Name: In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למדו הערכת ניקוז ריריתי-שערורייתי בעכברים באמצעות דימות רדיונוקליידי SPECT/CT. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת וחוזרת של MCC לפיתוח תרופות למחלות נשימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.Z. ו- K.S.F. ועבודה זו נתמכה על ידי מענק שהוענק במסגרת אתגר החדשנות של פיט (PInCh), באמצעות המכון למדעי הקליניקה והתרגום באוניברסיטת פיטסבורג, ומענק NHLBI R01 HL153407, שהוענק ל- M.Z.

הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג אישרה את כל הפרוטוקולים של בעלי חיים המפורטים בפרסום זה לפני ביצוע כל אחד מהניסויים בבעלי חיים אלה.
הערה: פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע מחקרי סיווג רירי vivo באמצעות הדמיה רדיונוקלידית עם סורק SPECT /CT דו-מודאלי. הטכניקות שהוכחו הן כיול מערכת פועל, עכברים הרדמה, צנרור קנה הנשימה של עכברים, החדרת האיזוטופ לתוך הריאות, הדמיה כפולה מודאליות, רישום משותף של תמונות אלה, וניתוח.
1. הגדרת מערכת SPECT/CT
<ol><li>תכנן זרימת עבודה מתאימה והגדר לפני הפעלת ניסויים באמצעות בעלי חיים חיים.<ol>
<li>השתמש ברכישת SPECT המורכבת מ- 60 תחזיות עם גודל צעד של 6o בין תחזיות עם רדיוס סיבוב של 40 ס"מ. רכישת CT מורכבת מ-220 תחזיות עם זווית של 1.6o בין התחזיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ודא כי המערכת יש קולימטורים MWB הנכון עבור עכברים הדמיה SPECT במקום. אם הקולימטורים הבלתי הולמים מותקנים, השתמש באשף הקולימטור כדי להתקין את הקולימטורים הנכונים.</li>
	<li>הפעל את כיול המערכת הדרוש כדי להכין את המערכת לשימוש. הערה: רכיבי SPECT ו- CT של הסורק זקוקים לכיול. כייל את רכיבי ה- CT באמצעות מיזוג מקור וכיול כהה/בהיר (D/L) פעם ביום, כיול היסט מרכזי (COS) כל שבועיים, והערך את חומרת הרנטגן מדי חודש. רכיבי SPECT צריכים להיות מכוילים פעם בשנה.<ol>
<li>כדי להעריך את חומרת הרנטגן, סמן את התיבה הערך חומרת רנטגן במהלך כיול CT(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע מיזוג מקור, סמן את התיבה בצע מיזוג מקור במהלך כיול CT(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע כיול D/L, סמן את התיבה D/L לצד פרוטוקול רכישת CT המשמש במהלך ניסויים במהלך כיול CT. בטל את הסימון של כל הפרוטוקולים האחרים(תפריט כיול CT משלים).</li>
		<li>כדי לבצע כיול COS, החלף את המיטה בכלי טבעת הכיול, התאם את הגדרות סוג המיטה כך שיתאימו להגדרות בקרת התנועה וסמן את התיבה COS לצד פרוטוקול רכישת CT המשמש במהלך ניסויים במהלך כיול CT. בטל את הסימון של כל הפרוטוקולים האחרים(תפריט כיול CT משלים, טבעת כיול משלימה).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אינטובציה והטמעה של עכבר
<ol><li>לשקול את העכברים להיבדק. אם סורקים עכברים מרובים, יש לסמן את העכברים למטרות זיהוי באמצעות שיטות כגון אגרוף באוזן או סימון הזנב.</li>
	<li>הרדמה של עכבר באמצעות 1.5% isoflurane עם זרימת גז של 2 L / min O2 בתא גזים במשך ~ 5 דקות כדי לייצר הרדמה של עומק מספיק, עד הנשימה מאטה ~ 55-65 נשימות לדקה 16 (איור 1A).</li>
	<li>הסר את העכבר מן התא ולהשעות על ידי החותכים הקדמיים על דוכן אינטובציה בשיפוע 45o. ציידו את מעמד הצנרור בקונוס אף כדי לוודא שהעכבר מורדם במהלך הצנרור (איור 1B).</li>
	<li>חבר קצה אחד של חוט סיב אופטי של 50 מיקרומטר למקור אור וחוט קנולה של 20 מד מעליה באמצעות החוט כדי לשמש כמדריך(איור 1C).</li>
	<li>פתח את הפה של העכבר ולמשוך את הלשון קדימה באמצעות מלקחיים קהים. האר את חוט ההנחיה והשתמש בו כדי לדמיין את מיתרי הקול(איור 1D).</li>
	<li>מעבירים את חוט ההנחיה דרך מיתרי הקול כך שהחוט נמצא ממש מעבר למיתרי הקול ונחים בקנה הנשימה העליון. החלק את הצינורית בגודל 1 אינץ' קדימה לאורך החוט כדי לצנרר את העכבר, והעבר את הצינורית עמוק מספיק כך שהרכזת שלה היא נגד החותכות של החיה(איור 1E). הסר את החוט משאיר את הצינורית במקום.</li>
	<li>בדוק את הצנרור על ידי חיבור קצר של הצינורית באצבע ובדיקת שינויים בנשימה. נשימה מופסקת או נשימה מתוחה תוך חיבור ונשימה מואצת עם השחרור הם סימנים של צנרור קנה הנשימה הנכון. אם אין שינוי בדפוסי הנשימה בעת חיבור הצינורית, האחרון סביר בוושט.</li>
	<li>הכן 0.2 mCi של קולואיד טכנציום-גופרית 99m(99mTc-Sc) בנפח של 10 μL, ופיפט לתוך הצינורית. אפשר לעכבר לשאוף אותו באופן ספונטני לריאות במשך 1-2 דקות (איור 1F). הסר את הצינורית לפני העברת העכבר למשטח של הסורק. הערה: הרדיונוקליד הוכן ומסונן על ידי קרדינל בריאות.</li>
</ol>3. הדמיית SPECT/CT
<ol><li>מעבירים את העכבר למשטח 25 מ"מ עם חרוט האף ומאובטחים עם סרט הדבקה, מקפידים לא להדביק את החזה והבטן חזק מדי כדי למנוע פגיעה בנשימה. יש להקפיד להסיר את כל תגי האוזן ממתכת המחוברים לעכבר.</li>
	<li>הכן פנטום רדיואקטיבי המורכב 0.05 mCi ב 200 μL ומניחים כמות זו בצינור PCR 0.2 מ"ל. מקם את הצינור על ידי הדבקה על המשטח מתחת לבטן התחתונה של העכבר, הימנעות חפיפה עם הריאות. הערה: הפנטום משמש לצורך רישום משותף של תמונות CT ו- SPECT, כמו גם שליטה שלילית לסילוק.</li>
	<li>הכנס את העכבר למערכת SPECT/CT, בחר את זרימת העבודה של הדימות והפעל את תוכנית ההתקנה.</li>
	<li>הגדר את מיקום הגלאים בעכבר והפעל את זרימת העבודה של הדימות.</li>
	<li>הכינו כלוב לעכברים שקיבלו רדיואקטיביות לאחר ההליך, עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים, ותיוג ברור באמצעות מדבקת בטיחות לקרינה.</li>
	<li>עם השלמת זרימת העבודה, להסיר את העכבר ממשטח ההדמיה, ולאפשר לו להתאושש בכלוב מוכן למשך 6 שעות בין הסריקות (סוף הסריקה 1 לתחילת הסריקה 2) עם גישה libitum המודעה למזון ומים. 6 שעות נבחר כפי שהוא תואם את פרק הזמן שבו אישור ליניארי בהתאם לתפקוד ריסים מתרחש עם מעט מאוד סיווג מכתשים.</li>
	<li>לאחר 6 שעות, הרדמה מחדש של העכבר וסריקה, יחד עם הפנטום, באמצעות אותה זרימת עבודה כדי למדוד את כמות האיזוטופ פינה את דרכי הנשימה. הערה: זה קריטי כדי לאפשר לעכבר להתאושש כמו הרדמה ללא הפרעה עם isoflurane במשך 6 שעות יוביל אפקט משמעותי ריסים-דיכאון, וכתוצאה מכך כמעט אפס סיווגים mucociliary.</li>
</ol>4. ניתוח
<ol><li>לאחר ההדמיה, בצעו לאחר העיבוד שחזור תמונות מלאות של מחסנית תלת-ממד.<ol>
<li>היסטוגרמה תמונות SPECT באמצעות ההגדרות הסטנדרטיות של היצרן עבור Tc 99m,ולאחר מכן לשחזר באמצעות אלגוריתם MAP3D ופונקציית התפשטות נקודה (PSF) שחזור. הערה: השחזור בוצע באמצעות 8 איטרציות ו- 6 ערכות משנה. שחזור יעיל זקוק ליחס בין קבוצות משנה לתחזיות ב- 1:10 או לחלק באופן שווה למספר התחזיות, כך שנעשה שימוש ב- 6 ערכות משנה עקב הרכישה באמצעות 60 תחזיות.</li>
		<li>לשחזר את תמונות CT באמצעות אלגוריתם פלדקאמפ ומסנן שפ-לוגן. הערה: השחזור בוצע באמצעות 4 איטרציות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבד את תמונות CT ו- SPECT ב- FIJI ImageJ21 באמצעות כלי השריד כדי ליצור תמונות תצוגה קורנל מתמונות צירי ברירת המחדל. לאחר מכן בצע הקרנת סכום מחסנית z בתמונת SPECT כדי להוסיף את נתוני הספירה מכל פרוסה וליצור תמונה אחת כדי להקל על הניתוח.</li>
	<li>לשנות גודל ולרשום במשותף את תמונות CT ו- SPECT באמצעות צינור הפנטום Eppendorf כהפניה (איור 2A,B). עקוב אחר מדידות עקביות של שינוי גודל והשתמש בהן בכל הדגימות.</li>
	<li>בינריז של תמונת CT באמצעות סף אוטומטי, ולאחר מכן היפוך המחסנית וביצוע הקרנת סכום מחסנית z כדי ליצור חלוקה לרמות של הריאות לניתוח (איור 2C).</li>
	<li>סובבו את תמונות CT ו-SPECT ומזגו את התמונה בעזרת כלי הערוצים. חשב MCC על-ידי ציור החזר על ההשקעה סביב הריאה הימנית ומדידתו (איור 2D). הערה: מדידה זו תהיה של הספירה הכוללת בריאה הימנית עבור 0 ו 6 נקודות זמן שעה, עם תמונות 6 שעות מתוקן עבור ריקבון רדיואקטיבי באמצעות הנוסחה: N(t) = N0e-t. 99 מ' Tc-Sc יש קבוע ריקבון של 3.21e-5 לשנייה עם זמן מחצית חיים של ~ 6 שעות. לאחר מכן ניתן להשתמש בערכים אלה כדי לחשב מרווח באחוזים. הערה: ריאה ימנית נבחרה עבור ציור החזר על ההשקעה ומדידת ספירות כמו אישור רירי יעביר את radioisotope מתוך הריאות אל הלוע משם הוא ייבלע בסופו של דבר בבטן. לעתים קרובות למדי, ספירות ניתן לראות בבטן שעשויים לחפוף עם הריאה השמאלית ולכן לייצר ספירות שגויות. זה מבלבל ניתן להימנע על ידי מדידת ספירות בריאה הימנית בלבד.</li>
</ol>

<ol><li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li>
<li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li>
<li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+Tracing+the+origins+of+centrioles%2C+cilia%2C+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li>
<li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((University+of+North+Carolina+Virtual+Lung%2C+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li>
<li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, Pt 1 1868-1902 (1996).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605(2018).</li>
<li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction%3A+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li>
<li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li>
<li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li>
<li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia%2FKartagener+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li>
<li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li>
<li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li>
<li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li>
<li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).</li>
<li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111(2014).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473(2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li>
<li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312(2012).</li>
<li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig%3A+Role+of+Bitter+Taste+Agonists%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702(2017).</li>
<li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li>
<li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs%3A+a+study+in+a+chronic+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li>
<li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+SPECT+collimator+selection%2C+optimization%2C+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li>
</ol>

אף אחד מהם לא קשור לעבודה זו.

התפקיד של ריסים נשימתיים מוטיב הן המחלה והן הפיתוח ממשיך להתפתח ולהיות מוערך טוב יותר. סינכרוני, מכות metachronal של ריסים מוטיב מרובים על פני השטח apical של תאים רירית עץ קנה הנשימה ליצור זרימה cephalad לייצר אישור mucociliary או MCC. MCC נפגעת ciliopathies כמו PCD22, מחלות נרכשות כמו COPD18, וחשיבותו מוכרת CHDs, לא נחשב באופן מסורתי ciliopathies. נתונים אחרונים הראו תפקוד לקוי של הנשימה הן CHD עם הטרוטקסיה23 וללא הטרוטקסיה7. כזה תפקוד לקוי של ריסים מוטיל הוכח לתרגם תסמינים נשימתיים גדולים יותר9, כמו גם תחלואה לאחר הניתוחגדול יותר 8. רוב, אם לא כל, של מחלות אלה, יש מודלים העכבר זמין הפרוטוקול שלנו למדידת MCC בעכברים הוא כלי רב ערך שניתן להשתמש בו כדי לבדוק טיפולים פוטנציאליים.
מודלים של בעלי חיים מספקים שירות להבנת מחלות ופיתוח טיפולים. דימות בעלי חיים In vivo מספק תועלת נוספת עם היכולת לרכוש נקודות נתונים מרובות מאותם בעלי חיים, ללא צורך להקריב את בעלי החיים, המאפשר לחוקרים לעקוב אחר מהלך האורך של המחלה, כמו גם משך המחקר של השפעות הטיפול. מודל העכבר של MCC פותח במהלך עשרות שנים על ידי חוקרים מרובים, בתחילה מבוצע על כלבי ביגל באמצעות scintigraphy מישורי, טכניקת הדמיה גרעינית דו מימדית24. הטכניקה הותאמה לשימוש בעכברים עשור לאחר מכן, ואחריה הסתגלות להדמיית SPECT עשור לאחר מכן25,26. הפיתוח של טכניקה זו במודלים של עכבר היה התפתחות גדולה הרלוונטיות של טכניקה זו, בשל הזמינות של מודלים עכבר מרובים של מחלות אנושיות כמו PCD שבו תפקוד ciliary משתנה באופן משמעותי. MCC הוערך במודלים עכבר של denervation ריאות ודיכוי המערכת החיסונית, ויש לו את הפוטנציאל לשמש בשילוב עם דגמים אחרים19,26. מחקרי מדידה MCC בחולים אנושיים עם מחלות בדרכי הנשימה כגון CF, אסטמה, PCD, ו ciliopathies הקשורים CHD נערכו, הניבו תוצאות כי הטכניקה יכולה לסייע הן מחקרים של פיזיולוגיה ריאות ויעילות טיפולית13.
חלק חשוב בפרוטוקול זה הוא הגדרת רכישות עם פרמטרי ההדמיה הנכונים כדי להשיג תמונות מדויקות לכימות. מספר גורמים הם המפתח בעת עיצוב הגדרות רכישת SPECT, כולל אילו collimators משמשים, מספר התחזיות לרכוש לכל מהפכה, וגודל שלב הסיבוב. בחירת קולימטור היא גורם מרכזי ברגישות וברזולוציה של הרכישה, וייתכן שיהיה צורך להתאים את הגדרות הרכישה לקולימטור המשמש27. לחלופין, בעת שימוש בבעלי חיים גדולים יותר כמו חולדות, הקולימטורים יצטרכו להיות מותאמים. collimators pinhole מרובים למשל רגישים יותר, אבל יש להקפיד בעת בחירת גודל צעד על מנת למנוע תחזיות חופפות ולגרום multiplexing לא רצוי, אשר יכול להגביר עוד יותר את הרגישות של הרכישה על חשבון כמה עמימות תמונה שיכולה לגרום חפצי שחזור25. כיוונון שחזור הוא גם המפתח ליצירת תמונות הניתנות לכימות. MAP3D הוא אלגוריתם שחזור איטרטיבי נפוץ, ו- PSF הוא מודל שחזור נפוץ. שתיהן אמינות לבנייה מחדש של תמונות, אך יש להקפיד על כך בעת הגדרת מספר האיטרציות וערכות המשנה. מספר גבוה יותר של איטרציות יגדיל את הזמן החישובי הנדרש לשיקום, ויגדיל את איכות השחזור עם ירידה בתשואות עם עלייה נוספת.
כדי לכמת תמונות ב-ImageJ, כלי המדידה האידיאלי לשימוש הוא RawIntDen, שמפיק פלט של הערך הכולל של פיקסלים בבחירה. בעת כימות נתוני SPECT על-פני ROIs ריאות בגדלים שונים, השימוש ב- RawIntDen מספק מידה מוחלטת של ספירות ונמנע מהתאמת המדידה לאזור ההחזר על ההשקעה, כמו המדידה הממוצעת21.
טכניקה זו כוללת מספר מקורות שגיאה משויכים שהחוקר צריך להיות מודע להם בעת יישום טכניקה זו. אחד ההסתבכויות הבולטות הוא השימוש בחומרי הרדמה. Isoflurane הוא משחק מהיר, הרדמה בשאיפה כי העכברים להתאושש במהירות לאחר השלמת רכישה. עם זאת, יש להקפיד לספק לעכברים מספיק זמן להתאושש בכלובים שלהם, ולא לשמור על מורדמת יותר מהנדרש. מניסיוננו האישי (נתונים שלא פורסמו) עכברים שהוחזקו מורדמת ברציפות באמצעות isoflurane בשאיפה בין נקודת הזמן של 0 עד 6 שעות הראו סיווג זניח. כמו כן, מנה מבוקרת של הרדמה יש צורך גם כדי להבטיח התאוששות מהירה. בעת אבטחת החיה למשטח להדמיה, צינור הפנטום המשמש לרישום משותף צריך להישמר נמוך על הבטן, כדי למנוע חפצים חופפים עם הריאות. כמו כן, כדי להבטיח תמונת CT איכותית, הקפד להסיר תגי מתכת מהעכבר כדי למנוע ממצאים מפיזור קרני רנטגן.
ניתן להחיל את פרוטוקול MCC הנוכחי על מודלים רבים של בעלי חיים. טכניקה זו יש השפעה זניחה על בריאותו של החיה נסרק, נסבל היטב על ידי עכברים, ובגלל זה זה יכול לשמש עם מודלים המחלה מבלי לסכן את בריאותם של עכברים עדינים כבר. החוזק של מתודולוגיה זו נובע מכך שהיא טכניקת in vivo, המאפשרת רכישת מדידות עקביות וחוזרות על עצמן של תפקוד דרכי הנשימה ללא הקרבת בעלי חיים כדי לבלות קנה הנשימה עבור וידאו מיקרוסקופיה, כי מודלים ex vivo דורשים26. העקביות של טכניקה זו בהפקת מדידות חוזרות על פני סריקות מרובות של אותם בעלי חיים, מאפשרת לטפל באותה חיה עם סוכנים שונים או טיפולים פוטנציאליים, והשוואות סטטיסטיות שנעשו בין אותה חיה כדי להפחית את השונות הביולוגית הטבועה בכל מודל של בעלי חיים, ובכך להקטין את גודל המדגם הדרוש כדי להראות הבדלים מובהקים סטטיסטית.
ההערכה של תפקוד דרכי הנשימה באמצעות טכניקת MCC יכולה להיות מותאמת למגוון מודלים של בעלי חיים וליישם דגמים רבים ושונים של בריאות דרכי הנשימה, כמו גם בדיקת טיפולים חדשים. דרכי הנשימה של דגמי העכבר של PCD ניתן להעריך באמצעות טכניקה זו, כמו גם מודלים של COPD. השיטה שלנו יכולה גם להיות מנוצלת כדי ללמוד השפעות דיפרנציאליות של הרדמה שונים על MCC כי הם בשימוש קליני נפוץ. לבסוף, ההשפעות של סוכנים טיפוליים על דרכי הנשימה ניתן גם להעריך באמצעות מודל זה. כאמור אך נושאת חזרה, שכן היא מדידה in vivo זה מאפשר הערכות MCC חוזרות במהלך מחלה, כמו גם יתרונות הבדיקה של התערבויות טיפוליות לאורך זמן. בנוסף, עכברים הם חיות המעבדה הנפוצות ביותר המשמשות לחיקוי/מחקר של מחלות אנושיות, כאשר במקרים מסוימים, מודלים רבים של עכברים מהונדסים של מחלות אנושיות זמינים לבחירה.

סיליה הם אברונים תאיים מבוססי מיקרוטובולה השמורים לאורך ההיסטוריה האבולוציונית מאצות לבני אדם. הם נובעים משטחי תאים ויש להם מספר פונקציות1, החל מזיהוי אותות חושיים סביבתיים מקומיים ועד תנועתיות, פונקציות שניתן לייחס מבני אדם לאורגניזמים אוקריוטיים חד תאייםמוקדמים 2,3. Cilia יכול להיות לא מוטילי יחיד לשמש אנטנה מיוחדת של התא כדי לעבד אותות סביבתיים; או מוטיב וכפול, מכות בגלים מסונכרנים, מטכרוניים כדי ליצור זרימת נוזלים, כגון בטנה של החצוצרות ודרכי הנשימה העליונות והתחתונות, למעט הסמפונות הסופיות המובילות אל alveoli1,2.
משטח האפיתל הנרחב של דרכי הנשימה חשוף למטח מתמיד של זיהום בצורה של מגוון מזהמים ופתוגנים בשאיפה שעלולים להיות מסוכנים, המחייבים הגנה. מנגנון הגנה מרכזי אחד הוא המנגנון הרירי של עץ קנה הנשימה, שבו זרימה רציפה של ריר מופרש מועברת מכנית מחוץ לדרכי הנשימה על ידי מכות של ריסים מוטיבים מרובים המצפים את המשטחים האפיקליים של תאי האפיתל קנה הנשימה- הסימפונות. אלה מתפקדים כדי ללכוד מזהמים בשאיפה, ובאמצעות המכות המתמשכות והסנכרון שלהם, להעביר אותם cephalad4,5.
סיליה הוכחו כבעלי תפקידי מפתח כגון בפיתוח דפוס שמאלי-ימני בפיתוח עוברים, שם ריסונים מוטיבים בצומת העוברי שובריםסימטריה 6. מוטציות בגנים הקשורים לריסונים נקשרו למחלות כגון מחלות לב מולדות (CHD) בשל המבנה האסימטרי של הלב6. מחקרים אחרונים דיווחו על שכיחות גבוהה של תפקוד לקוי של מערכת הנשימה של חולים עם CHD, כמו גם שכיחות מוגברת של סיבוכים נשימתיים לאחר הניתוח ותסמינים כרוניים בדרכי הנשימה בדרכי הנשימה העליונות והתחתונות7,8,9,10. חולים עם CHD ותפקוד לקוי, עם או בלי הטרוטקסיה, הוכחו כסיכון מוגבר לסיבוכים נשימתיים ותוצאות נשימתיות שליליות לאחר הניתוח5,8,10. מעבר לתפקידם באיתות ופיתוח, החשיבות של ריסוני דרכי הנשימה הוכח על ידי ciliopathies, אשר דוגמה מעולה היא דיסקינזיה ciliary העיקרי (PCD). PCD היא הפרעה מולדת הנובעת ממספר מוטציות המשפיעות על ריסים נשימתיים מוטיב, המוביל דלקות ריאות חוזרות ונשנות, bronchiectasis, ופוטנציאל הצורך בהשתלת ריאות11. בנוסף, למרות ריסונים נורמליים סיסטיק פיברוזיס (CF), ההפרעה מולדת הנפוצה ביותר באוכלוסייה הקווקזית, MCC נפגע עקב ריר עבה, צמיג הנובע מוטציות בגן CFTR12. ישנם דגמי עכבר מרובים של PCD ו- CF, כמו גם מספר גדל והולך של דגמים של CHD. בסופו של דבר ריסונים הם מבנים רב-תכליתיים עם תפקידי מפתח רבים, ושיטה להערכת תפקודם של ריסונים נשימתיים מוטיבים ב- vivo יכולה להיות בעלת ערך למחקר פרה-קליני, ולהערכת ההשפעות של מוטציות כמו גם תרופות על סיווג רירי (MCC)13. השיטה תהיה גם בעלת ערך בהערכת ההשפעות של תרופות חדשניות, ריפוי גנטי או התערבויות על MCC במודלים אלה של העכבר.
ישנם מודלים רבים ושונים ששימשו להערכת MCC. שיטה בולטת אחת כרוכה בשימוש בצבע כחול מתילן שהוחדיר לתוך הסימפונות, עם אישור נמדד על ידי מדידה סיבית של תנועת צבע14. שיטה זו מוגבלת על ידי היכולת להתבונן בתנועה של הצבע, שהוא שגרתי יותר בבני אדם מאשר במודלים פרה-קליניים של עכברים. שיטה בולטת נוספת היא הדמיית רנטגן סינכרון שלב ניגודיות (PCXI), אשר ניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר חלקיקים בודדים בדרכי הנשימה. שיטה זו חדשה יחסית ולא נגישה באופן נרחב15. ישנן שיטות ex vivo רבות להערכת דרכי הנשימה על ידי כריתת קנה הנשימה עבור וידאו מיקרוסקופיה, אולם מודלים אלה מספקים תועלת מועטה בחולים אנושיים16. טכניקות ברזולוציה גבוהה להדמיית ריסים כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית מוגבלות באותואופן 17.
במאמר זה, אנו מציגים שיטה לשחזור כדי למדוד MCC ב vivo ששימש למדידת סיווגי ריאות במודלים רבים של בעלי חיים, כמו גם מחקר MCC במחלת ריאות חסימתית כרונית ולהעריך את ההשפעות של תרופות לדיכוי המערכת החיסונית18,19. שיטה זו עוקבת אחר האישור של קולואיד טכנציום-גופרית רדיופארמה 99m(99mTc-Sc), רדיוטר חלקיקי בלתי מסיס, לאחר החדרה לריאות. לאחר מכן ניתן לעקוב אחר הרדיונוקליד באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT)18,20. יש לנו עוד יותר מעודן טכניקה זו למדידת MCC באמצעות SPECT מודאליות כפולה טומוגרפיה ממוחשבת (CT) הדמיה עם לוקליזציה משותפת של ספירות radioisotope לריאות ומדידת הירידה בספירות אלה מעל 6 שעות. הדמיה דו-מודאלית, עם רישום משותף של תמונות CT ו- SPECT מאפשר לוקליזציה מדויקת של ספירת קרינה לאזור העניין שלנו, הריאות. למרות שאנו מתארים בפירוט את השיטה למדידת MCC בעכברים, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי ללמוד MCC בחולדות. הקולימטורים יצטרכו להיות מותאמים, כמו גם מינון קרינה. לדעתנו, סריקות MCC עכבר הם מאתגרים יותר מבחינה טכנית בשל גודל בעלי החיים הקטנים, אבל שימושי יותר מאשר חולדות בשל מספר גדול של מודלים עכבר הוקמה של מספר הפרעות אנושיות. בנוסף, בשל העלות הנמוכה יותר שלהם ועלות התחזוקה במושבות בעלי חיים, גודל מדגם גדול יותר הוא ריאלי יותר בעכברים.

<table><tbody><tr><td>500 ומיקרו; m חוט סיבים אופטיים ללא מעטפת</td><td>אדמונד אופטיקה</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur</td><td>Colloid קרדינל בריאות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הרדמה וופורייזר</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p תוכנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנתרי בטיחות אינטרוניים 20G 1 אינץ'</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>מעמד אינטובציה לעכבר</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>סימנס Inveon מודאליות כפולה SPECT/CT</td><td>סימנס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעמד הרדמה חד ערוצי</td>, <td>פתרונות הרדמה</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo הערכה של אישור mucociliary בעכברים

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

ריסים מוטיב נשימתי, אברונים מיוחדים של התא, קו פני השטח apical של תאי אפיתל רירית דרכי הנשימה. על ידי מכות באופן מטכרוני, סינכרוני, אלה מרובים, motile, actin מבוססי organelles ליצור זרימת נוזל cephalad ניקוי דרכי הנשימה של מזהמים בשאיפה ופתוגנים. עם זיהום סביבתי גובר, פתוגנים ויראליים חדשניים וחיידקים עמידים לתרופות מרובות, סיווג רירית שנוצר על ידי ריסים (MCC) חיוני לשמירה על בריאות הריאות. MCC הוא גם מדוכא בהפרעות מולדות מרובות כמו דיסקינזיה ciliary ראשונית, סיסטיק פיברוזיס, כמו גם הפרעות נרכשות כמו מחלת ריאות חסימתית כרונית. כל ההפרעות האלה הקימו, במקרה מסוים מרובים, מודלים עכבר. בפרסום זה, אנו מפרטים שיטה המשתמשת בכמות קטנה של רדיואקטיביות והדמיית SPECT/CT דו-מודאלית כדי למדוד MCC במדויק ושחזור בעכברים ב- vivo. השיטה מאפשרת התאוששות של עכברים לאחר הדמיה, הפיכת מדידות סדרתיות לאפשריות, ובדיקת טיפולים פוטנציאליים לאורך זמן. הנתונים בעכברים מסוג בר מדגימים את יכולת השחזור של מדידת MCC כל עוד משולמת תשומת לב מספקת לפרטים, והפרוטוקול דבק בקפדנות.

באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו מורדמת עכברים בתא isoflurane (איור 1A). לאחר שהשיגו רמה נאותה של הרדמה, עכברים הונחו על תמיכות אנכיות (איור 1B) ומיתרי הקול הוצגו באמצעות חוט מנחה מואר(איור 1C-1D). העכברים היו צנרור והחדיר עם 0.2 mCi 99mTc-Sc בכמויות של 10 μL דרך קנולה ועכברים מותר לשאוף באופן ספונטני לתוך הריאות (איור 1E-1F). לאחר רכישת ועיבוד התמונה, תמונות ה-CT וה-SPECT היו מקולוסליות (איור 2A)תוך שימוש בצינור הפנטום כציון דרך (איור 2B). מסכות הריאות נוצרו מתמונת CT (איור 2C) ושימשו למשיכה של ROIs סביב הריאה הימנית לניתוח ב- 0 (איור 2D) ו- 6 שעות (איור 2E-2F). כדי לבדוק את יכולת השחזור של הפרוטוקול, נסרקו בסך הכל 8 עכברים פעמיים בימים שונים עם תנאי ניסוי זהים, כאשר ניתוח באמצעות מבחן t מזווג לא מראה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות (p-value=0.9904)(איור 3A). שני עכברים נוספים נסרקו שלוש פעמים בימים שונים עם תנאי ניסוי זהים, כאשר ניתוח באמצעות ANOVA חד-כיווני מראה התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות (p-value של 0.0041)(איור 3B). בסך הכל נסרקו 8 עכברים והוצגו שתי תמונות מייצגות (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> איור 1: אינטובציה של עכבר והטמעת איזוטופים. תמונות של השלבים הדרושים כדי לצנרר ולהחדיר איזוטופ לתוך דרכי הנשימה. A) העכבר מורדם בתא. ב)העכבר המומר ממוקם על תמיכה אנכית, מושעה על ידי החותכים הקדמיים. C) חוט סיב אופטי מואר 0.5 מ"מ המשמש כחוט מדריך מוכן על ידי הפעלתו דרך קנולה 20 G. ד)פיו של העכבר נפתח באמצעות מלקחיים ומואר באמצעות המדריך המואר כדי לדמיין את מיתרי הקול. E) הצינורית נדחפת על פני מיתרי הקול והמדריך מוסר. F) איזוטופ מסיס הוא החדיר לתוך הצינורית באמצעות פיפטה והעכבר מותר לשאוף באופן ספונטני את האיזוטופ לתוך הריאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> איור 2: תמונות SPECT/CT של סריקת MCC. A) תמונת SPECT שהותאם במשותף עם תמונת CT. B) תמונת CT עם צינור פנטום גלוי ששימש ללוקליזציה משותפת. ג)מסכה של דרכי הנשימה הנגזרת על ידי binarizing תמונת CT וביצוע הקרנת סכום מחסנית z. D) מסיכת CT מותאמת במשותף עם תמונת SPECT. החזר על ההשקעה לניתוח נמשך סביב הריאה הימנית. ה)מסכה של דרכי הנשימה בשעה 6 שעות. F) CT ו SPECT תמונה משותפת של דרכי הנשימה ב 6 שעות עם החזר על ההשקעה לניתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> איור 3: מדידות אישור של אותם עכברים בסריקות מרובות. א)שני סיווגים חוזרים בודדים נמדדו עבור 8 עכברים ללא שינויים בתנאי הניסוי. בדיקת t מזווגת הראתה כי לא היה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות עם ערך p של 0.9904. ב)שלושה סיווגים חוזרים בודדים נמדדו עבור שני עכברים ללא שינויים בתנאי הניסוי. ANOVA חד כיווני הראה שיש התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות עם ערך p של 0.0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> איור 4: תמונות SPECT/CT המותאמות לשפות נוספות של דרכי הנשימה של 0 ו- 6 שעות בשני עכברים עם ROIs שצוירו ב- 0 ו- 6 שעות המתארות את הריאה הימנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור 1 משלימה: סרטון של מיתרי הקול המוארים בחוט סיב אופטי עם השפעת הנשימה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
קבצים משלימים. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.</a>

בפרסום זה, אנו מתארים פרוטוקולים להערכת סיווג רירי בדרכי הנשימה (MCC) בעכברים ב vivo ניצול הדמיה רדיונוקלדית דו-מודאלית. פרוטוקול זה מיועד טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT) ופרוטוקול רכישת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) באמצעות עכבר גוף שלם (MWB) collimators במערכת SPECT / CT כפול.

In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר מדידה מדויקת של פינוי רירית במודל של בעלי חיים באמצעות רדיונוקלידים הנמצאים במעקב באמצעות הדמיית SPECT ו-CT דו-מודאלית כדי למקם ולמדוד במדויק את מרווח דרכי הנשימה. טכניקה זו היא שיטה הניתנת לשחזור למדידת MCC הניתנת ליישום על מודלים שונים של בעלי חיים ומחלות עקב שימוש ב-SPECT/CT כפול. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה, ציידו את המעמד בקונוס אף כדי לשמור על הרדמה ותלו את העכבר המורדם על ידי החותכות הקדמיות על מעמד אינטובציה בזווית של 45 מעלות.מחבר קצה אחד של חוט סיבים אופטיים 50 מיקרון למקור אור ומשחיל צינורית בגודל 20 מעל החוט. השתמש במלקחיים קהים כדי לשלוף את הלשון ולהאיר את חוט ההנחיה כדי לדמיין את מיתרי הקול. העבירו את חוט ההנחיה דרך מיתרי הקול כך שהחוט יהיה ממש מעבר למיתרי הקול המונחים בקנה הנשימה העליון והחלק את הצינורית של סנטימטר אחד קדימה לאורך החוט עד שהיא עמוקה מספיק כדי שהרכזת תהיה כנגד החותכות של החיה.הסר את החוט תוך השארת הצינורית במקומה והשתמש באצבע כדי לחבר את הצינורית לזמן קצר כדי לבדוק אם יש שינויים בנשימה. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטר של קולואיד גופרית טרי של 0.2 מיליקורי 99 מ' טכנציום לצינורית ואפשרו לעכבר לשאוף באופן ספונטני את הרדיונוקליד לריאות במשך דקה עד שתיים. להדמיית SPECT/CT, לאחר הסרת הצינורית, השתמש בסרט כדי להדק את העכבר לפלטה של 25 מילימטר עם חרוט אף והדביק צינור PCR של 200 מיקרוליטר המכיל פנטום רדיואקטיבי של 0.05 מיליקורי מתחת לבטן התחתונה של העכבר מתחת לריאות.הכנס את העכבר למערכת SPECT/CT. בחר את תהליך העבודה של ההדמיה ולחץ על Setup. הגדר את מיקום הגלאים בעכבר והפעל את זרימת העבודה של ההדמיה.עם סיום תהליך העבודה, העבירו את העכבר לכלוב חדש עם ניטור וגישה בלתי מוגבלת למזון ומים ומדבקת בטיחות קרינה למשך שש שעות בין הסריקות. לאחר ההדמיה, היסטוגרמה של תמונות ה-SPECT באמצעות הגדרות תקן היצרן עבור קולואיד גופרית טכנציום 99 מטר והשתמש באלגוריתם MAP3D ושחזור פונקציית התפשטות נקודה כדי לשחזר תמונות ערימה תלת מימדיות. שחזר את תמונות ה-CT באמצעות אלגוריתם פלדקאמפ ומסנן שפ-לוגן ופתח את תמונות ה-CT וה-SPECT בפיג'י.השתמש בכלי reslice כדי ליצור תמונות תצוגה קורונלית מהתמונות הציריות המוגדרות כברירת מחדל ובצע הקרנת סכום z-stack על תמונת SPECT כדי להוסיף את נתוני הספירה מכל פרוסה. צור תמונה אחת כדי להקל על הניתוח. ובאמצעות שפופרת הפנטום אפנדורף כהפניה, שנה את הגודל ורשום את תמונות ה-CT וה-SPECT.השתמש בסף אוטומטי כדי להפוך את תמונת ה-CT לבינארית, להפוך את המחסנית ולבצע הקרנת סכום z-stack כדי ליצור מתאר של הריאות לניתוח. סובבו את תמונות ה-CT וה-SPECT והשתמשו בכלי הערוץ כדי למזג אותן לתמונה אחת. לאחר מכן צייר אזור עניין סביב הריאה הימנית כדי לקבוע את פינוי הרירית.לאחר רכישת ועיבוד תמונה, ניתן למקם את תמונות ה-CT וה-SPECT באמצעות צינור הפנטום כציון דרך. ניתן לייצר מסכות של הריאות מתמונת ה-CT ולהשתמש בהן כדי לצייר אזורים מעניינים סביב הריאה לצורך ניתוחם בנקודות זמן שונות. בניתוח זה, בסך הכל שמונה עכברים נסרקו פעמיים בימים שונים בתנאי ניסוי זהים כדי לבחון את יכולת השחזור של הפרוטוקול.ניתוח מבחן T מזווג לא הראה הבדל משמעותי בין הסריקות החוזרות. שני עכברים נוספים נסרקו גם הם שלוש פעמים בימים שונים בתנאי ניסוי זהים. ניתוח ANOVA חד כיווני הראה התאמה משמעותית בין הסריקות החוזרות.כאן ניתן לצפות בתמונות מייצגות של שניים מהעכברים הסרוקים. חיוני להיות מסוגל לדמיין את דרכי הנשימה. וכדי לוודא שהאינטובציה הצליחה, במידת הצורך, הסר את הצינורית והחזר את האינטובציה כדי למנוע אינטובציה שגויה של הוושט.ניתן ליישם פרוטוקול זה על מודלים של מחלות כדי להעריך את ההשפעות של תרופות שונות על פינוי דרכי הנשימה ולסייע בפיתוח טיפול תרופתי חדש.

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מדידות חוזרות של הפיזיולוגיה מכרסם הנשימה דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר רצויות, אבל בדרך כלל לא ריאלי. כאן אנו מתארים את שיטת הדיר עבור בעל פה intubating עכברים המאפשר מדידות חוזרות של דרכי הנשימה ואת hyperreactivity דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר.

הפיך, לא פולשני שיטת ההתנגדות מדידות דרכי הנשימה ואת נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית דגימה של עכברים

הדבקה אינטראנזאלית בנגיף ההרפס של העכבר בעכברים להערכת תגובות חיסוניות של המארח

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאור מפורט צעד אחר צעד של הנהלים הנדרשים לביצוע מדידות של מכניקה של מערכת נשימה, כמו גם ההערכה של היענות נשימה לשאיפת מטכולין בעכברים באמצעות טכניקת התנודה נאלצה (flexiVent; SCIREQ Inc, מונטריאול, QC , קנדה).

הערכה של מכניקת מערכת נשימה בעכברים באמצעות טכניקת תנודה בכפייה

שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע...

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

מטרת המאמר הנוכחי היא לספק תיאור מפורט של נהלים מומלצים כדי להעריך את תפקוד מערכת הנשימה בעכברים בהכרה מאת כפול-תא plethysmography.

הערכה של תפקוד מערכת הנשימה בעכברים בהכרה על ידי כפול-תא Plethysmography

כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

כאן, אנו מתארים את מדידת השיעול באמצעות מערכת פלטיסמוגרפיה לא פולשנית ובזמן אמת של כל הגוף (WBP) ואת ההליכים הנורמטיביים לקצירת דגימות רקמה של עכברים ומציגים כמה שיטות להערכת דלקת בדרכי הנשימה.

שיטות לאיתור שיעול ודלקת בדרכי הנשימה בעכברים

למדו הערכת ניקוז ריריתי-שערורייתי בעכברים באמצעות דימות רדיונוקליידי SPECT/CT. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת וחוזרת של MCC לפיתוח תרופות למחלות נשימה.

In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים

גלה סרטונים נוספים