צלחת 24-באר המכילה את תערובת transfection.לדגור על הלוחות באינקובטור תרבית תאים ולא להפריע להם במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא pyruvate, גלוקוז 25 מילימולר, 10% FCS, ו אחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין ולהחזיר את התאים לאינקובטור. נקודות זמן אופייניות לזיהוי נוקאאוט יעד לאחר מסירת siRNA או miR הן 24 עד 48 שעות עבור mRNA ו 48 עד 96 שעות לחלבון.ניסויים פונקציונליים יכולים להתבצע על אדיפוזיטים transfected כולל איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, הפרשת אדיפוקין, lipolysis, ליפוגנזה. אדיפוציטים הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection. יומיים לאחר transfection, adipocytes הציג טיפות שומנים רב לשוניות עם תוכן שומנים לא שונה בין אדיפוזיטים transfected ולא transfected.ביטוי ה- mRNA של סמני בידול שונים לא השתנה בתאים שהודבקו בהשוואה לזה של אדיפוציטים שאינם מושפעים. פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הוא יעיל כמו יותר מ -70% של adipocytes הועברו. שלושה ימים לאחר הטרנספקט עם siRNA נגד Perilipin-1, רמת ה- mRNA של Perilipin-1 ירדה ב -70%ורמת החלבון ב -63%ביטוי Perilipin-1 נותחה גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ארבעה ימים לאחר ההדבקה ונמצא כי ירדה ב -92% בהשוואה לביטוי שלה באדיפוציטים שליטה.טרנס-טרנספקט של אדיפוציטים עם מיקרו-רנ"א המחקה אוליגונוקלאוטידים כדי לווסת את הביטוי של miR-34a מוצג כאן. ביטוי יתר של miR-34a הוביל לירידה בביטוי חלבון VAMP2 על ידי 50%ההשבתה של Perilipin-1 ב 3T3-L1 אדיפוזיטים הוביל לעלייה ליפוליזה בזאלית בעוד ביטוי יתר של miR-34a הוביל לעיכוב של חלבון המושרה באינסולין קינאז B זרחן וספיגת גלוקוז. חשוב להגיע לרמה גבוהה של הבחנה אדיפוציטים כדי לבצע את transfection על אדיפוציטים מובחנים חדשים כדי לפקח בזהירות על הטיפול של אדיפוציטים עם טריפסין.לאחר ההדבקה, ניתן לבצע ניסויים פונקציונליים על אדיפוזיטים כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים או מניפולציה microRNA על איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipogenesis, ליפוליזה.

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

רקמת שומן (AT) יכולה להשפיע על הומאוסטזיס של כל הגוף, ולכן יש חשיבות להבנת המנגנונים המולקולריים של התמיינות ותפקוד אדיפוציטים. אנו מספקים פרוטוקול להשגת תובנות חדשות לגבי תהליכים אלה על ידי ניתוח הומאוסטזיס, התמיינות וחשיפה להיפוקסיה כמודל לאפופטוזיס אדיפוציטים מושרים.

מנגנון הוויסות של מספרי adipocyte למבוגרים אורגניזמים באמצעות בידול הומאוסטזיס אפופטוזיס

שומן לבן (וואט) יש ליקויים קריטי הדגמים תרבות הראשי הנוכחי שלה, הפרעה מטבולית מחקרים ופיתוח תרופתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מערכת microphysiological אדיפוז מאת וואט sandwiching בין גליונות של תאי סטרומה. מבנה זה מספק פלטפורמה יציבה וניתנת להתאמה לתרבות וואט העיקרי.

פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות adipocytes האדם בוגרת. כאן אנו מפרטים כיצד לבודד adipocytes מן האדיפוז האנושית וכיצד להגדיר MAAC.

בידוד ותרבות של האדם Adipocytes בוגרים באמצעות ממברנה מבוגרים תרבויות הצבירה (MAAC)

אנו מתארים האדם 3D מטריקס-adipocyte מערכת תרבות מבחנה המאפשרת ניתוח של התפקידים של מטריקס ואדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ רקמה מטבולית של רקמת השומן.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד, תרבית ופנוטיפ של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מרקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVECs). בנוסף, אנו מתארים מודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

חקר שיחות צולבות של תאי אנדותל שומן/אדיפוציטים ברקמת שומן תת-עורית אנושית

הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

מחשב שנוצר באמצעות גירויים הדרקון ג'קי כמודל.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

חקור שיטת טרנספקציה הפוכה לשינוי ביטוי חלבונים ומיקרו-RNA באדיפוציטים מבודדים מ-3T3-L1. שיטה זו מאפשרת ניסויים תפקודיים על תאי שומן בוגרים לחקר מחלות מטבוליות.

מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

גלה סרטונים נוספים