Name: אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו ליצור מודל עקה חמצונית בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ARPE-19 באמצעות מימן פרוקסיד. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעות נוגדות חמצון של חלבונים לטיפול בניוון שרירי עין קשור בגיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לגרג סילי ואלן קונטי על הסיוע הטכני המצוין ולפרופ' זוזסאנה איזבק ממרכז מקס-דלבריק בברלין על שסיפקו בחביבות את pSB100X ו- pT2-CAGGS -ונוס פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן השוויצרית הלאומית למדעים והנציבות האירופית בהקשר של תוכנית המסגרת השביעית. Z.I מומן על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC מתקדם [ERC-2011-ADG 294742].

<ol><li>Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+ARPE-19+cultures%3A+Do+melanosomes+confer+cytoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection.</a> Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).</li>
<li>Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+macular+carotenoid+lutein+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells.</a> Antioxidants. 6 (4), (2017).</li>
<li>Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+current+and+future+management+of+geographic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A Review of current and future management of geographic atrophy.</a> Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).</li>
<li>Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Recent developments in age-related macular degeneration: a review.</a> Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).</li>
<li>Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+complement+membrane+attack+complex+in+dry+and+wet+AMD+-+From+hypothesis+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials.</a> Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).</li>
<li>Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and reactive oxygen species.</a> Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).</li>
<li>Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).</li>
<li>Alhasani, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gypenosides+protect+retinal+pigment+epithelium+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress.</a> Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).</li>
<li>National Institute of Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics">https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics</a> (2020).</li>
<li>Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).</li>
<li>He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+improves+mitochondrial+function+in+RPE+cells+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).</li>
<li>Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytokine+profiles+of+human+retinal+pigment+epithelium%3A+Oxidant+injury+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence.</a> Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).</li>
<li>Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+expression+affects+the+oxidative+and+inflammatory+state+of+choroidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells.</a> Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).</li>
<li>Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolato%2C+F+%22Retinal+Degenerative+Diseases%22">Retinal Degenerative Diseases</a>. , Springer. 699-706 (2016).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+the+ERK1%2F2+pathways+and+protects+injured+retinal+ganglion+cells+from+induced+death%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death.</a> Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).</li>
<li>Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+protects+rat+photoreceptors+from+death+by+activating+the+SRC-dependent+signalling+and+elevating+anti-apoptotic+factors+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archives+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins.</a> Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).</li>
<li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+PEDF-expressing+primary+pigment+epithelial+cells+by+the+SB+transposon+system+delivered+by+pFAR4+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).</li>
<li>Garcia-Garcia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+PEDF+release+in+rat+iris+and+retinal+epithelial+cells+after+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+and+neurogenic+activities+of+Sleeping+Beauty-mediated+PEDF-transfected+RPE+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+H2O2-%2C+HNE-%2C+or+tBH-treated+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).</li>
<li>Allen, R. G., Tresini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and gene regulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).</li>
<li>Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+H2O2+induce+catalase+and+metallothionein+gene+expression+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).</li>
<li>Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide in the human body.</a> FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).</li>
<li>Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+correlation+between+the+levels+of+ascorbic+acid+and+H2O2+in+aqueous+humor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor.</a> Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).</li>
<li>Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KGF+prevents+oxygen-mediated+damage+in+ARPE-19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).</li>
<li>Campochiaro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+gene+transfer+of+endostatin%2Fangiostatin+for+macular+degeneration+%28GEM%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study.</a> Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).</li>
<li>Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+affects+retinal+pigment+epithelial+cell+survival+through+epidermal+growth+factor+receptor%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway.</a> International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).</li>
<li>Tu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allicin+attenuates+H2O2+-+induced+cytotoxicity+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+by+regulating+the+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species.</a> Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).</li>
<li>Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piceatannol+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+hydrogen+peroxide+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+through+modulating%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating.</a> Nutrients. 11, 1-13 (2019).</li>
<li>Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+causes+significant+mitochondrial+DNA+damage+in+human+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells.</a> Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+uncoupling+protein+2+attenuates+salt-induced+vascular+dysfunction+by+inhibition+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress.</a> American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).</li>
<li>Johnen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+transfection+of+retinal+and+iris+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).</li>
<li>Mátés, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html">https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html</a> (2020).</li>
<li>Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx">https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx</a> (2020).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%5E%28-%CE%94%CE%94CT%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).</li>
<li>Bascuas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-virally+transfected+primary+human+pigment+epithelium+cells+overexpressing+the+oxidative+stress+reduction+factors+PEDF+and+GM-CSF+to+treat+retinal+neurodegeneration+neurodegenerationl%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl.</a> Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).</li>
<li>Zhuge, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerenol+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+stress-induced+premature+senescence+via+activating+SIRT1%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).</li>
<li>Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+H2O2+Availability+to+ARPE-19+cultures+in+models+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).</li>
<li>Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+oxidative+stress+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF+protects+human+retinal+pigment+epithelial+cells+against+oxidative+stress+via+upregulation+of+UCP2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).</li>
<li>Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCP2%2C+a+mitochondrial+protein+regulated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצג כאן מציע גישה לנתח את הפונקציה נוגד חמצונית ומגנה של PEDF ו- GM-CSF המיוצר על ידי תאים transfected, אשר ניתן להחיל על תאים transfected עם כל גן מועיל putative. באסטרטגיות טיפוליות גנטיות שמטרתן להעביר חלבונים לרקמה על ידי השתלת תאים מהונדסים גנטית, חשוב לקבל מידע על רמת ביטוי החלבון, תוחלת החיים של הביטוי, ואת האפקטיביות של החלבון המבוטא במודל של המחלה. במעבדה שלנו, הפרוטוקול המוצג כאן היה שימושי כדי להגדיר את האפקטיביות של PEDF ו- GM-CSF על עקה חמצונית, אשר כבר שיערו כאלמנט חשוב בפתוגנזה של AAMD<sup clas...

המודל המתואר כאן, מציע גישה שימושית כדי להעריך את היעילות של סוכניםbiopharmaceutical להפחתת עקה חמצונית בתאים. השתמשנו במודל כדי לחקור את ההשפעות המגנות של PEDF ו- GM-CSF על H2O2- מתח חמצוני מתווך על תאי אפיתל פיגמנט רשתית, אשר נחשפים לרמות גבוהות של O2, ואור גלוי, ואת phagocytosis של קרומי המגזר החיצוני photoreceptor, יצירת רמות משמעותיות של מינים חמצן תגובתי (ROS)1, 2. הם נחשבים לתורם מרכזי לפתוגנזה של ניוון מקולרי הקשור לגיל כלי דם (aAMD)3,4,5,6,7,8. חוץ מזה, יש ירידה בגורמים neuroprotective מסונתז RPE, במיוחד את הפיגמנט נגזר אפיתל גורם (PEDF), גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGFs), ו granulocyte מקרופאג-מושבה מגרה גורם (GM-CSF) המוביל לתפקוד לקוי ואובדן של תאי RPE, ואחריו פוטורצפטור ותא גנגליון רשתית (RGC) מוות3,4,5 . AMD היא מחלה מורכבת הנובעת מהאינטראקציה בין גורמים מטבוליים, פונקציונליים, גנטיים וסביבתיים4. היעדר טיפולים עבור AAMD הוא הגורם העיקרי לעיוורון בחולים מעל גיל 60 במדינות מתועשות9,10. לחזרת הסביבה הנוירו-הגנתית והנוירוגנית ברשתית על ידי השתלה תת-רינטלית של תאי RPE מהונדסים גנטית המדחיקים יתר על המידה PEDF ו- GM-CSF יש פוטנציאל למנוע ניוון רשתית על ידי הקלה על ההשפעות של סטרס חמצוני, עיכוב דלקת ותמיכה בהישרדות תאים11,12,13,14,15,16 . למרות שיש מספר מתודולוגיות להעברת גנים לתאים, בחרנו במערכת הטרנספוסון ההיפראקטיבית של היפהפייה הנרדמת הלא ויראלית כדי להעביר את הגנים PEDF ו- GM-CSF לתאי RPE בגלל פרופיל הבטיחות שלה, שילוב הגנים בגנום של התאים המארחים, ונטייתו לשלב את הגנים המועברים באתרים פעילים שאינם תמלול כפי שהראינו בעבר17, 18,19.
סטרס חמצוני תאי יכול להיגרם בתאים בתרבית במבחנה על ידי מספר גורמים חמצוניים, כולל מי חמצן (H2O2), 4-הידרוינונאל (HNE), טרבוטיל הידופרוקסיד (tBH), מתחי חמצן גבוהים ואור גלוי (ספקטרום מלא או הקרנת UV)20,21. מתחי חמצן גבוהים ואור דורשים ציוד ותנאים מיוחדים, המגבילים את יכולת ההעברה למערכות אחרות. סוכנים כגון H2O2, HNE, ו- tBH גורמים לשינויים מולקולריים ותאיים חופפים של עקה חמצונית. בחרנו H2O2 כדי לבדוק את הפעילות נוגדת החמצון של PEDF ו- GM-CSF כי זה נוח ורלוונטי ביולוגית שכן הוא מיוצר על ידי תאי RPE כמו ביניים חמצן תגובתי במהלך פוטורצפטור קטע חוץ phagocytosis22 והוא נמצא ברקמות עינית vivo23. מאז חמצון גלוטתיון עשוי להיות אחראי חלקית על הייצור של H2O2 בעין, ניתחנו את רמות GSH / גלוטתיון במחקרים שלנו, אשר קשורים H2O2- סטרס חמצוני המושרה ואת היכולת ההתחדשותית של תאים21,22. הניתוח של רמות גלוטתיון רלוונטי במיוחד שכן הוא משתתף במנגנוני ההגנה נוגדי חמצון בעין24. חשיפהל- H 2 O2 משמשת לעתים קרובות כמודל לבחינת רגישות מתח חמצוני ופעילות נוגדת חמצון של תאי RPE1,25,26,27,28,29,30, ובנוסף, הוא מראה דמיון לנזק ללחץ חמצוני שנגרם לאור, מקור "פיזיולוגי" של סטרס חמצוני21.
כדי להעריך את הפונקציונליות ואת האפקטיביות של גורמים neuroprotective, פיתחנו מודל במבחנה המאפשר לניתוח לכמת את ההשפעה נוגד חמצונית של גורמי גדילה לידי ביטוי על ידי תאים מהונדסים גנטית כדי להגזים PEDF ו- GM-CSF. כאן, אנו מראים כי תאי RPE שהודבקו בגנים עבור PEDF ו- GM-CSF עמידים יותר להשפעות המזיקות של H2O2 מאשר תאי בקרה שאינם מודבקים, כפי שמעידים מורפולוגיה של תאים, צפיפות, כדאיות, רמה תאית של גלוטתיון, וביטוי של גן UCP2, אשר מקודדים לחלבון המיטוכונדריאלי 2 שהוכח כמפחית מינים חמצן תגובתי (ROS)31.

<table><tbody><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>גריינר</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 96 בארות לבנה עם תחתית שטוחה שקופה&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3610</td><td>מאפשר לבדוק את התאים לפני מדידת הזוהר (GSH-Glo Assay)</td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>אקרילאמיד 40%</td> <td>Biorad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>AMIMED</td><td>4-05F00-H</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GMCSF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PA5-24184</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר IgG/IgA/IgM&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד PEDF&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה בע"מ</td><td>sc-390172</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד פנטה-היס&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-פוספו-Akt</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד ארנב IgG H& L-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חמור נגד ארנב Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עז נגד עכבר Alexa 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>ARPE-19 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-500G</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית תרבית תא</td><td>קורנינג</td><td>354118</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo בדיקת ציטוטוקסיות&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/חזיר F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Duo Set ELISA kit</td><td>R& D מערכות&nbsp;</td><td>DY215-05</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>ELISAquant kit</td><td>BioProducts MD</td><td>PED613-10-עיניים אנושיות</td><td></td></tr><tr><td>(אנושיות)</td><td>אריות מתנת בנק עיניים ראייה (סנט פול, מינסוטה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount הרכבה מימית בינונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות אומגה FLUOstar&nbsp;</td><td>תוכנת BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (גרסה 8.0)</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH-Glo Glutathione Assay</td><td>Promega</td><td>V6912</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ (תוכנית עיבוד תמונה)</td><td>W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997&ndash; 2014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אימידזול&nbsp;</td><td>Axonlab</td><td>A1378.0010</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ DMI4000B Leica&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 מכשיר II&nbsp;</td><td>רוש מערכות</td><td></td><td></td>מולקולריות</tr><tr><td>LightCycler 480 SW1.5.1 תוכנה</td><td>Roche מערכות</td><td></td><td></td>מולקולריות</tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Axonlab</td><td>3468.1000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת טרנספקציה ניאון&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת העברת ניאון 10 ומיקרו; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>תא נויבאואר</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow&nbsp;</td><td>קיאג'ן</td><td>30410</td><td></td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-3197</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל אומגה לום G</td><td>Aplegen מדעי</td><td></td><td></td>החיים</tr><tr><td>PBS 1X</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR ירוק FastMix</td><td>Quantabio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-100G</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA פירס&nbsp;</td>פריימרים <td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td>ראה טבלה 1 בחומרים משלימים</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>M&aacute; t&eacute; s et al., 2009. מסופק על ידי פרופ' Zsuzsanna Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-ה-DNA הפלסמיד שלו (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>נבנה באמצעות הפלסמיד הקיים pT2-CMV-PEDF-EGFP שדווח ב- Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-ה-DNA הפלסמיד שלו (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>נבנה באמצעות הפלסמיד הקיים pT2-CMV-PEDF-EGFP שדווח ב- Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA מיני ערכה</td><td>QIAGEN</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי hGM-CSF&nbsp;</td><td>פפרוטק</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי hPEDF&nbsp; &nbsp;</td><td>BioProductsMD</td><td>004-096</td><td></td></tr><tr><td>ReliaPrep RNA Cell Miniprep System</td><td>Promega</td><td>Z6011</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>סט DNase ללא RNase</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>העברה חצי יבשה מערכת עבור WB&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperMix qScript</td><td>Quantabio</td><td>95048-025</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח Tris-buffered (TBS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>AppliChem&nbsp;</td><td>A1390</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL HRP מצע</td><td>Advansta</td><td>K-12045-D50</td><td></td></tr><tr><td>Whatman קרום ניטרוצלולוזה</td><td>Chemie Brunschwig</td><td>MNSC04530301</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

סטרס חמצוני ממלא תפקיד קריטי במספר מחלות ניווניות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), פתולוגיה המשפיעה על כ -30 מיליון חולים ברחבי העולם. זה מוביל לירידה אפיתל פיגמנט רשתית (RPE)-מסונתז גורמים neuroprotective, למשל, גורם פיגמנט נגזר אפיתל (PEDF) ו granulocyte-מקרופאג מושבה מגרה גורם (GM-CSF), ואחריו אובדן של תאי RPE, ובסופו של דבר פוטורצפטור ותא גנגליון רשתית (RGC) מוות. אנו משערים כי שחזור של סביבת הרשתית neuroprotective ו neurogenic על ידי השתלה תת-רינטלית של תאי RPE transfected overexpressing PEDF ו- GM-CSF יש פוטנציאל למנוע ניוון רשתית על ידי הקלה על ההשפעות של עקה חמצונית, עיכוב דלקת, ותמיכה בהישרדות התא. באמצעות מערכת טרנספוסון היפהפייה הנרדמת (SB100X) תאי RPE אנושיים הועברו עם הגנים PEDF ו- GM-CSF והראו שילוב גנים יציב, ביטוי גנים לטווח ארוך והפרשת חלבונים באמצעות qPCR, כתם מערבי, ELISA ואימונופלואורסצנטיות. כדי לאשר את הפונקציונליות ואת העוצמה של PEDF ו- GM-CSF המופרשים על ידי תאי RPE שהודבקו, פיתחנו מבחנה כדי לכמת את ההפחתה של H2O2- סטרס חמצוני המושרה על תאי RPE בתרבית. הגנה על התא הוערכת על ידי ניתוח מורפולוגיה של תאים, צפיפות, רמה תאית של גלוטתיון, ביטוי גן UCP2, ואת הכדאיות התא. שניהם, תאי RPE שהודבקו ב-PEDF ו/או GM-CSF ותאים שאינם מועברים אך מטופלים מראש עם PEDF ו/או GM-CSF (זמין או מטוהר באופן מסחרי מתאים שהודבקו) הראו הגנה משמעותית על תאים נוגדי חמצון בהשוואה לבקרות שאינן מטופלות. מודל H2O2הנוכחי הוא גישה פשוטה ויעילה להערכת ההשפעה נוגדת החמצון של גורמים שעשויים להיות יעילים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות דומות.

אינדוקציה של עקה חמצונית בתאי אפיתל פיגמנט הרשתית האנושית ARPE-19 ותאי hRPE ראשוניים טופלו בריכוזים משתנים של H2O2 למשך 24 שעות והרמה התארית של גלוטתיון נוגד חמצון כמתה (איור 2A,B). H2O2 ב 50 μM ו 100 μM לא השפיע על ייצור גלוטתיון, ואילו ב 350 מיקרומטר הייתה ירידה משמעותית של גלוטתיון בתאי ARPE-19 ו hRPE ראשי. ניתוח של ציטוטוקסיות הראה כי 350 מיקרומטר הוא הריכוז הנמוך ביותר של H<...

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ושימוש במודל סטרס חמצוני על ידי טיפול בתאי אפיתל פיגמנט רשתית עם H2O2, ניתוח מורפולוגיה של תאים, כדאיות, צפיפות, גלוטתיון, ורמת UCP-2. זהו מודל שימושי לחקור את ההשפעה נוגדת החמצון של חלבונים המופרשים על ידי תאים transposon-transfected לטיפול ניוון neuroretinal.

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

מודל מי החמצן הוא גישה פשוטה ויעילה להערכת ההשפעות נוגדות החמצון של גורמים שעשויים להיות שימושיים בטיפול בניוון מקולרי הקשור לגיל או במחלות ניווניות דומות. החומר המחמצן, מי חמצן, מועבר בפעימה אחת, מה שהופך אותו למהיר ופשוט יותר לביצוע מאשר מודלים שבהם יש לחזור על הטיפול במי חמצן במשך מספר ימים. מכיוון שמספר התאים שנזרעים משפיע על ההשפעה החמצונית של הטיפול, חשוב לספור את התאים בזהירות לפני התרבית שלהם.מי שידגים את ההליך יהיה תאיס בסקואס, פוסט-דוקטורנט ממעבדתו של גבריאל תומן. להכנה בינונית מותנית, 28 יום לאחר טרנספקציה עם PEDF, GM-CSF, או שניהם, זרע את צלוחיות קו התאים האנושי ARPE-19 T-75 מתוך 500,000 תאים למיליליטר של ריכוז בינוני מלא. כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, החליפו את הסופרנטנט במדיום שלם טרי ואספו את הסופרנטנט החדש לאחר 24 שעות.כדי לטהר את חלבוני GM-CSF ו-PEDF המתויגים בהיסטידין, צנטריפוגה את הסופרנטנט כדי לחסל תאים פוטנציאליים שנותרו, והניחו את הדגימה בצד. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת ניקל NTA לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את זרימת הניקל NTA ושטפו את הגלולה פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר דגירה 1X לכל שטיפה.לאחר הכביסה השנייה, השעו מחדש את הגלולה ב-40 מיקרוליטר של מאגר דגירה 4X ו-900 מיקרוליטר של המדיום הצנטריפוגי והממוזג. דגרו את התמיסה הבינונית הממוזגת למשך שעה בטמפרטורת החדר ו -70 סיבובים לדקה. בתום הדגירה יש לצנטריפוגה את הדגימה ולשטוף את הגלולה פעמיים עם 175 מיקרוליטר דגירה 1X לכל שטיפה.לאחר הכביסה השנייה, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה לדגירה של 20 דקות ב-70 סיבובים לדקה בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה יש לצנטריפוגה את הדגימה. הניחו בצד את הסופרנטנט וכמתו את סך החלבון שנפלט על ידי בדיקת חלבון BCA לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.לטיפול בתאי אפיתל פיגמנט רשתית שאינם עוברים עם מדיום מותנה ומי חמצן, זרע 3000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום שלם לכל באר של צלחת של 96 בארות לדגירה של 24 שעות בחממת תרבית התאים. למחרת בבוקר החליפו את הסופרנטנטים ב-200 מיקרוליטר של מדיום מותנה לבאר והחזירו את התאים לחממות תרבית התאים למשך 10 ימים. ביום ה-11 של התרבית, יש לטפל בתאים במי חמצן של 350 מיקרו-מולרי במדיום שלם למשך 24 שעות.לטיפול בתאי RPE שאינם עוברים טרנספטציה עם PEDF ו/או GM-CSF מטוהרים או מסחריים, זרעו 3000 תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום שלם בתוספת 500 ננוגרם למיליליטר של PEDF רקומביננטי ו/או 50 ננוגרם למיליליטר של רקומביננט ל-GM-CSF לבאר למשך 48 שעות דגירה בחממת תרבית התאים. בתום הדגירה, החליפו את הסופרנטנטים במדיום שלם המכיל 350 מי חמצן מיקרו-מולאריים ו-500 ננוגרם למיליליטר של PEDF ו/או 50 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לבאר למשך 24 שעות. לטיפול במי חמצן של תאי RPE שעברו טרנספקציה, תרבית 5,000 תאים שעברו טרנספטציה ב-200 מיקרוליטר של מדיום שלם לבאר למשך 24 שעות בחממת תרבית התאים לפני הטיפול בתאים ב-350 מי חמצן מיקרו-מולאריים כפי שהודגם.כדי למדוד את רמות הגלוטתיון המיוצרות בתאים שעברו טרנספטציה המבטאים יתר על המידה PEDF ו/או GM-CSF, או תאים שאינם עוברים טרנספטציה שטופלו מראש בגורם גדילה לאחר טיפול במי חמצן, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב-100 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים 1X שהוכנה טרי לכל באר וערבב את התאים עם תערובת ריאגנטים למשך 14 שניות ב-500 סיבובים לדקה על שייקר מסלול. לאחר הטלטול, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הוספת 100 מיקרוליטר של מגיב לזיהוי לוציפרין משוחזר לכל באר. מערבבים את התמיסה למשך 15 שניות על השייקר, ולאחר מכן דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, טען את הצלחת על קורא לוחות ובחר שנה פריסה. תחת הכרטיסייה פרמטרים בסיסיים, יש לבחור צלחת 96 בארות ואופטיקה עליונה ולהגדיר את עיכוב המיקום ל-0.1, את זמן התחלת המדידה לאפס, את זמן מרווח המדידה לאחד ואת הזמן לנרמל את התוצאות לאפס. הגדר את החסר, התקנים והדוגמאות ולחץ על התחל מדידה.לאחר מכן ייצא את הנתונים כקובץ גיליון אלקטרוני וחשב את ריכוז הגלוטתיון בכל דגימה על ידי אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית. כדי למדוד את כדאיות התא, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום שלם בתוספת 1% FBS לבאר, והנח את התאים בחממת תרבית התאים עד לניתוח. לאחר איסוף תאי ARPE-19 לא מטופלים מהתרבית, יש להשעות מחדש את התאים ב-100,000 תאים למיליליטר במדיום DMEM Hams F-12 בתוספת ריכוז של 1% FBS.לאחר מכן, הכינו שבעה דילולים סדרתיים של 1:1 ב-200 מיקרוליטר של מדיום בתוספת 1% FBS, והעבירו 100 מיקרוליטר מכל תקן לבארות המתאימות של צלחת של 96 בארות בשכפול. מוסיפים 50 מיקרוליטר של תערובת ריאגנטים טריים לכל הבאר ומערבבים את התאים עם התערובת למשך 15 שניות על השייקר לפני הדגירה של הצלחת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מדוד את הזוהר כפי שהודגם.לאחר קבלת המדידה, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב ליזה לכל באר למשך 15 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מדוד שוב את הזוהר והשתמש בנוסחה כדי לחשב את אחוז התאים הקיימאים. 24 שעות של טיפול במי חמצן של 50 ו-100 מיקרו-מולרי אינן משפיעות על ייצור הגלוטתיון התוך-תאי, בעוד שירידה משמעותית של גלוטתיון נצפית כאשר התאים מטופלים במי חמצן של 350-500 או 700 מיקרו-מולרי ריכוז. מבחינה מורפולוגית, תאים שטופלו במי חמצן נראים פחות מפוזרים ומעוגלים יותר עם ריכוזים הולכים וגדלים של התרכובת.השפעה זו הייתה פחות בולטת עבור תאים שעברו טרנספטציה של PEDF ו-GM-CSF שטופלו במי חמצן. חשוב לציין שמספר התאים משפיע על עקה חמצונית בתיווך מי חמצן, שכן רמת הגלוטתיון ירדה באופן מובהק סטטיסטית לאחר טיפול במי חמצן בבארות שנזרעו עם 5,000 תאים בלבד. תאים שטופלו או עברו טרנספטציה כדי לבטא PEDF ו/או GM-CSF מייצרים הרבה יותר גלוטתיון בהשוואה לתאי ביקורת שלא טופלו בתנאי חמצון.בנוסף, רמת ביטוי הגן UCP2 בתאים שעברו טרנספטציה של PEDF ו-GM-CSF מוגברת לאחר מי חמצן, אם כי העלייה אינה מובהקת סטטיסטית. ניתוח כתמים מערביים של AKT זרחני מליזאט של תאים שעברו טרנספטציה של GM-CSF שנחשפו למי חמצן מראה רק ירידה קטנה בזרחון בהשוואה לתאי הביקורת הלא מטופלים, מה שמצביע על כך ש-GM-CSF יכול להגן על התאים מפני נזקי עקה חמצונית. חשוב לזרוע את התאים בצפיפות הנכונה, להשתמש בתמיסת מי חמצן טרייה ולהוסיף חלבונים טריים למדיום.לאחר אישור ההשפעה נוגדת החמצון של גורמי הגדילה באמצעות מודל מי חמצן, ניתן לבדוק את הגורמים במודל מחלות עיניים הקשורות למתח חמצוני. מודל העקה החמצונית הנוכחי של מי חמצן מאפשר להעריך את ההשפעות נוגדות החמצון שיכולות להיות לגורמים שונים, ולכן תומך בפיתוח טיפולים גנטיים חדשים.

induction-analysis-oxidative-stress-sleeping-beauty-transposon

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שיטת ההקרנה לזהות סביבות הסלולר חמצוני היא למדוד את החמצון של CM-H2DCFDA. לאחר חמצון מן הלא למתחם ניאון ניאון בתוך, תא CM-H2DCFDA שינויים. שינוי זה של הקרינה נמדדת cytometry זרימה ומציין את מספר התאים בסביבה חמצוני.

הקרנת Assay עבור סטרס חמצוני בתוך הקו Cell חתולים Astrocyte, G355-5

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול למדידת מתח חמצוני בעוברי דג זברה חיים. הליך זה מאפשר זיהוי מיני חמצן תגובתיים (ROS) הן ברקמות עובר שלמות והן באוכלוסיות תאים בודדים. פרוטוקול זה יבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים כאחד.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

אור קסנון לא קוהרנטי הועבר דרך הפרעות צרות פס ומסנני צפיפות ניטרלית כדי להעביר אור באורך גל ועוצמה משתנים לתאים מתורבתים. פרוטוקול זה שימש להערכת ההשפעות של טיפול באור אדום/קרוב לאינפרא אדום על ייצור מינים תגובתיים במבחנה: לא נצפו השפעות באמצעות הפרמטרים שנבדקו.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני במבחנה

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

אנו מציגים מכשיר חדשני למדידת קצבי צריכת חמצן (OCR) בתרביות אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE). המכשיר יכול למדוד OCR במשך שבועות בכל פעם על RPE גדל על לוחות תרבית תאים סטנדרטיים עם מדיה סטנדרטית בעוד הלוחות נמצאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי.

ניטור ארוך טווח של שיעורי צריכת החמצן בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית מובחנות ומקוטבות מאוד

שיטה של ​​זיהוי נהגים לא ידועים של היווצרות הסרטן באמצעות גישה משוחדת מתוארת. השיטה...

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

למדו ליצור מודל עקה חמצונית בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ARPE-19 באמצעות מימן פרוקסיד. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעות נוגדות חמצון של חלבונים לטיפול בניוון שרירי עין קשור בגיל.

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

גלה סרטונים נוספים