Name: דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למדו לבנות מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית חיה אקס-ויבו. שיטה זו מאפשרת שימור תאי שומן, תאי חיסון ומבנים וסקולריים לחקר אינטראקציות גידוליות ופיתוח תרופות מותאמות אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לסיטומטריית זרימת טוליין וליבת מיון התאים, כמו גם לליבת ההיסטולוגיה של טוליין על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הדרום-מזרחית למנתחים פלסטיים ומשחזרים 2019 מענק מחקר והקרן הלאומית למדע (מסלול EPSCoR 2 RII, OIA 1632854).

כל הרקמות האנושיות נאספו בהתאם לפרוטוקול #9189 כפי שאושר על ידי משרד ועדת הביקורת המוסדית של LSUHSC.
1. זריעה של תאי גזע (ASCs) שמקורם בשומן עבור יריעות תאים
<ol><li>לרכוש ASCs ממקורות מסחריים או לבודד מרקמת השד האנושית העיקרית על ידי ביצוע פרוטוקולים הוקמה8,9. זרע ASCs השד האנושי ב 70% צפיפות (~ 80,000 תאים / ס"מ2 שטח פנים) על 6-טוב צלחות תרבית רקמות סטנדרטיות בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברי, ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (BC-MPS מדיה). ודא ש- ASCs שישמשו ליצירת גליונות התאים צריכים להיות פחותים ממעבר 10.<ol>
<li>עבור כל באר של מערכת מיקרופיזיולוגית של סרטן השד (BC-MPS) שייווצרו, תאי זרע ב 1 תרבות רקמה סטנדרטית היטב 1 גם בגודל דומה על פולי (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm)מצופה רקמה תרבות צלחת פלסטיק. צלחת אחת של 6 בארות של BC-MPS תדרוש תרבית רקמה סטנדרטית אחת 6 צלחת באר (למטה) וצלחת מצופה pNIPAAm אחת (למעלה). את לוחות ה-pNIPAAm ניתן לרכוש ממקורות מסחריים, או לציפוי במעבדה10,11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תרבות ASCs באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. לשנות את התקשורת כל 2-3 ימים בארון biosafety.</li>
	<li>תרבות ASCs עד שהם הופכים 100% confluent וליצור דפוס מפוספס. בהתאם למפגשו שבו הם זרעו, זה ייקח 7-10 ימים. גיליונות תאים קונפלונטיים נדרשים לעגן את רקמת השד השומן המצוף.</li>
</ol>2. הכנת אספקה הדרושה ל- BC-MPS
<ol><li>כדי להכין ג'לטין עבור 6-באר צלחות לעשות 12% פתרון ג'לטין Hמזוקק 2O. לערבב 19 גרם של סוג ג'לטין B (חוזק ג'ל של ~ 225 בלום) ו 125 מ"ל של H2O בבקבוק 250 מ"ל זכוכית מדיה. הוסף 1.6 מ"ל של 1 M NaOH לפתרון כדי לנטרל את ה- pH.</li>
	<li>Autoclave את הפתרון תחת מחזור נוזלי במשך 25 דקות כדי לעקר את הפתרון.</li>
	<li>אפשר לפתרון להתקרר עד 37 °C (60 °F). בארון biosafety סטרילי להוסיף 16 מ"ל של סטרילי 10x הנקס פתרון מלח מאוזן (HBSS) לפתרון כדי להשיג נפח סופי של 160 מ"ל. הערה: ניתן להשתמש בתמיסת הג'לטין באופן מיד או לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר. הג'לטין המוכן יציב בטמפרטורת החדר למשך חודש. אם רק כמה בוכנות יהיה צורך אז פתרון 10 מ"ל יכול להיעשות סטרילי מסונן באותו יום כמו ביצוע BC-MPS כפי שתואר קודםלכן 7.<ol>
<li>כדי להכין פתרון ג'לטין על ידי עיקור מסנן, לדלל 1 מ"ל של 10x HBSS עם 9 מ"ל של H2O כדי להפוך פתרון 1x HBSS בצינור חרוט 15 מ"ל. הוסף 100 μL של 1 M NaOH לכל צינור 10 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 0.7 גרם של ג'לטין לפתרון. מערבבים את הפתרון במרץ כדי להמיס את הג'לטין.</li>
		<li>דגירה הצינור באמבט מים 75 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות רועד כל 5 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן מזרק 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון ג'לטין. מסננים את תמיסת הג'לטין ישירות על הוכנות בארון בטיחות ביולוגית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D להדפיס או להשתמש אקריליק פשוט כדי להפוך את הוכנות המשמשות להעברת גיליונות התא. ודא כי הבוכנות להתאים באופן רופף בגודל הרצוי של היטב. בוכנה רגילה המודפסת בתלת-ממד מוצגת באיור 1. ניתן לתכנן את הכוענים באמצעות תוכנת תכנון סטנדרטית בסיוע מחשב כגון TinkerCad ומודפסת באמצעות מדפסות תלת-ממד חוטיות התואמות לחומצה פולילקטית (PLA)13,14.</li>
	<li>כדי להכין מתלה להחזקת הבוכנות מניחים מתלה צינור 15 מ"ל בארון biosafety. מניחים בוכנות הפוכות במתלה, כך שתחתית הבוכנות פונה כלפי מעלה. מניחים קופסת פלסטיק עם מכסה להובלת BC-MPS בארון biosafety. מומלץ שהתיבה תהיה באורך של לפחות 35.5 ס"מ x רוחב 28 ס"מ x גובה 8.25 ס"מ כדי להתאים ל-4 לוחות BC-MPS. הסר את המכסה מהתיבה וריסוס במורד ארון התקשורת, הבוכנות והתיבה עם 70% EtOH.</li>
	<li>הכינו סכיני גילוח ומלקחיים סטריליים על ידי תיל אוטומטי או על ידי הנחתם בארון biosafety וכביסה עם 70% EtOH.</li>
	<li>לרסס את הבוכנות ואת התיבה עם 70% EtOH ולהדליק את אור UV בארון biosafety לפחות 30 דקות כדי לעקר את האספקה.</li>
</ol>3. להכין בוכנות ג'לטין ולהחיל על יריעות התא העליון
<ol><li>אם פתרון הג'לטין הוכן בעבר, מחממים אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס אותו.</li>
	<li>פיפטה פתרון ג'לטין על הבולענים בארון biosafety באמצעות פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל. בוכנה עבור 1 באר של צלחת 6-באר ידרוש ~ 2.5 מ"ל של ג'לטין.</li>
	<li>לאחר הג'לטין התגבש על הכובעים (~ 30-45 דקות) להעביר את לוחות ASC מצופה pNIPAAm לארון biosafety. מניחים בעדינות את הבוכנות בבארות של צלחות ASC מצופות pNIPAAm כך הג'לטין יוצר קשר עם ASCs. מניחים מכונת כביסה מתכת (~ 7.5 גרם) על הבוכנה כדי להכביד על הבוכנה, כך ג'לטין נמצא במגע ישיר עם גיליון התא ASC. השאירו את הכוענים על גיליונות התא ASC בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>בעדינות להזיז את הצלחת עם הבוכנות לתוך התיבה סטרילית בארון biosafety ומניחים את המכסה על זה. מעבירים את התיבה למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אם מקרר 4 מעלות צלזיוס אינו זמין מניחים את הצלחת על קרח בדלי קרח בארון biosafety במשך 30 דקות.</li>
</ol>4. הכנת קווי תאים סרטניים
<ol><li>זרע את קווי התאים הסרטניים בצלחת תרבית רקמת T75 סטנדרטית ולשמור אותם בתרבות, כך שהם ~ 80% confluent ביום BC-MPS יעובד. (~ 200,000 תאים סרטניים יהיה צורך לכל BC-MPS). לגדל את התאים הסרטניים בתקשורת נורמלית. הערה: כדי לזהות ולבודד את התאים הסרטניים מומלץ כי התאים הם transfected עם חלבון פלואורסצנטי כדי להבדיל אותם מן ASCs ורקמת השד. מספר התאים הסרטניים הדרושים לכל BC-MPS עבר אופטימיזציה לתאי MCF7 ומד"א-MB-231. קווי תא אחרים עשויים לדרוש מיטוב נוסף.</li>
	<li>ביום שבו BC-MPS הוא להיות מוכן להעביר את הבקבוק המכיל את התאים הסרטניים לארון biosafety. שאף את התקשורת מהבקבוקון. לשטוף את הבקבוק עם 5 מ"ל של PBS.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לבקבוק המכיל את התאים הסרטניים ולאחר מכן לדגר את הבקבוק באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים נותקו (~ 2-5 דקות).</li>
	<li>בארון biosafety להוסיף 9 מ"ל של PBS לבקבוק, להעביר את התאים PBS לתוך צינור חרוט 15 מ"ל ולספור את מספר התא באמצעות המוציטרומטר.</li>
	<li>צנטריפוגה התאים הסרטניים ב 500 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים במדיית BC-MPS כך שיהיו 2 x 106 תאים/מ"ל.</li>
	<li>מניחים את התאים הסרטניים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להתווסף לרקמה האנושית.</li>
</ol>5. עיבוד של רקמת השד האנושית
<ol><li>בארון biosafety לשטוף את רקמת השד האנושית (HBT) 3x עם 10 מ"ל של PBS סטרילי.</li>
	<li>השתמש מלקחיים סטריליים סכין גילוח כדי לטחון גס את BC-MPS ולנסות להסיר כמה שיותר fascia ורקמת חיבור ככל האפשר. כשל בהסרת רקמת החיבור עלול לגרום לשכבה העליונה של ASC לא לעגן כראוי את HBT. הערה: ניתן לזהות את הפאשיה ורקמת החיבור על ידי המראה הלבן או הברור שלה בהשוואה לצבע הצהוב של רקמת השומן.</li>
	<li>לאחר רקמת החיבור הוסר להשתמש סכין גילוח סטרילי כדי לטחון דק את הרקמה עד שיש לו עקביות נוזלי הומוגנית. הרקמה טחונה דק כאשר זה יכול בקלות להיות pipetted באמצעות קצה סרולוגי 25 מ"ל.</li>
	<li>השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את הקצה מקצה פיפטה p1000 כדי לסייע בצנרת HBT טחון.</li>
	<li>בצינור 1.5 מ"ל לערבב HBT טחון, קווי תאים סרטניים, ומדיה BC-MPS (עבור 1 גם של צלחת 6 גם זה דורש 200 μL של HBT טחון, 100 μL של מדיה BC-MPS, ו 100 μL של תאים סרטניים).</li>
	<li>להעביר את צלחת ASC שישמש עבור גיליון התא התחתון מן החממה לארון biosafety. שאף את המדיה מלוח ASC התחתון. פיפטה התערובת למרכז הבאר של צלחת ASC התחתון באמצעות קצה פיפטה p1000 כי היה סוף דיסטלי מנותק משלב 5.4</li>
	<li>הזז את התיבה המכילה את צלחת ASC העליונה עם הבוכנות עליה לארון biosafety. מוציאים בעדינות את הבוכנות לג'לטין מהצלחת מצופה pNIPAAm ומניחים על גבי תערובת HBT. הוסף מדיה BC-MPS לבאר (עבור 1 גם של צלחת 6-באר להוסיף 2 מ"ל של מדיה). בזהירות להעביר את לוחות ASC התחתון עם תערובת BC-MPS ובוכנות לתיבת פלסטיק סטרילי ומניחים את המכסה של התיבה על להובלה. הערה: מכסה צלחת 6 באר לא יתאים בחזרה על צלחת ASC בזמן הבוכנות הם על. יש להקפיד להימנע מזיהום התרבות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת התחתונה בתיבה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הג'לטין נמס, ואת שכבת ASC העליון החלה לדבוק בשכבה התחתונה (~ 30 דקות).</li>
	<li>להעביר את התיבה עם הצלחות לארון biosafety. מוציאים בעדינות את הוכנות מהצלחות התחתונות. הרקמה עם התאים הסרטניים תעוגן לתחתית הבאר.</li>
	<li>מניחים את המכסה של צלחת 6 באר בחזרה על הצלחת התחתונה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את הג'לטין ולאפשר את השכבה העליונה לעגן לחלוטין לשכבה התחתונה (~ 30-60 דקות).</li>
	<li>בעדינות להעביר את הצלחות לארון biosafety ולשאוף את התקשורת עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של מדיה טרייה לכל באר. לשאוף מקצה הבאר פיפטה על קצה הבאר, כדי למנוע עקירת הרקמה.</li>
	<li>שמור על BC-MPS ב 37 °C (70 °F) ו 5% CO 2 עבורמשך הזמן הרצוי ולשנות את המדיה כל 2-3 ימים.</li>
</ol>6. עיכול של BC-MPS לניתוח
<ol><li>כאשר BC-MPS מוכן לניתוח, להעביר את הצלחת לארון biosafety. הסר מדיה עם פיפטה סרולוגית כדי למנוע עקירה מקרית של כל רקמה.</li>
	<li>הוסף נפח אחד של PBS לכל באר.</li>
	<li>הסר את PBS עם פיפטה סרולוגית.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לכל באר. מעבירים את הצלחת חזרה לאינקובטור ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק. בארון biosafety, להשתמש מגרד תאים לנתק לחלוטין את התאים ואת הרקמה מצלחת התרבות.</li>
	<li>להעביר את הפתרון עם הרקמה לצינור חרוט 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית. הוסף 2 מ"ל של PBS לכל באר כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ולהעביר פתרון זה לצינור חרוט. אם התאים הם פלואורסצנטיים, לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.</li>
	<li>דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמדת שייקר מסלולית ב 1 x g במשך 10-20 דקות כדי לנתק לחלוטין תאים מהרקמה.</li>
	<li>בארון biosafety להשתמש פיפטה סרולוגית לשבש את כל גושים שנותרו של תאים בצינור ולסנן את המדגם דרך מסננת רקמת μm 250 לתוך צינור חדש 15 מ"ל. פיפטה הפתרון לאט דרך מסננת, כך שהוא לא עולה על גדותיו.</li>
	<li>לשטוף את מסננת עם 1 מ"ל PBS כדי לאסוף את כל התאים עדיין מסננת.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, adipocytes יהיה צף על השכבה העליונה של הפתרון בעוד תאים סרטניים ASCs יהיה מעורבב יחד גלולה בתחתית הצינור.</li>
	<li>כדי לבודד את adipocytes בעדינות לשפוך את השכבה העליונה לתוך צינור חדש או לחילופין לחתוך את הקצה את קצה פיפטה p1000 ולהעביר את השכבה העליונה לצינור חדש. צנטריפוגה המדגם ב 500 x g במשך 5 דקות שוב ולהשתמש מזרק ומחט כדי להסיר את הפתרון מתחת adipocytes כך רק adipocytes נשארים. האדיפוציטים מוכנים כעת לניתוח</li>
	<li>לאחר הסרת adipocytes מן הפתרון, להפריד את ASCs ותאים סרטניים אחד מהשני לניתוח אם התאים הסרטניים היו חרוטים בעבר עם חלבון פלואורסצנטי. לשאוף את הפתרון הנותר מן הצינור המכיל את ASCs ותאים סרטניים מבלי לשבש את גלולת התא. השתמש שוב בכדור במדיית PBS או BC-MPS והשתמש בציטומטריית זרימה כדי למיין את התאים בהתבסס על הפלואורסצנטיות.</li>
</ol>

<ol><li>DeSantis, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Breast cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).</li>
<li>NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx">https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx</a> (2020).</li>
<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1(2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+tumors+educate+the+proteome+of+stromal+tissue+in+an+individualized+but+coordinated+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner.</a> Science Signaling. 10 (491), (2017).</li>
<li>Lau, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+white+adipose+tissue%3A+A+microphysiological+system+of+primary+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).</li>
<li>Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiologic+platform+for+human+fat%3A+sandwiched+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909(2018).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+differentiation+of+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adipose-Derived+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells.</a> Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+microfluidic+channels+by+UV-mediated+graft+polymerization+of+non-fouling+and+%27smart%27+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Physics+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+Construction+of+a+multicellular+3D+scaffold+for+the+delivery+of+layered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tinkercad%22">Tinkercad</a>. , (2020).</li>
<li>Halfter, K., Mayer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+3D+tumor+models+to+the+clinic+-+predictive+value+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine.</a> Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+staining+of+neutral+lipid+droplets+for+microscopy+and+quantification+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry.</a> Bio-Protocols. 6 (17), 1912(2016).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy%2C+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Belgodere, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+breast+cancer+microenvironments+and+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+and+lipid+metabolism+in+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Druso, J. E., Fischbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+extracellular+matrix%3A+Linking+obesity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).</li>
<li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+A+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li>
<li>Chandler, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+adipose+progenitor+cells+as+physicochemical+regulators+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).</li>
<li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, 66-72 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+1A1+%28COL1A1%29+promotes+metastasis+of+breast+cancer+and+is+a+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target.</a> Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+use+of+differentiated+adipose-derived+stem+cells+and+mature+adipocytes+to+model+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).</li>
<li>Zimta, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+links+between+central+obesity+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular links between central obesity and breast cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364(2019).</li>
<li>Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+promotes+the+expansion+of+metastasis-initiating+cells+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 104(2018).</li>
<li>Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-adipose+tissue+crosstalk%3A+fuelling+tumour+metastasis+by+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485(2018).</li>
<li>Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).</li>
<li>Sabol, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+produced+by+obesity-altered+adipose+stem+cells+promotes+metastasis+but+not+tumorigenesis+of+triple-negative+breast+cancer+in+orthotopic+xenograft+and+patient-derived+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models.</a> Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67(2019).</li>
<li>Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human adipose tissues.</a> Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).</li>
<li>Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+and+body-on-a-chip+systems+for+drug+screening+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling.</a> Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).</li>
<li>Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+microphysiological+tissue+systems+of+cancer+metastasis+to+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

מערכות חדשות למידול סרטן השד האנושי נדרשות כדי לפתח הבנה טובה יותר של המחלה. פיתוח מערכות מיקרופיזיולוגיות אנושיות למידול הגדרות מחלות הכוללות ECM מקורי ותאי סטרומה יגדיל את כוח החיזוי של מחקרים פרה-קליניים. מודל BC-MPS המוצג כאן הוא מערכת שפותחה לאחרונה המתגברת על המגבלות של מודלים קודמים מאפשרת הערכה של BC בסביבת HBT המקורית שלה. מערכת זו יכולה לשמש עם קווי תאים סרטניים או עם explants הגידול והוא יציב לפחות 14 ימים. תיוג פלואורסצנטי של תאי BC מאפשר לנטר בזמן אמת את תנועתיות התאים הסרטניים ואת האינטראקציות בין תאי התא, ...

בכל שנה, יותר מ 40,000 נשים בארה"ב למות מסרטן השד (BC)1. למרות יותר מ 700 מיליון דולר שהושקעו במחקר BC מדי שנה, 97% של תרופות BC מועמד להיכשל בניסויים קליניים2,3. מודלים חדשים נדרשים כדי לשפר את צינור פיתוח התרופה ואת ההבנה שלנו של BC. התוכנית המיקרופיזיולוגית של NIH (MPS) סימנה את התכונות הנדרשות למודלים פורצי דרך לשיפור תרגום המדע הבסיסי להצלחה קלינית4. אלה כללו את השימוש בתאים אנושיים ראשוניים או ברקמות, יציב בתרבות במשך 4 שבועות, והכללה של ארכיטקטורת רקמות ילידיות ותגובה פיזיולוגית.
מודלים נוכחיים במבחנה BC, כגון תרבות דו מימדית של קווי תאים BC, ממברנה להוסיף תרבות משותפת, וספרואידים תלת מימדיים אורגנואידים, אינם עומדים בקריטריונים MPS של NIH כי אף אחד מאלה recapitulate ארכיטקטורת רקמת השד המקומי. כאשר מטריצה חוץ-תאית (ECM) מתווספת למערכות אלה, לא נעשה שימוש ב- ECM של השד; במקום זאת, ג'לים קולגן מטריצות קרום מרתף משמשים.
מערכות in vivo הנוכחי, כגון קסנוגרפטים נגזר המטופל (PDX), באופן דומה אינם עומדים בקריטריונים MPS של NIH כי רקמות חלב מורין שונים בהרבה משדיים אנושיים. יתר על כן, אינטראקציות מערכת החיסון-BC מוכרים יותר ויותר כמפתח בהתפתחות הגידול, אבל מודלים מורין immunocompromised המשמש ליצירת גידולים PDX חסרים תאי T בוגרים, תאי B, ותאים רוצח טבעי. יתר על כן, בעוד PDX מאפשר גידולים השד העיקרי להישמר ולהרחיב, הגידולים PDX וכתוצאה מכך הם הסתננו עם תאים סטרומה מורין ראשוני ECM5.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו רומן, ex vivo, תלת מימדי השד האנושי MPS העונה על הקריטריונים MPS NIH. הבסיס של MPS השד שלנו נעשה על ידי דחיקה רקמת השד האנושית העיקרית (HBT) בין שני גיליונות של תאי גזע נגזר שומן (ASCs), גם מבודד HBT (איור 1). בוכנות להעברת יריעות התא לכריך HBT יכול להיות 3D מודפס או עשוי פלסטיק אקרילי פשוט(איור 1H,I). טכניקה זו מתאימה את הגישה שתוארה לעיל שלנו עבור culturing רקמת אדיפוציטים לבנים אנושיים ראשוניים6,7. השד MPS לאחר מכן יכול להיות זרע על ידי מודל BC של בחירה, החל קווי תאים סטנדרטיים BC לגידולים השד האנושי העיקרי. כאן, אנו מראים כי BC-MPS אלה יציבים בתרבות במשך שבועות מרובים (איור 2); כוללים אלמנטים מקוריים של HBT כגון אדיפוציטים ממותה, ECM, אנדותל, תאים חיסוניים (איור 3); ולסיכום מחדש של האינטראקציות הפיזיולוגיות בין BC ל-HBT, כגון crosstalk מטבולי(איור 4). לבסוף, אנו מראים כי BC-MPS מאפשר לחקור תנועה אמובואידית של תאי BC ברחבי HBT (איור 5).

<table><tbody><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>1333</td><td>פתרון פירוק תאים להפרדת BC-MPS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td>פתרון ניתוק תאים למעבר תאים</td></tr><tr><td>מיכל BioStor 16oz</td><td>National Scientific Supply Co</td><td>MPCE-T016</td><td>להובלת רקמות סטריליות</td></tr><tr><td>תרבית תאים 75 ס"מ</td><td>קורנינג</td><td>430641U</td><td>לטיפוח ASCs</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>ThermoScientific</td><td>1631T5</td><td>לתמרון רקמות בזמן טחינה&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז נמוך, עם Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10567-014</td><td>לטיפוח ASCs ו-BC-MPS</td></tr><tr><td>FBS מוסמך</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Nunc UpCell 6 צלחות באר</td><td>ThermoScientific</td><td>174901</td><td>Top גיליון תא ASC</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס 5,000U</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 150 ס"מ</td><td>FisherBrand</td><td>FB0875714</td><td>להחזקת רקמות בזמן הטחינה&nbsp;</td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>קצה יחיד לטחינת רקמות</td></tr><tr><td>מסננת 250um&nbsp;</td><td>ThermoScientific</td><td>87791</td> להפרדת תרבית רקמות <td>BC-MPS</td></tr><tr><td>6 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>3506</td><td>תחתון ASC גיליון גיליון</td></tr><tr><td>משקולות/דסקיות</td><td>BCP מחברים</td><td>BCP672</td><td>לשקילת בוכנות למטה 1/2 אינץ' קוטר פנימי</td></tr></tbody></table>

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

סרטן השד (BC) נשאר הגורם המוביל למוות עבור נשים. למרות יותר מ -700 מיליון דולר שהושקעו במחקר BC מדי שנה, 97% מהתרופות המועמדות BC נכשלות בניסויים קליניים. לכן, מודלים חדשים נדרשים כדי לשפר את ההבנה שלנו של המחלה. תוכנית NIH Microphysiological Systems (MPS) פותחה כדי לשפר את התרגום הקליני של תגליות מדעיות בסיסיות ואסטרטגיות טיפוליות חדשות ומבטיחות. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת MPS עבור סרטן השד (BC-MPS). מודל זה מתאים גישה שתוארה בעבר של culturing רקמת שומן לבן אנושי ראשוני (WAT) על ידי דחיקת WAT בין יריעות תאי גזע נגזר שומן (ASC)s. היבטים חדשניים של BC-MPS שלנו כוללים זריעת תאי BC לתוך רקמת שד אנושית לא חולה (HBT) המכיל מטריצה חוץ תאית מקורית, adipocytes בוגרת, פיברובלסטים תושב, ותאי חיסון; וכריך תערובת BC-HBT בין גיליונות ASC נגזר HBT. BC-MPS וכתוצאה מכך יציב בתרבות ex vivo לפחות 14 ימים. מערכת מודל זו מכילה אלמנטים מרובים של microenvironment המשפיעים על BC כולל adipocytes, תאים סטרומה, תאים חיסוניים, ואת המטריצה חוץ תאית. לכן BC-MPS יכול לשמש כדי ללמוד את האינטראקציות בין BC ו microenvironment שלה. 
אנו מדגימים את היתרונות של BC-MPS שלנו על ידי חקירת שתי התנהגויות BC הידועות כמשפיעות על התקדמות סרטן ועגורות: 1) תנועתיות BC ו -2) CROSSTALK מטבולי BC-HBT. בעוד תנועתיות BC הוכח בעבר באמצעות הדמיה תוך-וvital, BC-MPS מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על פני מספר ימים. יתר על כן, בעוד crosstalk מטבולית הודגם בעבר באמצעות תאי BC ו מורין טרום adipocytes מובחן לתוך adipocytes בשלים, מודל BC-MPS שלנו היא המערכת הראשונה להדגים crosstalk זה בין אדיפוציטים mammary האדם העיקרי ותאי BC במבחנה.

יציבות בתרבות BC-MPS היא מערכת מיקרופיזיולוגית יציבה שיכולה להיות תרבותית במבחנה עד 14 ימים לפחות. תמונת שדה בהיר של גליונות התאים של ASC צולמה בהגדלה של פי 100 כדי להציג את התבנית המנוסה של גיליון המפגש (איור 2A). גיליונות התא ASC יציבים בתרבות לפחות 4 שבועות. BC-MPS ב 14 ימים בתרבות בבאר אחת של צלחת 6 באר היה בתמונה עם מצלמה צבעונית המוכיחה כי HBT ציפה עדיין מעוגן ביציבות על ידי גיליונות תא ASC לתחתית הבאר לאחר 14 ימים<strong class="xfig...

פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרופיזיולוגית במבחנה לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית ראשונית עם חומרי מדף.

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר לרקמת השד האנושית להישמר בחיים ex vivo לפרקי זמן ממושכים המאפשר ישירות את חקר האינטראקציות בין רקמת השד האנושית לסרטן השד האנושי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחתיכות מקרוסקופיות של רקמת השד האנושית כולל אדיפוציטים בשד, תאים חיסוניים, מבני כלי דם, מבני צינור ומטריצה חוץ תאית להישמר בחיים ex vivo. טכניקה זו יש השלכות משמעותיות על מספר תחומים של מחקר סרטן השד כולל רפואה מותאמת אישית, פיתוח תרופות ואת הפתופיזיולוגיה של ייזום הגידול ותהליכי סרטן שד איטיים יותר כגון פיברוזיס ושיפוץ מטריצה חוץ תאית.הוכחת הליך זה הם קתרין Hebert, סטודנט לתואר שני טוליין ורקש גורלה סטודנט לרפואה טוליין מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להמיס את הפתרון ג'לטין מוכן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. השתמש פיפטה סרולוגית חמישה או 10 מיליליטר לוותר על 2.5 מיליליטר של פתרון זה על כל בוכנה עבור בארות של צלחת שש באר.לאחר ג'לטין התגבש, להעביר את לוחות ASC מקודד pNIPAAm לארון ביו בטיחות. בעדינות למקם את הבוכנות לתוך הבארות של צלחות אלה, כך ג'לטין יוצר קשר עם ASCs. מניחים מכונת כביסה מתכת על הבוכנה כדי לשקול אותו, כך ג'לטין נמצא במגע ישיר עם גיליון ASC במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.מעבירים בעדינות את הצלחת עם הבוכנות לתיבה הסטרילית בארון הבטיחות הביולוגי ומניחים עליה את המכסה. מעבירים את הקופסה למקרר של ארבע מעלות או מניחים את הצלחת על קרח ודלי קרח בארון הבטיחות הביולוגי למשך 30 דקות. בארון ביו-בטיחות, לשטוף את רקמת השד האנושית שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי.השתמש מלקחיים סטריליים סכין גילוח כדי לטחון גס את BC-MPS ולנסות להסיר כמה שיותר fascia ורקמת חיבור ככל האפשר. לאחר רקמת החיבור הוסר להשתמש סכין גילוח סטרילי סוף סוף לרכך את הרקמה עד שיש לו עקביות נוזלי הומוגנית. חותכים את הקצה של קצה פיפטה P1000 כדי לסייע בצנרת הרקמה הטחונית.בצינור של 1.5 מיליליטר, שלבו את רקמת הטחון, את קווי התאים הסרטנים ואת המדיה BC-MPS כמתואר בכתב היד של הטקסט. להעביר את לוחית ACS שישמש עבור גיליון התא התחתון מן החממה לארון ביו בטיחות לשאוף את התקשורת מהצלחת. פיפטה תערובת רקמת השד מוכן למרכז הבאר של צלחת ACS התחתון באמצעות קצה פיפטה לחתוך, להזיז את התיבה המכילה את צלחת ACS העליון עם בוכנות לארון ביו בטיחות.מוציאים בעדינות את הבוכנות הג'לטין מהצלחת המצופה pNIPAAm ומניחים אותן על גבי תערובת הרקמות. הוסיפו את מדיית BC-MPS לבאר והזיזו בזהירות את לוחות ה-ACS התחתונים עם תערובת BC-MPS ובוכנות לתיבת הפלסטיק הסטרילית. מניחים את המכסה של התיבה על תחבורה, דואגים למנוע זיהום של התרבות.דגירה את הצלחת התחתונה בתיבה ואת החממה 37 מעלות צלזיוס עד ג'לטין נמס ואת שכבת ACS העליון החלה לדבוק בשכבה התחתונה. לאחר מכן להעביר את התיבה עם הצלחות לארון ביו בטיחות, בעדינות להסיר את הבוכנות מן הצלחות התחתונות כדי להתבונן ברקמה עם תאים סרטניים מעוגנים לתחתית הבאר. מניחים את המכסה של צלחת שש באר בחזרה על הצלחת התחתונה ואת הדגירה ב 37 מעלות כדי להמיס לחלוטין את הג'לטין ולאפשר את השכבה העליונה לעגון לשכבה התחתונה.בעדינות להעביר את הצלחות לארון ביו בטיחות לשאוף את התקשורת מקצה הבאר עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר. הוסף שני מיליליטר של מדיה טרייה על קצה כל באר כדי למנוע עקירת הרקמה. לשמור על BC-MPS ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני למשך הזמן הרצוי.לשנות את התקשורת כל יומיים-שלושה. להעביר את הצלחת לארון ביו בטיחות כאשר BC-MPS מוכן לניתוח. הסר מדיה עם פיפטה סרולוגית כדי למנוע עקירה מקרית של כל רקמה.הוסף אמצעי אחסון אחד של PBS לכל באר. לאחר מכן הסר את PBS עם פיפטה סרולוגית. הוסף מיליליטר אחד של פתרון ניתוק התא לכל באר והזז את הצלחת בחזרה לאינקובטור במשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים אלה להתנתק.לאחר הדגירה, השתמש במגרד תאים כדי לנתק לחלוטין את התאים ואת הרקמה מלוח התרבות בארון ביו-בטיחות. להעביר את הפתרון עם הרקמה צינור חרוט 15 מיליליטר ולאסוף את כל התאים הנותרים על ידי הוספת שני מיליליטר של PBS. לעטוף את הצינור עם רדיד אלומיניום אם התאים הם פלואורסצנטיים.דגירה הצינור ב 37 מעלות תחת תסיסה מתמדת בשייקר מסלולית בבת אחת G במשך 10 עד 20 דקות כדי לנתק לחלוטין את התאים מהרקמה. בארון ביו-בטיחות, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לשבש את כל גושי התאים שנותרו בצינור. ולסנן את הדגימה דרך מסננת רקמת 250 מיקרו מטר לצינור חדש של 15 מיליליטר.לשטוף את מסננת עם מיליליטר אחד של PBS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. צנטריפוגה הדגימות ב 500 פעמים g בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להפריד את adipocytes אשר יהיה צף בשכבה העליונה מן התאים הסרטניים ASCs מעורבב יחד גלולה. מעבירים את שכבת האדיפוציטים לצינור חדש בעזרת קצה פיפטה קהה.צנטריפוגה המדגם שוב ולהשתמש מזרק ומחט כדי להסיר את הפתרון הנותר מתחת adipocytes. לשאוף את הפתרון הנותר מן הצינור המכיל את ASCs ותאים סרטניים מבלי לשבש את גלולת התא. להשעות מחדש את גלולה במדיה PBS או BC-MPS ולהשתמש cytometry זרימה כדי למיין את התאים בהתבסס על פלואורסצנטיות.התבנית בסיוע stri של גיליון ASC confluent מוצג כאן. רקמת השד האנושית המציפה עדיין הייתה יציבה מעוגנת על ידי יריעות התאים של ASC לתחתית הבאר לאחר 14 ימים של תרבות. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות מדגימות את היציבות של ה- BC-MPS עם MDA-MB-231 המבטאות קווי תאים RFP לאחר 14 יום ועם גידול שלילי משולש explant PDX לפחות שישה ימים.BC-MPS המכיל רקמת שד היה תרבית במבחנה במשך 14 ימים, מוכתם ותמונה כדי להדגים את האלמנטים הילידים של הרקמה ב 100X ו 20X הגדלה. הכתמת סמני המקרופאג' שימשה לשימור מקרופאגים ראשוניים לאחר שלושה ושבעה ימים בתרבות. ניתוח cytometry זרימה של תאים מוכתמים בודיפי MDA-MB-231 לאחר 14 ימים מצביעים על הצטברות שומנים מינימלית בתרבות 2D הצטברות שומנים נרחבת BC-MPS.שיעור תאי MDA-MB-231 חיוביים השומנים היה גדול פי 26.2 ב- BC-MPS מתרבות דו-ממדית. תאים בתרבית BC-MPS הציגו טיפות שומנים להגדיל בהשוואה לתאים בתרבית בתרבות דו-מימדית סטנדרטית. תמונות לשגות זמן של RFP שכותרתו BC-MPS עם MDA-MB-231 תאים הראו תנועה אמובואידית של 231 תאים עם תרמילים מדומים ותנועתיות גבוהה.רקמת השד חייבת להיות טחון קטן מספיק ומופרד מספיק כדי להיות מופץ על פני החלק התחתון של הבאר. רקמת השד היא מאוד ציפה ואם החלקים גדולים מדי או מקובצים קרוב מדי זה לזה, גיליונות התא ASC לא יוכלו לעגן את רקמת השד לתחתית הבאר. סרטן רקמת השד וכתוצאה מכך מבנים יכולים לעבור עיכול אנזימטי כדי לבודד סוגי תאים מסוימים של עניין.זה יאפשר לענות על שאלות מפתח כגון כיצד תאים סרטניים ברקמת השד מגיבים באופן שונה לכימותרפיה בהשוואה לתרבות דו-מימדית מסורתית או אורגנואידים.

modeling-breast-cancer-human-breast-tissue-using-microphysiological

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

פיתחנו מודל vivo לשעבר רומן ללמוד פעולת הורמון בשד האנושי. היא מבוססת על microstructures הרקמה מבודדת מדגימות רקמת שד ניתוחיות המשמרות מבנה רקמה, אינטראקציות בין תאית, ואיתות אוטוקריני.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

כדי ללמוד התקדמות גידול שחלות במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, spheroids רב-תאיים היו בתרבית microdevice תחת זרימת נוזל מדומה. מודל 3D דינמיקה זו מחק את סביבת intraperitoneal עם המרכיבים התאיים מכאניים שבו גרורות סרטן השחלות מתרחשות.

דוגמנות התנהגות אליפטית סרטן השחלות תאיים בתוך Microdevice הצפק 3D דינמי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתיל תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב פשוטה, פחות פולשנית, אחיזה נוחה בדרך, והוא מודל סרטן השד זה העכבר orthotopic עם סביבה נאותה כרית שומן החלב יכול לשמש כדי לחקור היבטים שונים של סרטן.

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.

דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

פרוטוקול זה מציג מודל גידול-על-שבב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לביצוע מחקר סרטן אנושי בסיסי ותרגומי בתפוקה גבוהה, קידום בדיקות סקר לתרופות, מידול מחלות וגישות רפואה מותאמת אישית עם תיאור של נהלי העמסה, תחזוקה והערכה.

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.

שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד

למדו לבנות מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית חיה אקס-ויבו. שיטה זו מאפשרת שימור תאי שומן, תאי חיסון ומבנים וסקולריים לחקר אינטראקציות גידוליות ופיתוח תרופות מותאמות אישית.

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

גלה סרטונים נוספים