שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

שיטה זו מדגימה טרנספקציה מבוססת אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת, עדות לביטוי טרנסגני ולהפרשת חלבונים. השילוב של מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת ואלקטרופורציה מאפשר העברה יעילה של תאי אפיתל פיגמנטים אנושיים ראשוניים, כמו גם ביטוי טרנסגנים יציב ומתמשך והפרשת חלבונים. המטרה הכוללת היא להקים טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול במחלות ניווניות ברשתית, הדורש הפרשה יציבה ומתמשכת של החלבון הפעיל מבחינה טיפולית.

המדגימים את ההליך יהיו אן פריאלדנהובן ואנטיה שייפר, עוזרים טכניים רפואיים מהמעבדה. כדי להכין דנ"א פלסמיד לאלקטרופורציה ראשונית של תאי RPE אנושיים, השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח כדי לכמת את תכולת הדנ"א הפלסמיד, והתאם את הריכוז ל-250 ננוגרם למיקרוליטר ב-10 מילימולר Tris-HCL. ערבבו נפח אחד של 250 ננוגרם למיקרוליטר של דנ"א פלסמיד טרנספוזאז SB100X עם 16 נפחים של 250 ננוגרם למיקרוליטר של פיגמנט אפיתל שמקורו בגורם טרנספוזון פלסמיד DNA.

הוסף שני מיקרוליטרים של תערובת הפלזמה המתקבלת לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר נעילה בטוחה על קרח ומלא צינור חיץ עם שלושה מיליליטר של חיץ E.ואז הכנס את הצינור לתחנת פיפטה עד לשמיעת קליק והגדר את מכשיר הטרנספקציה ל -1, 100 וולט, רוחב פולס של 20 אלפיות השנייה ושני פולסים. כדי להכין את התאים לאלקטרופורציה. ראשית, בדוק את המורפולוגיה של תרביות תאי RPE ראשוניות באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי להעריך את גדילתן ומפגשן.

טפלו בתאים עם 500 מיקרוליטרים של 0.05% טריפסין EDTA לכל באר במשך שבע עד 15 דקות באינקובטור תרבית התאים. כאשר התאים מתנתקים לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, יש לתלות את התאים במיליליטר אחד של PBS ולבצע צנטריפוגה אחת עד 10 פעמים 10 לארבעת התאים האליקוטים לכל תגובת טרנספקציה. השהה את הכדורים ב -11 מיקרוליטרים של חיץ R לכל צינור והוסף שני מיקרוליטרים של תערובת הפלסמיד המוכנה לכל צינור.

הכנס את ראשו של פיפטה טרנספקציה לתוך קצה תעתיק של 10 מיקרוליטר עד שהמהדק מרים במלואו את גזע ההרכבה של הבוכנה וטוען את תמיסת התא והפלסמיד לתוך קצה הטרנספקציה. הכנס את פיפטה הטרנספקציה לתוך צינור החיץ הממוקם בתוך תחנת הפיפטה עד לשמיעת נקישה ולחץ על התחל כדי להתחיל בתהליך האלקטרופורציה. לאחר הטרנספקציה הסר בזהירות את פיפטה הטרנספקציה מתחנת הפיפטה ומיד פיפט את התא ואת תמיסת הפלסמיד לתוך הבארות המוכנות של צלחת תרבית התא.

כדי לטהר את הפיגמנט המתויג שלו אפיתל נגזר חלבון היתוך גורם מתרבית תאי RPE supernatants. ראשית, השתמש בקצה חתך משופע כדי לאסוף אליקוט אחד של 30 מיקרוליטר של ניקל NTA slurry לכל דגימה וכדור שרף NTA ניקל על ידי צנטריפוגה. בזהירות להשעות את שרף ניקל NTA עם 200 microliters של מאגר הדגירה One X ו גלולה את הפתרון עם צנטריפוגה נוספת פעמיים.

לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש להשעות בזהירות את כדורי השרף של ניקל NTA עם 40 מיקרוליטרים של מאגר דגירה Four X לכל דגימה. לאחר מכן מערבבים 55 מיקרוליטרים של אליקוט אחד של ניקל NTA שטופל מראש עם 260 מיקרוליטרים של מאגר דגירה של Four X ו-900 מיקרוליטרים של כל תרבית תאי RPE שעברה טרנספקציה. מדגרים את התערובת על שייקר מתנדנד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות ומניחים שוב את תערובת שרף הניקל NTA.

החזירו בזהירות את הכדורים ב-175 מיקרוליטרים של חיץ דגירה One X וצנטריפוגות של התערובות פעמיים נוספות. לאחר הצנטריפוגה השנייה יש להשעות בזהירות את כדורי השרף של ניקל NTA ב-30 מיקרוליטרים של חיץ Elution למשך דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור וצנטריפוגה של הדגימות שוב. לאחר מכן אספו בזהירות את הסופרנאטנטים וערבבו אותם עם מאגר דגימת Two X SDS לניתוח דם מערבי של החלבונים המטוהרים.

תאי RPE ראשוניים מעובדים שבודדו מעיני התורם האנושי מדגימים מורפולוגיה טיפוסית ללא קשר לגיל התורם, זמן הבידוד לאחר המוות או זמן הטיפוח. יישום של פולסים חשמליים לטווח קצר על תאי RPE אנושיים ראשוניים. השימוש במערכת הטרנספקציה הנימית אינו משפיע לרעה על המורפולוגיה האפיתלית.

ניתוח דם מערבי של תרביות-על של תרביות תאי RPE אנושיות ראשוניות שעברו טרנספקציה מדגים הפרשת גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי ברמות עקביות ללא השתקה טרנסגנית במשך יותר מ-500 יום. כפי שנצפה בניתוח דם מערבי מייצג זה של מדיום תרבית תאים מטרנספקציות שבוצעו באופן סדרתי, שיעור הפרשת גורם אפיתל פיגמנטי גבוה יותר באופן אוניברסלי נצפה ב -21 יום לאחר הטרנספקציה. בתרבות נרדפת, הפרשת PEDF מוגברת לטווח ארוך נמשכת לפחות 165 יום.

בנוסף, כימות מבוסס ELISA חושף עלייה של פי 20 בהפרשת הגורם הכולל של אפיתל פיגמנט בתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה, בהשוואה לתאי בקרה שאינם מועברים בהתאמה. תוספת זו אושרה גם ברמת ביטוי הגנים שבה הביטוי הכולל של PEDF הועלה יותר מפי 30. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בתאי אפיתל פיגמנטיים שהמורפולוגיה שלהם תואמת את מצב In Vivo.

כמו כן, זכור למשוך את תמיסת התא לתוך קצה transfection ללא בועות אוויר. ניתן להשתמש בתאים היציבים שעברו טרנספקציה במודלים שונים של Ex Vivo או In vivo כדי לאמת את הפונקציונליות של טיפול נוסף גנטי מבוסס תאים זה.