הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתפקוד הפיזיולוגי של בלוטות המין, כולל תפקידם של סטרואידים מיניים בפלסטיות המערכת הנוירואנדוקרינית ובוויסות בטלאוסטים ובמידה רבה יותר בבעלי חוליות. פרוטוקול זה מאפשר לבצע כריתת גונדקטומיה בשיעור הצלחה גבוה במודל קטן teleost medeka, הנמצא בשימוש נרחב בקהילת המחקר. על מנת להצליח ולהשיג שיעור הישרדות גבוה, טכניקה זו דורשת הכשרה מתאימה, במיוחד בהערכת בלוטות המין ותפירת הדגים.

התחל בהוצאת הדג מתמיסת ההרדמה והנחתו אופקית על צדו תחת מיקרוסקופ דיסקציה. כדי לבצע את כריתת השחלות אצל נקבות, יש לגרד את הקשקשים באזור החתך. בצע בעדינות חתך של שניים עד 2.5 מילימטר בין הצלעות לסנפירי האגן ופי הטבעת באמצעות סכין גילוח.

צובטים את בטן הדג בעדינות תוך הוצאת השחלות בעזרת מלקחיים עדינים עם קצה רחב. חשוב להימנע משבירת הצלעות, שעלולה לגרום למוות. חותכים את קצה השחלות בעזרת המלקחיים העדינים ומניחים בצד.

כדי לבצע את כריתת הסחלבים אצל זכרים, בצע חתך בין הצלעות מעל פי הטבעת ופתח את החתך לאט בעזרת מלקחיים עדינים. תפסו בעדינות את האשכים בעזרת המלקחיים והוציאו אותם לאט. ואז חותכים את קצה האשכים כדי להסיר אותם לחלוטין.

לאחר ביצוע ההליך, יש לתפור את החתך באופן דומה לגברים ולנקבות. הנח את חוט הניילון ליד אזור החתך ודקר את העור מהצד הימני של החתך דרך חלל הגוף הפנימי, באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כדי להכניס את החוט פנימה. לאחר מכן, נקב את העור מהצד השמאלי של החתך דרך חלל הגוף החיצוני כדי להוציא את החוט החוצה.

סגור את פתח החתך, צור שני קשרים וחתוך את החוט העודף. מניחים את הדגים במי ההתאוששות האיזוטוניים, ומשאירים אותם שם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום. הרכיבו את מגירת הדם על ידי הצמדת מחט זכוכית לנימי הסיליקון.

שוברים את קצה המחט בעזרת מלקחיים רחבים ומצפים את פנים המחט בתמיסה נוגדת קרישה על ידי יניקה ונשיפה. כוון את המחט לכיוון אזור הפדונקל של הדג, מכוון אל וריד הפדונקל הזנבי, ושאב את הדם באמצעות הפה עד למילוי לפחות 1/4 מהנפח הכולל של המחט. שחרר את המחט והניח פיסת סרט ליד הצד החד.

הניחו מכסה עם חור על צינור איסוף והכניסו את המחט לתוך הצינור דרך החור עם קצה המחט מבחוץ. מניחים את הדגים במי ההתאוששות ומשאירים אותם שם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום. הבזק סובב את הדם למשך שנייה עד שתיים ב-1,000 פעמים G כדי לאסוף את הדם בצינור.

שיעור ההישרדות לאחר כריתת שחלות, או OVX, בנקבות היה 100% ו-94% בזכרים לאחר כריתת סחלבים. כל הדגים שרדו את הליך דגימת הדם. נקבות שעברו ניתוח דמה הראו תנוחת OV.

כל הביציות הופרו והמשיכו להתפתחות עוברית. כאשר הליך כריתת גונדקטומיה בוצע כהלכה, צורת הגוף של הדג השתנתה מעט, ולא נותרו חתיכות בלוטת המין. החתך והתפר נעלמו לחלוטין ארבעה שבועות לאחר כריתת גונדקטומיה.

לאחר ארבעה חודשים, כל הדגים עדיין הראו פנוטיפ בריא ולא נמצאה רקמת בלוטת המין. בדיקת דם בנקבות גילתה שרמת ה-E2 בדגי OVX הייתה נמוכה משמעותית מאשר בדגים שנותחו בדמה 24 שעות לאחר הניתוח. לאחר ארבעה חודשים, רמת ה-E2 בדגי OVX עדיין הייתה נמוכה משמעותית מאשר בדגים המופעלים בדמה.

דגי OVX חלקיים, שבהם רק 1/3 עד 1/2 מבלוטת המין הוסרו, הראו רמות E2 נמוכות משמעותית מאשר דגים המופעלים בדמה, ורמות E2 גבוהות משמעותית מדגי OVX מלאים. ריכוז ה-11-KT בזכרים שעברו סחלב היה נמוך משמעותית מאשר בדגים שעברו ניתוח דמה 24 שעות לאחר הניתוח. לאחר ארבעה חודשים, רמת ה-11 KT עדיין הייתה נמוכה יותר מאשר בדגים המופעלים בדמה.

דגים שעברו סחלב חלקית הראו רמות נמוכות יותר של 11-KT מאשר דגים המופעלים על ידי דמה ורמות גבוהות יותר מדגים שעברו סחלב מלא. כדי להבטיח שההליך יצליח, חיוני להסיר את בלוטת המין בזהירות ובשלמות ככל האפשר, מבלי לפגוע באיברים אחרים בתוך הדג. מכיוון שידוע שסטרואידים מיניים ממלאים תפקיד חשוב בפלסטיות המוח ותאי יותרת המוח, טכניקה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקירת המנגנונים הבסיסיים במודלים טלאוסטים קטנים.