הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

הדמיית תאים חיים של מערכים חד-תאיים הנקראים LISCA היא גם קריאה אוטומטית של קורסי הזמן הפלואורסצנטיים של מאות תאים בודדים. היתרון של הגישה הוא שתגובות תאים בודדים נרשמות מתאים מבודדים מרחבית בסביבות מיקרו זהות, ומאפשרות ניתוח פליטה יעיל עם סטטיסטיקה נהדרת. כדי ליצור מערך של תאים בודדים, השתמש באזמל כדי לחתוך יצירת מופת אחת של PDMs המכילה שישה פסי אבקת מיקרו מתוך שכבת PDMs, והנח את יצירת המופת על ספסל המעבדה עם תבנית המיקרו הפונה כלפי מעלה.

השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך כל אחד מששת פסי המיקרופטרן לחותמת PDMs, תוך ניתוק חלק מהאזורים המעוצבים כדי להבטיח ששולי החותמת פתוחים. לאחר מכן, לגרד בזהירות את רדיד המגן של תלוש הכיסוי של שקופית שישה תאים כדי לסמן את עמדות הערוץ של השקופית ומניחים את כיסוי להחליק על הספסל עם רדיד מגן פונה כלפי מטה. השתמש בפינצטה כדי למקם את הבולים על פתק הכיסוי בעמדות הערוצים המסומנים, כאשר תבניות המיקרו פונות כלפי מטה, ובדוק את ההחזקה של הבולים תחת מיקרוסקופ.

הריבועים במגע עם השקופית ייראו כהים יותר מהאינטר-רווח. איכות התבנית יורדת על-ידי ריבועים שאינם מחוברים כראוי לשקופית. אם הבולים יש מחוברים בבטחה לטפל להחליק את הכיסוי ואת הבולים עם פלזמת חמצן ב 0.2 מיליבארים של לחץ כ 40 וואט במשך שלוש דקות כדי להפוך את המשטחים בין חותמות PDMs ואת הכיסוי להחליק הידרופילי.

בסוף ניקוי הפלזמה, מניחים את כיסוי להחליק לתוך ארון biosafety ולהוסיף 15 microliters של פתרון פולי-l-ליצין pegylated לכל חותמת, כך הפתרון נספג לתוך התבנית ההידרופילית של הבול. לאחר 20 דקות, לשטוף את הבולים עם מיליליטר אחד של מים אולטרה סגולים. השתמש בפינצטה כדי להסיר את הבולים מהמגלשה ולשטוף את החלקת הכיסוי בפעם השנייה עם מיליליטר שני של מים אולטרה-דקים.

כאשר תלוש הכיסוי התייבש לחלוטין, חבר שקופית דביקה בעלת שישה ערוצים לתעודת הכיסוי תוך דאגה שהאזורים עם תבנית המיקרו יתיישרו עם תחתית הערוצים. ולהוסיף 40 מיקרוליטרים של PBS ו 40 microliters של פתרון פיברונקטין לכל ערוץ. כדי לערבב את שני הפתרונות, להסיר 40 microliters ממאגר אחד ולהוסיף אותו למאגר הנגדי של אותו ערוץ שלוש פעמים כדי ליצור פתרון הומוגני.

כאשר כל הערוצים היו מעורבים, דגירה את השקופית במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת כל ערוץ שלוש פעמים עם 120 microliters של PBS לכל לשטוף. החלף את PBS ל 37 מעלות צלזיוס, מדיום צמיחת תאים בתוספת מלאה בתעלות על ידי הוספת 120 microliters בינוני למאגר אחד ולהסיר אותו מהמאגר הנגדי. הוסף 40 מיקרוליטרים של 400, 000 תאים לתאים מיליליטר השעיה של עניין ו 40 microliters של מדיום צמיחת תאים לכל ערוץ, ומערבבים את פתרון התא עם המדיום כפי שהוכח.

לאחר ערבוב, להסיר 40 microliters של השעיה מכל ערוץ, כך רק הערוצים מלאים השעיית תא, ומניחים את השקופית לתוך חממה תרבות התא. לאחר שעה אחת, בדוק אם יש הידבקות בתאים באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה, והוסף 120 מיקרוליטרים של 37 מעלות צלזיוס מדיום צמיחת תאים לכל ערוץ, ולאחר מכן להחזיר את השקופית לחממת תרבות התא במשך שלוש שעות נוספות. כדי להקים מערכת זלוף, חבר מזרק מיליליטר אחד מלא במדיום צמיחת תאים של 37 מעלות צלזיוס לצינור החודר של המערכת, והשתמש בשסתום כדי למלא את הצינור במדיום.

חבר את צינור כניסת למאגר של ערוץ אחד, דואג כי אין בועות אוויר לכודים, ולחבר מחבר סדרתי למאגר מול צינור כניסת של הערוץ הנוכחי. חבר את שאר הערוצים כפי שהוכח עד שמספר הערוצים הנדרש יחובר בסידרה. ולחבר את צינור היציאה ישירות למאגר חינם של הערוץ הסופי.

לאחר מכן מלאו את הצינור המחובר באמצעי כדי לאשר שמערכת הזלוף אינה דולפת. להדמיית זמן לשגות של התאים, כדי להגדיר פרוטוקול לשגות זמן להקלטת תמונת ניגודיות פאזה ותמונת פלואורסצנטיות, הגדר את התצורה האופטית עבור הדמיית ניגודיות פאזה והדמיה פלואורסצנטית. השתמש במטרה של פי 10, במסנני הפלואורסצנטיות המתאימים ובמערכת תיקון מיקוד אוטומטית כדי להבטיח איכות תמונה טובה יותר למדידות לטווח ארוך.

בחר זמן חשיפה של 10 אלפיות השניה עבור הדמיית ניגודיות הפאזה וזמן חשיפה של 750 אלפיות השנייה לתיעוד עוצמת הפלואורסצנטיות של EGFP. הגדר לוח זמנים עם מרווח זמן של 10 דקות בין לולאות רצופות דרך רשימת המיקומים וזמן תצפית של 30 שעות. לאחר מכן, מניחים את ששת הערוצים מחליקים על המרתף הבודד ומעלים במחזיק הדגימה של תא החימום של 37 מעלות צלזיוס של המיקרוסקופ ומדביקים את הצינור של מערכת הזלוף לבמה.

הכנס את הקצוות החופשיים של צינורות היציאה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר כדי לאסוף את הפסולת הנוזלית. והגדר את רשימת המיקומים למדידת זמן הסריקה, תוך דאגה לכך שמספר המשרות יוכל להיסרק בתוך מרווח הזמן המוגדר בין לולאות רצופות דרך רשימת המיקומים. ואז להתחיל את מדידת זמן לשגות.

עבור transfection של התאים עם סמן פלואורסצנטי, להשתמש במזרק כדי לשטוף את מערכת הצינור עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס PBS, דואג כי שלב המיקרוסקופ לא זז. לאחר שטיפה, למלא את המערכת עם 300 microliters של סרום מופחת בינוני בתוספת mRNA של עניין, לריכוז הסופי של 0.5 ננוגרם של mRNA לכל microliter, ולאפשר lipoplexes דגירה במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, לשטוף את המערכת עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס מדיום צמיחת תאים מלאה כדי להסיר כל mRNA מאוגד.

בסוף הניתוח, להציג את הערוצים המפורטים בתפריט הערוץ לגלול דרך מסגרות הזמן כדי לבדוק את התאים שנבחרו מראש ואת אותות פלורסנט משולב שלהם. לחץ על תא מעניין כדי להדגיש את קורס זמן הפלואורסצנטיות שלו, או לחץ על קורס זמן כדי למצוא את התא המתאים. הקש Shift תוך כדי לחיצה על תא כדי לבחור או לבטל את הבחירה בו.

לבטל את הבחירה של תאים שאינם בני קיימא או שאינם מוגבלים לנקודת הידבקות או המחוברים לתא אחר כדי לא לכלול אותם מניתוח נוסף. כאשר כל התאים נבחרים או אינם נבחרים כראוי, שמור את קורסי הזמן של תא יחיד עבור אזור התא ואת הפלואורסצנטיות המשולבת בספריה המתאימה. כדי לכמת את זמן תחילת התרגום לאחר ההשתנות ואת העוצמה של ביטוי ה- EGFP הסלולרי, ניתן לטפל במודל תרגום תלת-שלבי.

פתרון המודל עבור EGFP יכול להיות מותאם לקורסים זמן תא יחיד כפי שמודגם. כאן, היסטוגרמות של זמן תחילת התרגום ואת קצב הביטוי של תאים transfected lipoplex ניתן לראות. כמו שני הפרמטרים מוערכים עבור כל תא, המתאם של פרמטרים אלה ניתן לנתח כפי שהוכח בחלקת הפיזור, ובהשוואה לתאים transfected עם חלקיקי השומנים.

כפי שמודגם, תאים המודבקים עם חלקיקי שומנים מציגים פחות שונות בין תאים לתאים בהשוואה לתאים המודבקים עם ליפופלקסים. וממוצע האוכלוסייה מדגים התחלה מהירה יותר של תרגום, כמו גם קצב ביטוי גבוה יותר. הגישה שלנו יכולה גם להיות מותאמת לשיטות מיקרו-דפוס חלופיות.

החשוב ביותר עבור LISCA הוא כליאת תאים טובה ושילוב של ניתוח תמונה אוטומטי עם פיקוח משתמש נוח. כפי שראית, התנהגות התא היא הטרוגנית. וסרטי לשגות זמן תא יחיד לספק גישה לדינמיקה משוחדת של הרשתות הביוכימיות הטבועות.

לדוגמה, בביטוי ירוק, אפופטוזיס או מבחני הרג תאים.