יישום מערכת RatWalker לניתוח הליכה במודל חולדה גנטי של מחלת פרקינסון
18 בינואר 2021
כאן אנו מתארים את מערכת RatWalker, שנבנתה על ידי תכנון מחדש של מנגנון MouseWalker כדי להתאים לגודל ולמשקל המוגדלים של חולדות. מערכת זו משתמשת בהשתקפות פנימית כוללת מתוסכלת (FTIR), לכידת וידאו במהירות גבוהה ותוכנת ניתוח בגישה פתוחה כדי לעקוב אחר פרמטרים של הליכה ולכמת אותם.
שיטה זו מאפשרת לכמת באופן משוחזר הבדלים בפרמטרים של הליכה. ניתן להעריך את פרמטרי ההליכה במכרסמים ההולכים בחופשיות, והטכניקה אינה מסתמכת על צעדים פולשניים כגון טבילת כפות הרגליים בדיו. מי שידגים את ההליך יהיה בן למברטי.
התחילו על ידי הצבת כלוב ביתי בסוף השביל לפני תחילת כל ריצה, כדי לשמש רמז חיובי עבור החולדה לחצות את השביל. כבו את אורות החדר. הפעל את המצלמה והתחל להקליט מספר שניות לפני שהחולדה מונחת על הרציף.
עם התקנת המארז, הניחו את החולדה בקצה השביל, מול הכלוב הביתי, ואפשרו לה לחצות את השביל בצורה לא מאולצת. הפסק להקליט ברגע שהחיה מגיעה לקצה השביל. נקו את השביל באמצעות 70% אתנול ומגבת לא שוחקת בין ריצות ולאחר שבעל חיים משתין או עושה את צרכיו.
לאחר מכן, לאפשר אתנול להתאדות לפני הצגת חיה אחרת. הריצו את החולדות לאורך השביל בסך הכל שבע פעמים במהלך כל תקופת תצפית, ולקחו את שלוש הריצות הראשונות שקיבלו ציון עובר לניתוח. ציון ריצה כעובר אם בעל החיים עושה ארבעה צעדים רצופים או יותר לכיוון הכלוב הביתי ללא הפרעה עקב טיפוח, השתהות או תנועות שגויות.
ניתוח הליכה בוצע על חולדות פרא ופרקין DKO זכרים בגיל חודשיים כדי לקבוע אם השימוש בניתוח הליכה קינמטי יכול לחשוף ליקויים מוטוריים עדינים לפני הופעת בעיות מוטוריות גסות. למרות המשקל המוגבר של חולדות DKO, לחץ כף הרגל שהופעל על משטח ההליכה לא השתנה. לאחר הערכה של מספר פרמטרים של הליכה כפונקציה של מהירות הליכה, נמצא כי מהירות ההליכה ואורכי הצעדים דומים בין חולדות מסוג בר וחולדות DKO.
השונות בין חולדות מסוג בר לחולדות DKO באה לידי ביטוי בשלב העמידה ובמשך הנדנדה במהירויות הליכה איטיות יותר. החלק של מחזור הצעד שבו הרגל נמצאת בשלב העמידה היה גורם החובה. יותר זמן בילה בשלב הנדנדה מאשר בשלב העמידה ככל שגורם החובה ירד.
יתר על כן, בעוד שמהירויות הנדנדה גדלו עם העלייה במהירות בחיות בר, המתאם היה קהה בחולדות DKO. ניתוח ההליכה של FTIR שימש גם ליצירת חלקות של עקבות שלב העמידה של כל רגל ביחס לגוף בחולדות ההולכות בחופשיות. לאחר השוואת מיקום הכפות, נצפו שינויים משמעותיים ב- AEP וב- PEP.
מספר פרמטרים נוספים השתנו באופן משמעותי בחולדות DKO בהשוואה לסוג הבר. מהירות הנדנדה של הגפיים האחוריות השמאלית והימנית הוגדלה בחולדות DKO, בעוד שמשך הנדנדה של הגפיים האחוריות השמאלית והימנית הופחת. התקנה עקבית של ציוד, כולל מיקום המצלמה ביחס ל- RatWalker, חשובה ליישום מוצלח של פרוטוקול זה.
לאחר ביצוע פרוטוקול זה, בעלי חיים זמינים לכל התנהגות נוספת או נקודות קצה ניסיוניות הדרושות. לדוגמה, שינויים בהליכה יכולים להיות מתואמים עם שינויים היסטולוגיים. טכניקה זו יכולה לשמש להערכת הליכה במודלים אחרים של מכרסמים שאינם PD, כגון מודלים של חרדה ודיכאון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג את מערכת RatWalker, שנועדה לנתח הליכה של עכברים חופשיים תוך שימוש בהחזרת בליעה פנימית מתוסכלת (FTIR) ולכידת וידאו במהירות גבוהה. היא מאפשרת כימות מדויק של פרמטרי הליכה, ומספקת תובנות לגבי הפרעות מוטוריות, במיוחד בעכברים Parkin DKO שעברו שינוי גנטי.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ניתוח התנהגותי
- הערכת הליכה
רקע
- ניתוח הליכה במכרסמים מסתמך בדרך כלל על שיטות פולשניות.
- מחקרים קודמים הראו את הצורך בטכניקות לא פולשניות משופרות להערכת תפקוד מוטורי.
- RatWalker הוא שינוי של מערכת MouseWalker כדי להתאים למכרסמים גדולים יותר.
- מערכת זו יכולה לסייע בזיהוי חסרונות מוטוריים עדינים לפני התפתחות תסמינים ברורים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לא פולשנית לניתוח הליכה בעכברים.
- לחקור הבדלים בהליכה בין עכברים מסוג בר (wild-type) לעכברים Parkin DKO.
- ליצור פרוטוקול אמין למעקב אחר פרמטרי הליכה על פני מספר ניסיונות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מערכת RatWalker שימשה לניתוח הליכה של עכברים חופשיים.
- עכברים זכרים מסוג בר (wild-type) ו-Parkin DKO בגיל שנתיים חודשים היו המודלים הביולוגיים.
- לא הוזכרו זרימות multiomics במחקר.
- העכברים הלכו על המעבר שבע פעמים, עם ניקוד המבוסס על צעדים עוקבים.
- פרמטרי הליכה כומתו באמצעות FTIR וניתוח וידאו.
תוצאות מרכזיות
- ניתוח הליכה גילה הבדלים משמעותיים במשך הפאזה התומכת ומשך הנדנוד של עכברי DKO במהירויות איטיות יותר.
- למרות מהירויות הליכה דומות, עכברי DKO הפגינו פרמטרי הליכה זמניים שונים בהשוואה לעכברים מסוג בר (wild-type).
- נצפו שינויים חשובים במיקום כף הרגל ובמהירויות הנדודות בעכברי DKO.
- המחקר מדגיש את החשיבות של עקביות הציוד להשגת תוצאות מהימנות.
מסקנות
- מערכת RatWalker מאפשרת ניתוח הליכה לא פולשני עם פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במודלים שונים של מכרסמים.
- הממצאים תורמים להבנת תפקוד מוטורי לקוי במודלים גנטיים של מחלות.
- ההשלכות מתייחסות לחקירת הפרעות בהליכה הקשורות למצבים נוירולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Early detection of subtle motor impairments in genetic models supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. The RatWalker system enables non-invasive, quantitative gait analysis that can identify phenotypic changes prior to gross motor deficits, improving predictive confidence in preclinical screening. This approach aids in prioritizing therapeutic candidates by providing translatable biomarkers of functional decline in Parkinson’s disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying gait parameters in genetic rat models of Parkinson’s disease.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible assessment of motor function in freely-walking rodents.
- Predictive Value: Facilitates early phenotypic characterization to inform target confidence and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution gait data including stance phase, swing duration, and paw positioning for comparative analysis.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts suitable for assay development and compound screening campaigns.
- Reproducibility: Requires consistent equipment setup and scoring criteria to ensure reliable data across trials and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Correlates gait alterations with histological endpoints to bridge behavioral and neuropathological findings.
- Disease-Relevant System: Models early-stage motor dysfunction in genetic Parkinson’s disease prior to overt symptom onset.
- Mechanistic De-risking: Identifies gait-based biomarkers that reflect underlying neuropathology in Parkin/Pink1-deficient models.
Pipeline & Workflow Integration
The RatWalker system fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling iterative assessment of motor phenotypes across study phases.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring gait deficits in genetic models to validate target engagement and pathway modulation.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for evaluating therapeutic effects on motor function in rodent models.
- Analytics: Delivers kinematic parameters such as duty factor, swing speed, and step symmetry for objective comparison between genotypes.
- Translational Research: Enables correlation of gait changes with neurodegeneration markers to support biomarker alignment and pathophysiological insight.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, non-invasive platform applicable across multiple neurological disease models beyond Parkinson’s disease.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by detecting early motor impairments that mirror clinical prodromal symptoms.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized walkway traversal, scoring thresholds, and environmental controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing reliance on late-stage phenotypic readouts in preclinical development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying models with construct validity for therapeutic screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience and video-based motion analysis for proper setup and interpretation.
- Depends on consistent camera positioning, lighting conditions, and walkway sanitation to minimize variability.
- Necessitates cross-team agreement on run scoring criteria (e.g., four consecutive steps) to ensure data comparability.
- Must account for species-specific locomotion patterns when adapting the system to other rodent models or strains.
- Limited to assessing temporal and spatial gait parameters; does not capture complex locomotor sequences or fine limb kinematics without supplementary methods.
