רישום זרמים חשמליים על פני קרום הפלזמה של תאי זרע של יונקים

רישום הפעילות החשמלית של תא הזרע באמצעות טכניקת פלאץ-קלאמפ היה גורם מרכזי בזיהוי תעלות יוני זרע שונות ובהבנת האלקטרופיזיולוגיה של הזרע ברמה המולקולרית. שיטה זו מצטיינת במדידת טביעות אצבע אלקטרופיזיולוגיות ופרמקולוגיות של תעלות יונים והיא הכלי האמין ביותר לזיהוי תעלות יונים. בהתחשב בחשיבות הפיזיולוגית של תעלות יונים ומובילים אלקטרוגניים לפוריות גברית, טכניקה זו היא כלי עוצמתי להבנת פגמים מסוימים בזרע שמובילים לאי פוריות.

לייצור מיקרופיפטות, התחל עם נימי זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.5 מילימטרים, קוטר פנימי של 0.86 מילימטרים וסיב פנימי. ודאו שהקוטר הפנימי של קצה הפיפטה הוא כ-2 מיקרומטרים לפני ליטוש אש ומוקטן ל-0.5 מיקרומטר לאחר ליטוש נכון. הרכיבו גשר אגר כדי לשמור על יציבות הסביבה סביב אלקטרודת הייחוס.

צרו נימי זכוכית בצורת L על ידי כיפופו תחת אש בונסן קטנה ותנו לו להתקרר. הכינו תמיסה של 1% אגרוז בכלוריד אשלגן מולר אחד וחממו אותה במיקרוגל עד שהאגרוז נמס והתמיסה הופכת לשקופה. מלאו בזהירות את נימי הזכוכית בצורת L באגרוז כדי למנוע בועות אוויר ותנו לה להתקרר לטמפרטורת החדר.

לחלופין, טבול את נימי הזכוכית בצורת L באגרוז המומס. סובבו את המיכל מספר פעמים וחממו אותו שוב במיקרוגל עד שהאגרוז רותח, מה שיוציא בועות אוויר מגשר האגר. פתח את אזור הבטן התחתונה של העכבר עם מספריים והוצא את שני האפידידימידים.

הניחו אותם בצלחת תרבית תאים בגודל 35 מ"מ מלאה בתמיסת מלח גבוהה או HS שחוממה מראש לטמפרטורת החדר. העבר את האפידידימידים לצלחת תרבית תאים חדשה המכילה תמיסת HS והסר היטב את כל השומן שנותר. הפרדו את האפידידימידים לקאפוט, קורפוס וקאודה באמצעות להב סכין מספר 15.

העבר את הקורפוס של כל אפידידימיס לצלחת תרבית תאים חדשה המכילה תמיסת HS. בצע מספר חתכים בחלק המבודד של האפידידימיס באמצעות להב מחודד מספר 11. העבר את חלקי האפידידימידים עם חתכים מרובים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת HS.

נערו לזמן קצר את תאי הזרע מהאפידידימיס אל התמיסה באמצעות מלקחיים סופרפיין דומונט סוג 5A. לאחר מכן זרקו את האפידידימידים והשאירו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. חכה עד שהחומר המוצק יסחף לתחתית הצינור.

ואז להעביר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נוסף בנפח 1.5 מיליליטר. מצא את תא הזרע המתאים עם טיפה ציטופלזמית באמצעות הגדלה של פי 600. ודאו שהטיפה הציטופלזמית היא אליפטית ובעל צורה מעט מוארכת דמוית ציר דמוי ציר.

בחר זרע נייד עם הראש מחובר לכיסוי כך שתא הזרע מקובע חלקית, אך הטיפה הציטופלזמית ושאר השולון ממשיכים לנוע עם חבטות פלגלה. ודא שראש הזרע מחובר ברפיון לכיסוי הכיסוי. לאחר בחירה חזותית של תא זרע עם מורפולוגיה מתאימה, מלאו את המיקרופיפטה בתמיסת הפיפטה ומקבעים אותה למחזיק הפיפטה.

כדי לשמור על קצה הפיפטה נקי מפסולת, יש להפעיל לחץ חיובי על הפיפטה באמצעות מכלול בצורת צינור U. הורידו את הפיפטה וטבלו את הקצה בתמיסת האמבטיה. כדי להמחיש את התא בבירור, יש למקם את קצה הפיפטה מעל הטיפה הציטופלזמית כך שהפתח של הקצה יהיה מיושר באלכסון לכיוון הטיפה.

הורד במהירות את קצה הפיפטה לכיוון הטיפה כך שהן יהיו באותו מישור מוקד. ברגע שקצה הפיפטה נוגע בטיפה, יש להפעיל לחץ שלילי על הפיפטה כדי להזיז חלק מהטיפה לקצה וליצור אטימה של ג'יגה-אוהם. ואז להרים את הזרע מכיסוי הכיסוי.

לפצות על מעבר קיבול תועה באמצעות מצב הפיצוי של המגבר לפני המעבר למצב התא המלא. בצע פריצה ומעבר למצב התא כולו על ידי יישום מילישניות אחת, העלאת המתח בהדרגה בשילוב עם יניקה קלה מאוד. לאחר יישום כל פולס מתח שבירה, השיק את כלי בדיקת הממברנה כדי לבדוק האם מופיעה מעבר קיבול גדול יותר.

להתאים את מעבר הקיבול הגדול יותר כדי לקבוע את הקיבול של כל התא, כמו גם את עמידות הגישה שלו. לאחר פריצה מוצלחת, יש להמשיך בניסויים המתוכננים של פלאץ-קלאמפ של כל התא, כגון יישום תמיסות אמבטיה שונות המכילות תרכובות שונות או מדידת פעילות ערוץ באמצעות פרוטוקולי שלב מתח או רמפה מתח. הקלטות CatSper בוצעו על ידי יצירת אטימה עמידה גבוהה בין פיפטת הטלאי לתאי הזרע היונקי בטיפה הציטופלזמית שלה.

צפיפויות זרמי CatSper של תא צזיום שלם נרשמו מתאי זרע נוירון מסוג קאודלי ותאי זרע חסרים של נוירונים זנביים של CatSper. תאי הזרע של מינים שונים מגוונים במורפולוגיה ובמסלולי הוויסות הפנימיים שלהם. פרימטים ובני אדם הראו תכונות ויסות של ערוצי CatSper דומים.

מעניין שהפעלת הפרוגסטרון של CatSper נראית ייחודית לתאי הזרע של פרימטים. הזרע של חזירי בר, שור ומכרסמים לא הראו שינוי בזרמי CatSper שלהם על ידי פרוגסטרון. בזרע של שור וחזיר בר, אפילו פעילות ערוצי CatSper בסיסית הייתה מתחת לגבולות הניתנים לזיהוי, מה שמרמז שזרם הסידן וההיפראקטיבציה הנלווים לכך מונעים על ידי תעלות או מובילים אחרים, או שנדרש מגרה טבעי אחר להפעלת תעלות CatSper שלהם.

הטיפות הציטופלזמיות הקטנות, החלקות, האחידות ואינן נפוחות מדי מתאימות במיוחד לקלימפ-קלמפ. כדאי להימנע משימוש בטיפות ציטופלזמיות קטנות, חד-צדדיות, נפוחות ושקופות לחלוטין, כי הן יובילו לאיטום חלש או ללא אטימה. טכניקה זו מאפשרת חקר מפורט של ערוצי אוויר מסוימים במערכת הביטוי הטבעית שלהם, וההצלחה תלויה בתאי זרע משתנים איכותיים, אזורים טהורים, כישורים פיזיולוגיים אינטלקטואליים בסיסיים, סבלנות, והכי חשוב – התמדה.