דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

CMOD Pack מאפשר לך ליצור דפוס תאים עם דיוק גבוה מאוד ותרביות אותם ב 2d או 3d. זה פותח הזדמנויות ללמוד אינטראקציות תא תא ואת המורפוגנזה של רקמות חדשות מנוע. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה קל עבור מעבדות אחרות לאמץ, זה לא דורש חדר נקי, ציוד מיוחד, או ריאגנטים מסונתזים בהתאמה אישית.

התחל על ידי הפלת טיפות קטנות של התמונה החיובית להתנגד על שקופית אלדהיד, באמצעות pipette חד פעמי. סובב את השקופית במהירות של 3000 סל"ד למשך 30 שניות באמצעות מתכנת הסיבוב, ולאחר מכן הנח אותה על צלחת חמה של 100 מעלות צלזיוס למשך 1.5 דקות כדי לקשר את ההתנגדות לתמונה. הסר את השקופית מהצלחת החמה והצב מסכת תמונה עם התכונות הרצויות על גבי השקופית, להכביד אותו עם חתיכת זכוכית ולכסות את ההתקנה כולה בתיבה אטומה.

לחשוף את ההתקנה עם מנורת UV במשך שתי דקות, לפתח את השקופית על ידי טבילה זה פתרון המפתח במשך שלוש עד חמש דקות, ולאחר מכן לשטוף את פתרון מפתח עודף עם מים, לייבש אותו תחת זרם של אוויר או חנקן. התבונן באור זה תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את ההצלחה של ליטוגרפיה תמונה ולאחסן אותו בחושך. מוסיפים טיפה של 20 תמיסת אוליגוס אמין מיקרומולר על כל אזור בדוגמת תמונה של השקופית ולהפיץ את הטיפה בעדינות על פני האזור כולו, באמצעות קצה פיפטה, דואג, לא לגרד את השקופית, לאפות את השקופית בתנור 65 מעלות צלזיוס עד פתרון ה- DNA התייבש לחלוטין, לבצע הפחתת על ידי הצבת שקופית אפויה צלחת תרבית תא 15 ס"מ במכסה אדים על גבי של שייקר.

מערבבים בעדינות 100 מיליגרם של נתרן בורו הידריד ב-40 מיליליטר של PBS ומוסיפים אותו לצלחת. ואז להפעיל את שייקר במשך 15 דקות. לאחר התגובה, לשטוף שקופית זו פעמיים עם 0.1% נתרן דודציל סולפט כדי להסיר DNA לא נרשם.

ואז לשטוף את המגלשה שלוש פעמים עם מים. כונן שקופית זו תחת זרם של חנקן או אוויר. לבסוף לשטוף אותו עם אצטון כדי להסיר את ההתנגדות התמונה הנותרת.

הכן פתרון עוגן ומתאם אוניברסלי של ארבעה מיקרומולרים כמתואר בכתב היד של הטקסט והכן פתרון עוגן משותף אוניברסלי של 20 מיקרומולרים ב- PBS. הכן את ההשעיה התא על ידי שימוש חוזר של גלולה התא מיליליטר אחד של PBS קר קרח או מדיה חופשית בסרום ולהעביר אחד עד 3 מיליון תאים לצנטריפוגה צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 160 פעמים G במשך ארבע דקות.

יש לחבר מחדש את גלולה התא המתקבלת ב-75 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח או במדיה נטולת סרום ולהוסיף 75 מיקרוליטרים של פתרון העוגן והמתאם האוניברסלי המיקרומולרי. מערבבים היטב ודגרה במשך חמש דקות על קרח, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של פתרון העוגן המשותף האוניברסלי לצינור ומערבבים ביסודיות, ואז מדגרים את הדגימה במשך חמש דקות על קרח. כדי להסיר אוליגוס עודף מן השעיית התא, להוסיף מיליליטר אחד של PBS קר קרח או מדיה חופשית סרום לצינור ומערבבים עם פיפטה.

גלולה התאים על ידי centrifuging ב 160 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשליך את supernatant. חזור על שלב זה פעמיים נוספות. Resuspend התאים בקרח Col PBS או מדיה חופשית בסרום כדי ליצור פתרון צפוף תא של לפחות 25 מיליון תאים למיליליטר, להטות מעט את שקופית התבנית, ולאחר מכן להוסיף 25 microliters של השעיית תא זה ל- inlet של כל תא זרימה.

הסר את פתרון PBS ו- 1%BSA מהשקע, דבר המאפשר למתיה התא למלא את תא הזרימה של ה- PDMs. דגירה על קרח או בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות, שאפו חמישה מיקרוליטרים של השעיית התא משקע השקופית והוסיפו אותו בחזרה לכניסת. חזור על פעולה זו 10 פעמים לכל תא זרימה.

פיפטה עדינה PBS או סרום מדיה חופשית לתוך הכניסה של כל תא זרימה לשטוף את התאים עודפים ולאסוף את מתלה התא מן השקע. חזור על פעולה זו פעמיים עד ארבע פעמים עד שלא יישארו תאים עודפים בשקופית. עבור תרבית תלת-ממדית, הכינו פתרון מבשר ג'ל הידרו המכיל 2% DNAs והוסיפו 50 מיקרוליטרים שלו לפרצון של כל תא זרימה.

שאפו את הנוזל העודף מהשקע, נהיגה פתרון הידרוג'ל לתוך תא הזרימה. לדגור על השקופית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 45 דקות כדי לאפשר הידרוג'ל להגדיר ולבקע את ההידבקות מבוססת ה- DNA בין התאים לפני השטח. הוסף 50 מיקרוליטרים של מבשר ג'ל הידרו לבאר של שקופית תא שתי באר או צלחת שש באר.

Pipette 10 מיקרוליטרים של PBS משני צדי כל תא זרימה. פזרו אותו לאורך כל תא הזרימה באמצעות סכין גילוח או מצאו פינצטה נקודתית והרימו בעדינות את צידי תאי הזרימה כך שה-PBS ימהר תחת ג'ל ההידרו. באמצעות סכין גילוח, הזז את תא הזרימה לקצה השקופית על-ידי היפוך השקופית והזז את תא הזרימה מהשקופית כך שהוא ינחת על גבי סכין הגילוח.

בחר את תא הזרימה את סכין הגילוח באמצעות מלקחיים מעוקלים. הפוך את תאי הזרימה כך שהתאים נמצאים בתחתית והנח אותם על גבי טיפת תמיסת מבשרי ג'ל הידרו. דגירה במשך 30 דקות לפחות, כך הידרוג'ל המכיל את התאים דפוס יכול להיקשר שכבת הקרקע הידרוג'ל וכתוצאה מכך הטמעה מלאה של תאי התבנית.

הסר את תא הזרימה וטבול אותו לחלוטין במדיה. הסט בעדינות את תא הזרימה באמצעות מלקחיים מעוקלים עד שהוא קופץ וצף לתוך המדיה, ולאחר מכן להשליך אותו. הכימות של הידבקות כתם ה- DNA לתאים מסומנים CMO, אשר גדל.

כפונקציה של ריכוז CMO מיוצגת כממוצע וסטיית תקן משלושה ניסויים. דפוסי הדנ"א מוצגים במגנטה ובתאים המסומנים CMO הדבוקים בציאן בריכוזים שונים של CMO. השוואה של צ'אבקים עם תווית CMO ו-LMO עם תווית של HUVECS דבקה בדפוס דנ"א ליניארי מוצגת כאן.

חבילת VSC MOD של דפוס MDC יחיד, שהועברה לג'ל maitre, הצליחה להתרבות ולקטב לאחר חמישה ימים של תרבות. אגרגטים רב-תאיים רב-שכבתיים נוצרו על-ידי שכבות לסירוגין של תאים המסומנים ב- CMOs משלימים. ניתן דפוס אוכלוסיות תאים ייחודיות מרובות יחד עם דיוק גבוה וללא זיהום צולב.

בעת ניסיון פרוטוקול זה, זה קריטי יש השעיית תא צפוף תוך הוספת התאים לשקופית על מנת למקסם את ההזדמנויות עבור התאים להיצמד כתמי DNA.