Name: סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: למד סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית בפאזה מוצקה ובדיקת ציטוטוקסיות בתאי COS7 באמצעות מבחן MTT. השיטה מאפשרת הערכת יעילות תרכובות חדשות בפיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק ממועצת המחקר של הפקולטה לק.ס.ה. (משרד המחקר והמענקים, אוניברסיטת אזוסה פסיפיק-ארה"ב). A.N.G. ו- J.F.M. הם מקבלי מלגת התנסות מחקרית לתואר ראשון (SURE). S.K.M. ו-B.M.R. זוכים במענקי מלגת מחקר STEM (המרכז למחקר במדע, אוניברסיטת אזוסה פסיפיק-ארה"ב). אנו מודים לד"ר מתיו ברזוק ולד"ר פיליפ קוקס על ההדרכה על הבדיקות הביולוגיות.

הערה: מספר כימיקלים וריאגנטים ביולוגיים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים ומסרטנים. יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בציוד מגן אישי מתאים (משקפי בטיחות שאושרו על ידי מינהל הבטיחות והבריאות התעסוקתית, כפפות מתאימות, מעילי מעבדה, מכנסיים באורך מלא ונעליים סגורות) לפני תחילת הניסוי. בנוסף, לאמץ נוהלי בטיחות מתאימים בעת ביצוע סינתזה וטיפול בכימיקלים רעילים וריאגנטים (אדים מכסה אדים).
1. סינתזת פאזה מוצקה של הטרוציקלים ספירוציקליים 6 ו-7
הערה: הסינתזה התבססה על עבודה שפורסמה בעבר11,12. הפרוטוקול המעודכן מגלה כי לא היה צורך בפתיחת הטבעת המזורזת של הטטרבוטילמוניום פלואוריד של ההטרוציקלית הטריציקלית, ולכן חיסולה מקצר את ההליך הסינתטי.
<ol><li>בצע מיכאל תוספת של פורפורילאמין למקשר REM (משך: 25 דקות התקנה + 24 שעות זמן תגובה).<ol><li>הוסף 1 גרם (1 שווה ערך [שווה ערך]) של שרף REM, 20 מ"ל (20 שווה ערך) של דימתילפורמיד (DMF), ו-2.4 מ"ל של פורפורילאמין לכלי תגובה בפאזה מוצקה של 25 מ"ל. התסיסו את כלי התגובה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות לאחר תחילת התגובה. הערה: הקפידו על ערבוב יסודי כדי שהשרף לא יישב בתחתית הכלי.</li>
		<li>יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש לשטוף 4x, לסירוגין בין דיכלורומתאן (DCM) למתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע טנדם מיכאל תוספת/ציקלואדיטור 1,3-דיפולרי (משך: 25 דקות התקנה + 48 שעות זמן תגובה).<ol><li>לשרף היבש, יש להוסיף 1.48 מ"ל (שווה ערך ל-5) של טריאתילאמין (TEA), 0.637 גרם (שווה ערך ל-2) של ניטרו-אולפין ו-10 מ"ל של טולואן יבש לכלי התגובה.</li>
		<li>לאחר מכן, הוסיפו 1.085 מ"ל (שווה ערך ל-4) של טרימתילסיליל כלוריד (TMSCl) לכלי התגובה במכסה אדים מאוורר היטב. הערה: מכיוון שתגובה זו מייצרת גז HCl, אין לכסות את כלי התגובה עד שהגז משתחרר מתחת למכסה אדים.</li>
		<li>יש לכסות היטב את כלי התגובה, ולהתסיס בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של השרף עם הריאגנטים.</li>
		<li>השתמש 5 מ"ל של מתנול כדי להרוות את התגובה.</li>
		<li>מסננים את הכלי כדי להסיר את הפתרון, ולאחר מכן לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM ו מתנול. יש לייבש היטב את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע N-alkylation של הטרוציקל הקשור לשרף כדי ליצור את האמין הרבעוני (משך: 10 דקות הגדרה + 24 שעות זמן תגובה). <ol><li>לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 5 מ"ל של DMF ו-10 שווה ערך של אלקיל הליד, והתסיסו בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. הערה: הקפידו על ערבוב יסודי של הריאגנטים עם השרף.</li>
		<li>יש לשטוף את השרף עם DMF 1x לאחר השלמת התגובה. לאחר מכן, יש להשתמש ב-DCM ובמתנול לסירוגין כדי לשטוף פי 4. יבשו את השרף בכלי התגובה לאחר הכביסה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע חיסול β של האמין הרבעוני לביקוע מתמיכת הפולימר (משך: 15 דקות התקנה + זמן תגובה של 24 שעות).<ol><li>לשרף היבש בכלי התגובה, הוסיפו 3 מ"ל של DCM ו-1.49 מ"ל (שווה ערך ל-5) של TEA כדי לבקע את ההטרוציקל מתמיכת הפולימר.</li>
		<li>התסיסו את תערובת התגובה במשך 24 שעות כדי להבטיח ערבוב יסודי של השרף עם התמיסה. יש לשטוף 4x, לסירוגין בין DCM למתנול. אוספים את השטיפה מכל השטיפות, ומתרכזים באמצעות אידוי סיבובי.</li>
		<li>טריטורט עם מתנול כדי לטהר את האוקסימה הספירוציקלית. יבשו את השרף ביסודיות בכלי התגובה לאחר שטיפות לשימוש חוזר בניסויים עתידיים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בדיקת ציטוטוקסיות באמצעות MTT 14
<ol><li>יש להכין 20 מ"ל של תמיסת MTT של 5 מ"ג/מ"ל באמצעות תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS, 0.9% NaCl במים) כמדלל. מסננים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C. לאחר מכן, הכן דילול 1:1 של תמיסת MTT משלב 2.1 במדיום תרבית תאים ללא סרום (DMEM).</li>
	<li>הכן 1 מ"ל כל אחד מפתרונות מלאי בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל של 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0.1 μM ו- 0.01 μM של תרכובות בדיקה בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. הכן 200 μL למנה של תמיסות העבודה של תרכובות בדיקה על ידי דילול ריכוזי מלאי 1:1000 במדיום ללא סרום בצינורות 1.5 מ"ל.</li>
	<li>במכסה המנוע של תרבית הרקמה, זרעו תאי COS-7 (תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, כליית Cercopithecus aethiops ) במדיום שלם [DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS)] על צלחות 96-well שטופלו בתרבית רקמה בריכוז של 4 × 103 תאים /200 μL לבאר באמצעות פיפטור רב-ערוצי. תאי COS-7 נבחרו מכיוון ש-(1) אלה תאים נפוצים לבדיקות ציטוטוקסיות ו-(2) אלה כבר היו זמינים במוסד.</li>
	<li>לדגום תאי COS-7 במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2.</li>
	<li>שאפו את הסופר-נטנט מהבארות באמצעות פיפטה מזכוכית פסטר המחוברת למשאבת ואקום. מינון התאים במשולש עם תרכובות הבדיקה באמצעות פתרונות העבודה שהוכנו בשלב 2.2 (ראה טבלה 1). דגירה של תאים כמתואר בשלב 2.4.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט מהבארות. הוסף 200 μL של תמיסת MTT לכל באר. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2 למשך 4 שעות.</li>
	<li>שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מהבארות מבלי להפריע לגבישי הפורמזן הסגולים. הוסף 200 μL של DMSO לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן הסגולים. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
	<li>מדוד את הספיגה ב-590 ננומטר14 או 600 ננומטר עבור כל באר באמצעות קורא צלחות של 96 בארות. השתמש בארות ללא תאים כרקע וממוצע ערך הספיגה. הפחת את ערך הרקע הממוצע של הספיגה מערך הספיגה של כל מטופל היטב. נרמל את הנתונים כאחוז מערך המינון האפס הממוצע (ממוצע שלושת ערכי מינון אפס). נתוני התווייה על ציר y: ליניארי (% כדאיות תא יחסית); ציר x: לוג (ריכוז). התווה כל סדרה כעקומה נפרדת (לדוגמה, נתונים משולשים צריכים לכלול 3 עקומות)</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הסינתזה של התרכובות הספירוציקליות התבססה על מחקר קודם שנערך במעבדה זו, אך עם כמה שינויים (איור 1)11,12. ההתקדמות של כל שלב תגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית IR. תוספת מיכאל של מקשר REM 1 עם פורפורילאמין ניתנת לפולימר 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). מהדו"ח הקודם, ISOC של 2 ייצר את התרכובת הטרוציקלית הטריציקלית 3</stron...

עיכוב מולקולות קטנות של האינטראקציה של עכבר יוביקוויטין-ליגאז E3 דקה כפולה 2 הומולוג (MDM2) עם p53 ידוע לשחזר אינדוקציה בתיווך p53 של אפופטוזיס תאי גידול 1,2,3. MDM2 הוא מווסת שלילי של מסלול p53 ולעתים קרובות הוא מבוטא יתר על המידה בתאים סרטניים 4,5,6,7,8,9. מחקרים קריסטלוגרפיים וביוכימיים אחרונים גילו כי מולקולות קטנות המכילות מסגרת ספירוציקלית יכולות לעכב ביעילות אינטראקציות MDM2-p5310. המסגרת הספירוציקלית (איור 1, המוצללת בכחול) נחשבת למוטיב מיוחס מכיוון שנגזרת של מערכת הטבעות האורתוגונלית הנוקשה הזו הובילה לגילוי תרופות טיפוליות חדשניות. הגישה לארכיטקטורה מעניינת זו מציבה אתגר בעת שימוש בטכניקות סינתזה אורגניות מסורתיות. למרות שההשפעות הטיפוליות של מולקולות ספירוציקליות במערכות ביולוגיות נחקרו, סינתזה של מולקולות אלה היא עדיין תהליך מסורבל. מוצרי לוואי לא רצויים, שימוש בתנאים קשים ומתכות מעבר מסוכנות הם לעתים קרובות בעייתיים.
השימוש הפוטנציאלי במוטיב הספירוציקלי בפיתוח תרופות הוביל לפיתוח פרוטוקול המשתמש בסינתזה בפאזה מוצקה כדי ליצור ספרייה של מולקולות עם המוטיב בנוסף לקבוצות תפקודיות אחרות הניתנות להחלפה11,12. הפרדת המוצרים והמגיבים בין השלבים יכולה להיות מושגת פשוט על ידי שימוש במקשר REM המחובר לחרוז שרף וכלי מסנן פאזה מוצקה. זה יצמצם את הצעדים ואולי יעלה את התשואות. גישה סינתטית זו יכולה לייצר מגוון גדול של מועמדים פוטנציאליים לתרופות. עם זאת, היעילות של מולקולות אלה במערכת ביולוגית תדרוש חקירה נוספת.
כדי לקבוע את הציטוטוקסיות של תרכובות ספירוציקליות אלה, נעשה שימוש במבחן MTT13,14. שיטה זו מודדת את כדאיות התא וניתן להשתמש בה כדי לקבוע בעקיפין ציטוטוקסיות של תאים. ריכוזים שונים של המעכבים נוספו לתאים בתרבית בצלחת של 96 בארות, ושיעור התאים החיים נמדד על-ידי ניתוח קולורימטרי של מידת ההפחתה של MTT צהוב על-ידי דהידרוגנזות מיטוכונדריאליות לתרכובת הפורמזן הסגולה (איור 2). הפעילות מדווחת לרוב כערך IC 50 - הריכוז שבו צמיחת התאים מעוכבתב-50% ביחס לבקרה שאינה מטופלת. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול של בדיקת MTT ואת התוצאות הראשוניות של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה.

<table><tbody><tr><td><תאים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי COS-7 (ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>תאי כליה של קופים ירוקים אפריקאים</td></tr> <tr><td><חזקים>כימיקלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-ברומואוקטן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>152951</td><td>אלקיל-הליד</td></tr><tr><td>אלילברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>337528</td><td>אלקיל-הליד</td></tr><tr><td>בנזילברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B17905</td><td>אלקיל-הליד</td></tr><tr><td>ציספלטין</td><td>קיימן כימיקל</td><td>13119</td><td>בקרת ציטוטוקסיות</td></tr><tr><td>דיכלורומתאן (DCM)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270997</td><td>ממס</td></tr><tr><td>דימתילפורממיד (DMF)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 227056</td><td>ממס</td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>ממס DMEM, גלוקוז גבוה, עם L-גלוטמין</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>מדיה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>מדיה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Furfurylamine</td><td>Acros Organics</td><td></td><td>119800050 ריאגנט&nbsp;</td></tr><tr><td>יודומתאן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>289566</td><td>אלקיל-הליד</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860</td><td>ממס</td></tr><tr><td>MTT ((3-(4,5-דימתילתיאזול-2-יל)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד)EMD</td> <td>Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>מדיה תרבית תאים</td></tr><tr><td>שרף REM</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>תמיכה בפולימר; 0.500 מילימול/גרם העמסה</td></tr><tr><td>trans-&beta;-ניטרוסטירן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>מגיב ניטרו-אולפין</td></tr><tr><td>טולואן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>244511</td><td>ממס</td></tr><tr><td>טריאתילאמין (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>מגיב לסילוק בטא</td></tr><tr><td>טרימתילסיליל כלוריד (TMSCl)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>386529</td><td>ריאגנט; זהירות - תנודתי מאוד; יוצר HCl גז</td></tr><tr><td><חזק>כלי זכוכית/מכשור</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל כלי תגובה מוצק</td><td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>כלי זכוכית עם מסנן</td></tr><tr><td>96 Well קורא צלחות</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>מכשיר</td></tr><tr><td>AVANCE III NMR ספקטרומטר</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>מכשיר; 300 מגה-הרץ; ממיסים: CDCl3 ו-CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>מכשיר</td></tr><tr><td>שייקר פעולת שורש כף היד</td><td>Burrell מכשיר 757950819 מדעי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

הטרוציקלים ספירוציקליים דווחו לאחרונה בספרות כתרופות פוטנציאליות לטיפול בסרטן. הסינתזה של מערכות טבעות אורתוגונליות חדשניות אלה מאתגרת. לאחרונה פורסמה מתודולוגיה יעילה לסינתזה של תרכובות אלה, שתיארה את סינתזת הפאזה המוצקה בארבעה שלבים במקום חמשת השלבים שדווחו קודם לכן. היתרון של סינתזה קצרה זו הוא חיסול השימוש של ריאגנטים רעילים. שרף מבוסס קישור של מיכאל (REM) בטעינה נמוכה נמצא כחיוני בסינתזה, שכן גרסאות בעלות עומס גבוה מנעו הוספת ריאגנטים המכילים פניל מגושם ושרשראות צד ארומטיות. בדיקת הקולורימטריה 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) שימשה לבחינת הציטוטוקסיות של ריכוזי מיקרומולאר של מולקולות ספירוציקליות חדשניות אלה במבחנה. MTT זמין בקלות מסחרית ומפיק תוצאות מהירות ואמינות יחסית, מה שהופך את הבדיקה הזו לאידיאלית עבור הטרוציקלים ספירוציקליים אלה. נבדקו מבני טבעת אורתוגונליים וכן פורפורילאמין (מבשר בשיטת הסינתזה המכיל מוטיב טבעת דומה בן 5 איברים).

אוקסימים ספירוציקליים 6 ו-7 סונתזו באמצעות פרוטוקול שונה (איור 1). תוספת מיכאל של פורפורילאמין למקשר REM 1b העניקה שרף הקשור לפולימר 2. התקדמות התגובה הייתה מנוטרת על ידי ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום (IR) על ידי גילוי היעלמות האסטר הבלתי רווי α,β בעומק 1722 ס"מ-1 (איור 3). שרף הקשור לספירוציקלית 4 נוצר מ-2 דרך ביניים חולף 3. הידרוליזה מתנולית של 4 מיוצרת 3-[(3E)-(2S, 4R)-2-פניל-3-הידרוקסימינו 4-הידרוקסימתיל-פירולידין-1-yl]-חומצה פרופיונית מתיל א...

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית באמצעות 3-(4′,5′-דימתילתיאזול-2′-yl)-2,5- דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT) כדי לבחון אוקסימים ספירוציקליים שסונתזו בעבר.

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

פרוטוקול זה משתמש בשיטה הניתנת למיחזור ולשינוי בייצור תרכובות ספירוציקליות. מבחן MTT עוזר לענות על השאלה הנוגעת לציטוטוקסיות של מולקולות חדשות אלה. טכניקה זו מייצרת מולקולות חדשות הניתנות לשינוי באמצעות חומר מוצא מתחדש.בדיקת MTT מספקת תוצאות ביולוגיות מהירות יחסית, וקלות לניתוח בגין על ידי ביצוע סינתזת פאזה מוצקה של מחזורי הטרו ספירוציקליים שש ושבע, כפי שהוכח בעבר. הכן 20 מיליליטר של תמיסת MTT של חמישה מיליגרם למיליליטר באמצעות PBS סטרילי כדילול. סנן ואחסן את התמיסה במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הכן דילול אחד על אחד של תמיסת MTT ב- DMEM. הכן מיליליטר אחד כל אחד מפתרונות המלאי בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר של תרכובות בדיקה ב- DMSO. אחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.הכן 200 מיקרוליטר למנה של פתרונות עבודה של תרכובות בדיקה על ידי דילול ריכוזי המלאי. 1 עד 1000 בסרום ללא מדיום. בזרעי תרבית הרקמה, COS שבעה תאים במדיום שלם על תרבית רקמה תחתית שטוחה טיפלו ב-96 צלחות באר בריכוז של 4, 000 תאים לכל 200 מיקרוליטר לבאר.באמצעות פייפטר רב ערוצי. לדגור על התאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% פחמן דו חמצני. למחרת, שאפו את הסופרנאטנט מהבארות באמצעות פיפטה מרעה מזכוכית המחוברת למשאבת ואקום.מינון התאים משולש עם תרכובות הבדיקה באמצעות פתרונות עבודה שהוכנו בעבר. לאחר מכן להחזיר את התאים לאינקובטור. לאחר 24 שעות, שאפו את הסופרנאטנט מהבארות והוסיפו 200 מיקרוליטרים של תמיסת MTT לכל באר.לדגור את הצלחת במשך ארבע שעות. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מהבארות מבלי להפריע לגבישי הפורמזאן הסגולים. הוסף 200 מיקרוליטרים של DMSO לכל באר כדי להמיס את הגבישים.לאחר מכן לדגור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. מדוד את הספיגה עבור כל באר ב 590 או 600 ננומטר באמצעות קורא לוחות באר 96. השתמש בארות ללא תאים כרקע וממוצע ערך הספיגה.תפרי גוקס ספירוציקליים שישה ושבעה סונתזו באמצעות פרוטוקול שונה. התקדמות התגובה הייתה במעקב על ידי גילוי היעלמותה של אסתר הבלתי רוויה אלפא בטא באמצעות ספקטרוסקופיית אינפרא אדום. בדיקת MTT שימשה לקביעת כדאיות התא.ציספלטין, הידוע כגורם למוות תאי בריכוזים גבוהים, שימש כבקרה חיובית. כצפוי, ככל שריכוז הציספלטין גבוה יותר כך כדאיות התא נמוכה יותר. לאחר מכן נעשה שימוש בבדיקת ה-MTT כדי לבחון את התרכובות הספירוציקליות שש ושבע ופורפורילאמין.פורפורילאמין ותפר גוקס ספירוציקלי 6 הראו ציטוטוקסיות דומה. עם זאת, הרעילות של תרכובת ספירוציקלית שבע הייתה גדולה במידה ניכרת מזו של פורפורילאמין ושישה. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי N-alkylation שבוצעה באמצעות אציל halides מגושם נמצא להפחית את קצב חיסול בטא ובכך להפחית את תפוקת המוצר.

functionalized-spirocyclic-heterocycle-synthesis-cytotoxicity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

מתואר הליך דו-שלבי לסינתזה של נגזרות אינדול פעילות פרמצבטית על ידי פונקציונליזציה של C-H עם אנילין, באמצעות קטליזה של חומצה פוטו וברונסטד.

סינתזה של נגזרות אנטי Tetrahydrocarbazole ידי פוטו וFunctionalization CH זרז חומצה באמצעות חמצניים ביניים (CHIPS)

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפגין שיטה יעילה לסינתזה של spirocyclic heterocycles. תהליך חמישה צעדים מנצל מוצק-שלב הסינתזה והתחדשות מייקל מקשר אסטרטגיות. בדרך כלל קשה לסנתז, נציג שיטת הסינתזה של מולקולות spirocyclic אחרת נגיש גישות מודרניות אחרות הניתנות להתאמה אישית.

מוצק-שלב הסינתזה של Oximes Spirocyclic [4.4]

Enantiomerically מועשר bispiro [γ-ביוטרולקטון-pyrrolidin-4, 4'-pyrazolone] שלדים הם בצורה א-סימטרית מסונתז דרך תגובה 1, 3-dipolar cycloaddition organocatalytic פשוטה.

יעיל הקמת פיגומים, כמו סמים Bispirocyclic דרך Organocatalytic Cycloadditions של α-Imino וγ-Lactones ו- Alkylidene Pyrazolones

פרוטוקול לסינתזה ומדידה של המאפיינים הפוטוכימיים של תרכובות בכלוב מודולרי עם moieties לחיץ מוצג.

עיצוב, סינתזה ומאפייני פוטוכימיקלים של תרכובות בכלוב לחיצים

מסלולים חדשים לסינתזה של בחנקן המכיל הטרופיברוקלס ניצול cercoספורין כמו פוטוזרז מתכת חינם פותחו.

צרקוספורין-פוטוזרז [4 + 1]-ו [4 + 2]-אוספים שנתיים של האזובחות בתנאים מתונים

תגובת עיבוי Claisen-Schmidt היא מתודולוגיה חשובה לדור של תרכובות ארומטיות אופניים מצומדים במתין. באמצעות שימוש בגרסה בתיווך בסיס של תגובת אלדול, ניתן לגשת למגוון מולקולות פלואורסצנטיות ו/או רלוונטיות ביולוגית באמצעות גישה סינתטית זולה בדרך כלל ופשוטה מבחינה תפעולית.

סינתזה של pH תלוי Pyrazole, Imidazole, ו Isoindolone דיפירינון פלואורופורים באמצעות גישת עיבוי Claisen-שמידט

תרכובות Thiophenesulfonamide הן מעכבים חזקים וספציפיים של ויסתי חישת Vibrio quorum LuxR/HapR החוסמים את פעילותם in vivo, ובכך מונעים שעתוק גנים לאלימות, תנועתיות וביופילמים. פרוטוקול זה מפרט כיצד תרכובות אלה מסונתזות, מעוצבות בסיליקו, ונבדקות in vivo לפעילות נגד LuxR/HapR.

סינתזה ובדיקה של מעכבי חישת מניין Vibrio

כאן אנו מציגים פרוטוקול לעיצוב מונחה מבנה של אינטראקציה בין חלבון-ליגנד בין סנגליפרין A לציקלופילין A/גנודריול-F, חיוני לגילוי תרופות חדשות. היציבות של קומפלקס הליגנד-קולטן הוערכה באמצעות סימולציית דינמיקה מולקולרית.

עיצוב ופיתוח מונחה מבנה של מעכבי ציקלופילין A ונגזרות חדשניות של גנודריול-F: גישה אינ-סיליקו

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת באמצעות סקר פנוטיפי, הכולל סינתזה כימית של תרכובת 4-אמינוקווינולין, קביעת ריכוז המעכב המינימלי שלה נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס, והערכת הציטוטוקסיות שלה בקווי תאים יונקים.

זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

למד סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית בפאזה מוצקה ובדיקת ציטוטוקסיות בתאי COS7 באמצעות מבחן MTT. השיטה מאפשרת הערכת יעילות תרכובות חדשות בפיתוח תרופות.

סינתזה הטרוציקלית ספירוציקלית פונקציונלית ובדיקת ציטוטוקסיות

גלה סרטונים נוספים