שיטת הפרעות RNA בתתיווך אלקטרופולציה באודונה

זהו פרוטוקול וידאו לשיטת הפרעת רנ"א מתווית אלקטרופולציה באודונה. שפיריות ועלמה, חברי הסדר Odonata, הם בין החרקים אבות אבות ביותר. Odonata למבוגרים להראות מגוון מדהים בצבעי הגוף ודפוסים, מחקרים אקולוגיים והתנהגותיים רבים נערכו.

עם זאת, מחקרים גנטיים מולקולריים על Odonata היו חסרים, כי ניתוח תפקודי גנים קשה מאוד. לדוגמה, שיטת RNAi הקונבנציונלית אינה יעילה במין אודונה. לאחרונה, הקמנו שיטת RNM בשילוב עם אלקטרופורציה in vivo.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול וידאו עבור RNAi מתווך אלקטרופולציה הן שפיריות ועלמה. כמין הסכרות הייצוגי שלנו אנו משתמשים בסכר כחול הזנב עצמו. יישרנורה סנגלנסיס.

זהו אחד המינים הנפוצים ביותר עלמה, לעתים קרובות נמצא בבריכות שטופות שמש ביפן. ראשית, אנו מראים את פרוטוקול RNAi מיקוד הבטן של damselfly, Ischnura סנגלנסיס. לאחר הרדמה קרה כקרח בשני הפינים משני צידי הפרותורקס ולתקן את הזחל לעמוד קבוע.

משוך ומתוח את הממברנה הבין-מגזרית בין מקטע הבטן השביעי לשמינית באמצעות מטלות. יש למתוח את הממברנה הבין-מגזרית ביד. הכנס את קצה נימי מוכן לתוך קרום intersegmental מתוח.

להזריק 1 מיקרוליטר של פתרון siRNA או dsRNA. החל שתי טיפות של ג'ל אולטרסאונד על משטח הזחל באמצעות מדפים. מניחים אלקטרודות על ג'ל אולטרסאונד, עם האלקטרודה החיובית בצד של ההזרקה.

צור פולסים של אלקטרופוזיה פי 10 באמצעות אלקטרופורטור. יש לנגב את הג'ל שנותר על המשטח בעזרת מגדל נייר. הסר סיכות חרקים ושמור את הזחלים המטופלים על מגבת נייר רטובה במשך יום אחד בערך להחלמה.

לאחר מכן, אנו מראים את פרוטוקול RNAi מיקוד בית החזה של damselfly, Ischnura סנגלנסיס. לאחר הרדמה קרה כקרח לחבר שני סיכות משני צידי prothorax ולתקן את הזחל לעמוד קבוע. משוך ומתוח את הממברנה הבין-סגמנטלית בין הפרותורקס לסינתורקס באמצעות היד.

הכנס את קצה נימי מוכן לתוך קרום intersegmental מתוח. להזריק מיקרוליטר אחד של פתרון siRNA או dsRNA. החל שתי טיפות של ג'ל אולטרסאונד על פני השטח של הזחל באמצעות מדפים.

מניחים אלקטרודות על ג'ל אולטרסאונד, עם אלקטרודה חיובית בצד של הזרקה. צור פולסים של אלקטרופורציה פי 10 באמצעות אלקטרופרולאטור. יש לנגב את הג'ל שנותר על המשטח בעזרת מגדל נייר.

הסר סיכות חרקים ושמור את הזחלים המטופלים על מגבת נייר רטובה במשך יום אחד בערך להחלמה. כמין שפירית מייצג אנו משתמשים שפירית רחפן Pied. פסאודותמיס זונטה.

זהו אחד ממין השפירית הנפוץ ביותר שנמצא לעתים קרובות בבריכות מוצלות ביפן. לבסוף, אנו מראים את פרוטוקול RNI מיקוד הבטן של שפירית, Pseudothemis זונטה. למתוח את הממברנה הבין-סגמנטלית בין קטע הבטן הרביעי והחמישי.

לעשות חור קטן עם מחט בסדר בין קטע הבטן הרביעי והחמישי. הכנס את קצה נימי מוכן לתוך החור מוכן. להזריק מיקרוליטר אחד של פתרון siRNA או dsRNA.

תקן את הזחל לעמוד קבוע באמצעות סיכות. החל שתי טיפות של ג'ל אולטרסאונד על משטח הזחל באמצעות מדפים. מניחים אלקטרודות על ג'ל אולטרסאונד עם האלקטרודה החיובית בצד ההזרקה.

צור פולסים של אלקטרופוזיה פי 10 באמצעות אלקטרופורטור. יש לנגב את הג'ל שנותר על המשטח בעזרת מגדל נייר. הסר סיכות חרקים ושמור את הזחלים המטופלים על מגבת נייר רטובה במשך יום אחד בערך להחלמה.

כאן בחרנו גן מלנין סינתזה MCO2 כגן היעד, וEGFP או בלה כמטרת בקרה שלילית. MCO2 חיוני להיווצרות צבע שחור בחרקים שונים. ראשית אנו מראים את התוצאות בבטן של סנגלנסיס Ischnura.

ראשי חץ לבנים מצביעים על האזורים של פיגמנטציה שחורה מודחקת שבה האלקטרודה החיובית הונחה על אלקטרופורציה. הדגירה של פיגמנטציה נצפתה הן על ידי טיפול siRNA וטיפול dsRNA. הגודל והמיקום של פנוטיפ RNI השתנו במידה ניכרת בקרב אנשים.

ללא אלקטרופולציה לא נצפו פנוטיפים של RNI, מה שמצביע על כך שאלקטרופורציה חיונית ל- RNI במין זה. לאחר מכן, אנו מראים את התוצאות בבית החזה של ישנורה סנגלנסיס. באופן דומה עיכוב של פיגמנטציה שחורה נצפתה סביב האזור שבו האלקטרודה החיובית הונחה על אלקטרופולציה.

לבסוף, אנו מראים את התוצאות בבטן של פסאודותמיס זונטה. כצפוי, פנוטיפ RNI זוהה סביב האזור שבו האלקטרודה החיובית הונחה על אלקטרופולציה. אנו מאשרים כי שיטת RNAi בתתיווך אלקטרופרוציה שימושית מאוד באודונה.

זה יכול לגרום לדיכוי גנים מקומי כמעט 100%יעילות. לפחות באפידרמיס, כאשר אנו בוחרים שלבים התפתחותיים מתאימים. שיטה זו כוללת מספר בשיטת CRISPR/Cas9.

לדוגמה, האזור שבו מופיעים פנוטיפים RNAi ניתן לשלוט על ידי המיקום של האלקטרודה החיובית על חשמול, ואת פנוטיפים RNA ניתן להשוות בקלות עם פנוטיפים שליטה זה לצד זה באותו אדם. יתר על כן, שיטה זו אינה דורשת microinjection לתוך ביצים זעירות. אז זה הרבה יותר קל ומהיר להתבונן פנוטיפ מהר יותר מאשר שיטת CRISPR / Cas9.

יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חרקים שהביצים שזה עתה הטילו קשה לאסוף. לדוגמה, נקבות פסאודותמיס זונאטה מטילות ביצים במהלך הטיסה. אז זה מאוד קשה לאסוף את הביצים שזה עתה הטילו.

אנו מצפים כי פרוטוקול זה עשוי להיות ישים בדרך כלל אורגניזמים שאינם מודל כאשר RNI קונבנציונאלי אינו פועל ביעילות.