Name: יצירה ותחזוקה של ביובנק חי - איך אנחנו עושים את זה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: למדו כיצד ליצור ולתחזק ביובנק חי לסרטן מעי גס ולבלב, הכולל דגמי PDX וקווי תאים מגידולי מטופלים. פרוטוקול זה מאפשר בדיקות טרום-קליניות לרפואה מותאמת אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים בחביבות לג'ני בורמייסטר, העוזרת הגרפית שלנו, על ההקלטה והעריכה של הסרטון. בנוסף, אנו מודים לעמיתינו במחלקה הכירורגית והפתולוגית על שיתוף הפעולה ארוך השנים. ברצוננו גם להודות למרקוס מולר, מנהל ההפקה של מרכז ה- IT והמדיה, אוניברסיטת רוסטוק, על אספקת ציוד הקלטת השמע וזיקוק איכות הצליל.
מימון מימון: הקרן הגרמנית לסיוע לסרטן (DKH e.V.), מענק מספר 108446, ומספר המענק TBI-V-1-241-VBW-084 מהמדינה מקלנבורג-וורפומרן מימנו חלקית מחקר זה.

<ol><li>Sartore-Bianchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+mutations+in+colorectal+cancer+are+associated+with+clinical+resistance+to+EGFR-targeted+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies.</a> Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Lipson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+ALK+and+RET+gene+fusions+from+colorectal+and+lung+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.</a> Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Mouradov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+cell+lines+are+representative+models+of+the+main+molecular+subtypes+of+primary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer.</a> Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).</li>
<li>Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bacterial-immunotherapy+with+therapeutic+antibodies%3A+a+novel+therapeutic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept.</a> Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).</li>
<li>DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+success+rates+for+investigational+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+pharmacology+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Clinical approval success rates for investigational cancer drugs.</a> Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Mullins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Biobanking+and+Tumor+Model+Establishment+of+Human+Colorectal+Carcinoma+Provides+Excellent+Tools+for+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research.</a> Cancers. 11 (10), (2019).</li>
<li>Kuehn, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+HROC69+-+a+Crohn%27s+related+colonic+carcinoma+cell+line+and+its+matched+patient-derived+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft.</a> Scientific reports. 6, 24671(2016).</li>
<li>Dangles-Marie, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+colon+cancer+cell+lines+from+fresh+tumors+versus+xenografts%3A+comparison+of+success+rate+and+cell+line+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features.</a> Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).</li>
<li>Gock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Take+Rate+Optimization+for+Colorectal+Carcinoma+Patient-Derived+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+research+international%22%5BJournal%5D)">Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models.</a> BioMed research international. 2016, 11715053(2016).</li>
<li>Collins, A. T., Lang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+validity+of+patient+derived+xenograft+%28PDX%29+models%3A+the+implications+for+translational+research+and+personalised+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine.</a> PeerJ. 6, 5981(2018).</li>
<li>Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+colorectal+cancer+in+pre-clinical+research%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review.</a> Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extent+of+inflammatory+infiltration+in+primary+cancer+tissues+is+associated+with+lymphomagenesis+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li>
<li>Moyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+murine+tumors+in+the+development+of+patient-derived+xenografts%3A+a+potential+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall.</a> Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).</li>
<li>Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+carcinoma+tumour+budding+and+podia+formation+in+the+xenograft+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment.</a> PloS one. 12 (10), 0186271(2017).</li>
<li>Guenot, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumour+genetic+alterations+and+intra-tumoral+heterogeneity+are+maintained+in+xenografts+of+human+colon+cancers+showing+chromosome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability.</a> The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).</li>
<li>Mattie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+patient-derived+human+pancreatic+tumor+xenograft+models+for+preclinical+and+translational+development+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics.</a> Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).</li>
<li>Cho, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+patient-derived+xenografted+tumors+maintain+characteristic+features+of+the+original+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors.</a> The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).</li>
<li>Maletzki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Drug+Response+of+Freshly+Established+Patient-Derived+Tumor+Models+with+CpG+Island+Methylator+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype.</a> PloS one. 10 (11), 0143194(2015).</li>
<li>Katsiampoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+Patient-Derived+Xenografts+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+tumor+mice--a+new+model+to+study+and+manipulate+the+immune+response+in+advanced+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy.</a> International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).</li>
<li>Herndler-Brandstetter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+model+supports+development%2C+function%2C+and+tissue+residency+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).</li>
<li>Capasso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+responses+to+anti-PD-1+mono+and+combination+immunotherapy+in+hematopoietic+humanized+mice+implanted+with+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+immunotherapy+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts.</a> Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37(2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Abe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+phosphoproteomic+analysis+for+phosphosignaling+and+active-kinome+profiling+in+Matrigel-embedded+spheroids+and+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids.</a> Scientific reports. 8 (1), 11401(2018).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
</ol>

הדור של ביו-בנק חי מניח מראש, מלבד עמידה בתקנות החוקיות של פרטיות, משפט רפואי ורווחת בעלי חיים, תשתית טובה וצוות מתואם היטב. זה הוכיח יתרון ישירות לערב חלק מהצוות הכירורגי בהליכי המחקר, שכן הם יכולים מאוד להעריך את ההתאמה של המטופל הפרט לתרומת רקמות. יתר על כן, חולים נוטים להסכים עם biobanking בתדירות גבוהה יותר, כאשר האישור בכתב שלהם מתקבל במהלך הדיון בהסכמה מדעת כירורגית. כדי לחסוך זמן ומשאבים, מקרים כי יהיה ככל הנראה להניב כמויות מספיקות של רקמת הגידול לא צריך להיבחר עבור biobanking. כשמדובר ברכישת דגימה, המקסימום "תקשורת היא המפתח" הוא אמת פשוטה, אך לעתים קרובות מתעלמים ממנה. זה לוקח רק אחות תיאטרון אחת חסרת ידע או עמית כירורגי להרוס את הדגימה ממש בהתחלה על ידי המשך כרגיל והוספת פורמלדהיד לדגימה כריתה. לכן, זה חיוני לחלוטין כי כל אחד מחברי הצוות המעורב מקבל היכרות עם SOP עבור biobanking. מנתחים יש לשים לב יום לפני וממש בתחילת ההליך על איסוף רקמות מתוזמן. יתר על כן, מקרים שנבחרו עבור biobanking, צריך להיות מודגש בתוכנית או אלקטרונית. קצירת רקמות מהדגימה הכירורגית צריכה להתבצע על ידי פתולוג. ראשית, זה יבטיח כי קצירת הרקמות אינה מפריעה לדו"ח הפתולוגי הסופי. שנית, זה מגדיל את ההסתברות של קבלת רקמה עם כמויות נאותות של רקמת סרטן קיימא. במיוחד בסרטן הלבלב עם תגובה desmoplastic בולט ואזורים נמקיים תכופים, חלקים קיימא קשה לזהות מקרוסקופית עבור העין לא מאומן. כחריג לכלל זה, בלוקי רקמה מגרורות גדולות בכבד או בפולמונלה, עשויים לפעמים להיות מגורשים "שולחן אחורי" על ידי המנתח, אם שוליים כירורגיים יכולים להיות מוגדרים מקרוסקופית. סרטן פי הטבעת resected על ידי כריתה mesorectal הכולל (TME), לא יכול להיות מתאים biobanking, שכן קצירת רקמות מן הדגימה resected לפני הטמעת פרפין עלול להפריע להערכת איכות TME. לחלופין, רקמה עבור biobanking ניתן לרכוש על ידי ביופסיה טרנסאנלית של סרטן פי הטבעת.
שיעורי ההקמה של תרביות תאים ראשוניות הנגזרות מהגידול המקורי הם בדרך כלל נמוכים. PDX נגזר, תרביות תא משני יכול להיות הוקמה בהצלחה רבה יותר. אנו ממליצים לבדוק מדיה שונה עבור כל מקרה ושימוש תוספי אנטיביוטיקה עבור הקטעים הראשונים כדי להפחית את הזיהום למינימום מאז הרקמה שנקטפו הוא לעתים רחוקות סטרילי. לאחר התפשטות מוצלחת, כל קו תאים בודד צריך להיות מאושר כקו תאים סרטניים על ידי ניתוח FACS ונבדק באופן קבוע לזיהום mycoplasma. כדי לא לכלול זיהום צולב, ניתוח STR רגיל מומלץ. יש לציין, כי פרוטוקול ההקמה עבור קווי תאים ראשיים ומשניים נתון כל הזמן לאופטימיזציה. פרטים על ההרכב ושיעורי ההצלחה של המדיה הבודדת הם בבירור מעבר להיקף עבודה זו ויפורסמו בנפרד.
עבור תחריט PDX, רקמת הגידול יכולה להיות מושתלת ישירות לאחר כריתה או cryopreserved בסרום עגל העובר עם 10% DMSO או מדיה הקפאה דומה להשתלה מאוחרת. ההשתלה מיד עם קצירת רקמת הגידול מכבידה על צוות הלוגיסטיקה והמעבדה, ותוצאות קסנוגרפטינג לאחר ההקפאה אינן נחותות כלל 10. יתר על כן, דגירה של הרקמה Matrigel לפני השתלת הגידול, מגדיל באופן משמעותי את שיעורי החריטה12. אנו ממליצים על חריטה מאוחרת בעקבות ממצא פתולוגי מובהק וסילוק מיידי של דגימות רקמה שנאספו בטעות. מאז שיעור ההצלחה של תחריט ראשי עולה עם כשל חיסוני של העכבר הנמען, אנו נוטים להשתמש בעכברי NSG עבור המעבר PDX הראשון. לאחר תחריט PDX המוצלח הראשון, עכברי NMRInu/nu יכולים ויש להשתמש בהם למעברים הבאים ולהרחבת רקמות. זן זה הוא חזק יותר, זול יותר וקל יותר להתרבות בהשוואה NSG או זנים immunodeficient דומה, אבל עדיין מראה שיעורי חריטה סבירים. יתר על כן, העירום שלה מקל על השתלה וניטור צמיחת הגידול. כדי להגדיל את שיעורי החריטה במעברים הבאים, אנו ממליצים על העברה ישירה של רקמות PDX שנקטפו לאחרונה כדי לארח עכברים במידת האפשר, במיוחד עבור PDX הגדל לאט ומקרים עם שיעור הצלחה תחריט ראשוני נמוך. קולינס ולאנג סקרו לאחרונה 14 מחקרים של הקמת PDX המעי הגס ודיווחו על שיעורי חריטה הנעים בין 14 ל -100% עם שיעור הקמה PDX חציוני של 68%, האחרון עולה בקנה אחד עם הממצאים שלנו13. בקנה אחד עם הספרות, ראינו שיעורי הקמה נמוכים יותר של הלבלב לעומת סרטן המעי הגס PDX14. ללא קשר לזן העכבר המארח וישות הגידול, צמיחתו של האדם, וירוס אפשטיין-בר (EBV) הקשורים לימפומות B-cell ולימפומות מורין בצד ההשתלה מהווה מכשול חשוב15,16. אם לא מזוהה, גידולים כאלה יכולים "לזהם" קטעים הבאים ובכך לבלבל תוצאות רצופות. צמיחה PDX מהירה יוצאת דופן ונפיחות של בלוטות לימפה צוואר הרחם, בית השחי, מפשעתי הם אינדיקטורים חזקים של צמיחת לימפומה מורין, אבל בדיקה היסטולוגית קבועה של PDX מומלץ בכל זאת. יתר על כן, קונקורדנציה גנטית בין PDX לבין המטופל התורם המתאים צריך להיבדק באופן קבוע על ידי ניתוח STR. באופן אידיאלי, biobank צריך להיות קשור למסד נתונים קליני הכולל מאפייני חולים (מידע כללי, הישרדות, הישרדות ללא הישנות, טיפול, neoplasia משני וכו '). בשל תקנות משפטיות של הגנת פרטיות והיעדר בסיס נתונים אנונימיות כזה, ערכת הנתונים הקליניים שלנו מנוהלת ומתעדכנת באופן קבוע על ידי הרופאים המשתפים פעולה.
בעוד ביובנקים קונבנציונליים מוגבלים למחקר מצפה כוכבים, ביובנק חי מספק את ההזדמנות להתערבויות במבחנה ובוויו. קווי תאים שמקורם בחולה הם כלי חשוב למחקר בסיסי, הקרנות תרופות בתפוקה גבוהה והערכה של סוכני תרופות חדשים4. מודלים PDX המקביל, עם זאת, הם בעלי חשיבות גוברת, שכן הם מסכמים מקרוב את ההיסטולוגיה של הגידול המקורי17,18 ולהראות יציבות גנטית גבוהה על פני מספר קטעים19,20. ה-PDX biobank שלנו הוכיח את עצמו כפלטפורמה מצוינת למחקר פרה-קליני ויסודי6,21. יתר על כן, מאז אוספי PDX גדולים כראוי לשקף את ההטרוגניות הבין-אינדיבידואלית של אוכלוסיית המטופלים, הגישה ניסוי קליני PDX (PCT) (חיה אחת לכל מודל לכל טיפול) צברה חשיבות לפיתוח תרופות שכן היא מאפשרת חיזוי נאמן של תגובה קלינית לתרופות חדשות משטר קומבינטורי8. אנו גם מעריכים כעת תרופות ניסיוניות חדשות בניסויים קטנים PCT.
למרות תוצאות מבטיחות אלה, משך ההקמה החציוני של 12.2 חודשים, מעכב את הישימות הקלינית של מודלים PDX כמו "עכברי גלגול" לבדיקת אפשרויות טיפול נגד סרטן, לפחות עבור אותם חולים הזקוקים לטיפול אדג'ובנטי מיידי או אפילו neoadjuvant22. חיסרון נוסף של דגמי PDX סטנדרטיים הוא היעדר שימושיות לבדיקות אימונותרפיות בשל כשל חיסוני של עכברים מארחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו מספר זני עכבר "אנושיים". עכברים אלה הם immunocompromised בכבדות, אבל ניתן לשקם עם סוגים שונים של תאים נגזר מח עצם אנושי או CD34+ תאי גזע hematopoietic לאחר PDX outgrowth23, המאפשר הערכה של cytotoxicity בתיווך לימפוציטים של תגובה טיפולית לטיפול מעכבי מחסום חיסוני24,25.
בשנים האחרונות, אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) התגלו כמודלים חשובים לסרטן המתחרים ב- PDX. מבנים תלת-ממדיים אלה, המופקים מחתיכות גידול שלמות ומתורבתים בפיגום מטריצה חוץ-תאית, משקפים באופן הדוק את התכונות ההיסטולוגיות והגנטיות של הגידול המקורי. האפשרות של התרחבות ארוכת טווח ו cryopreservation הופך PDO תוסף אידיאלי של biobank חי26,27. בנוסף לשיעור הקמה גבוה יחסית, דווח על חיזוי תגובת תרופות אמינה עבור PDO של מספר ישויות גידול28. יתר על כן, PDOs אפילו נוצרו מתאי הגידול במחזור וגם הקמת בו זמנית של אורגנואידים מרקמה בריאה תואמת אפשרי, המאפשר הערכה של רעילות הקשורות לטיפול על בסיס חולה-אדם29,30. עם זאת, בהשוואה לתרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות, תרבות האורגנואידים היא זמן ותרכובות מטריצה חוץ-תאית מלאכותיות יכולות להפריע להליכים אנליטיים מסוימים31. יתר על כן, אורגנואידים סרטניים רגישים לצמיחת יתר על ידי גידול מהיר יותר, אורגנואידים שאינם ממאירים נגזר אפיתל בריא30. בשל מחסור בסטרומה, כלי דם ותאי חיסון, PDOs הם בעיקר בלתי ניתנים לתיישנות לבדיקה של סוכנים אימונותרפיים אנטי אנגיוגניים. עם זאת, שיטות culturing חדש לאפשר מידול של microenvironment הגידול במבחנה, מה שהופכים PDOs מתחרה אמיתי עבור מודלים PDX32. בעתיד הקרוב, מודלים של גידולים מטופלים-אינדיבידואליים, בשילוב עם כלים גנטיים רבי עוצמה כמו רצף הדור הבא, יסללו בתקווה את הדרך לרפואה מדויקת אמיתית וגישות מותאמות אישית.

בשנים האחרונות, הידע המצטבר על התכונות המורפולוגיות, הקליניות והגנטיות של סרטן הוביל לתפיסת הסרטן כמחלה הטרוגנית ואינדיבידואלית. כתוצאה מכך, אפיון מוטציה של neoplasms, מלבד תכונות קליניות ופתולוגיות, צברה חשיבות לקבלת החלטות קליניות וטיפולים ממוקדים רבים פותחו עבור שינויים מולקולריים שונים. לדוגמה, את היעילות של cetuximab בטיפול בסרטן המעי הגס ניתן לחזות על ידי ניתוח של מצב מוטציה KRAS ו PIK3CA 1. רפואה מדויקת שואפת לגישה מותאמת אישית כדי לספק את המענה הטיפולי הגבוה ביותר בכל מטופל ולהימנע מרעילות של טיפולים לא יעילים2. Biobanks מכילים רקמות, דם וחומרים ביולוגיים אחרים של חולי סרטן, אשר קשורים לנתונים הקליניים, ולכן הם כלי מצוין לחקר סרטן תרגום. בשל מספר רב של דגימות קליניות, biobanks לאפשר גילוי של מוטציות נדירות, אך פוטנציאל לתרופות, אשר מספק הזדמנויות טיפול חדשות עבור המטופל הפרט3.
כדי לכסות רחב ככל האפשר ספקטרום מחקר אונקולוגי, לא לרסן את הפעילות שלנו על קציר מדגם לבד, אבל התמקד בהקמת קווי תאים סרטניים שמקורם בחולה וקסנוגרפטים (PDX). קווי תאים דו-מימדיים מסורתיים נשארים האבן הפינתית של מחקר במבחנה והם הבחירה העיקרית להקרנות סמים בקנהמידהגדול 4,5. יתר על כן, ניתוח קו התא הוא לעתים קרובות קל יותר, זול יותר וזמין יותר. בנוסף, מאז לימפוציטים בדם היקפי שמקורו בחולה (PBL) זמינים, גם אימונולוגיה הגידול ניתן ללמוד במבחנה6. עם זאת, רוב התרופות שפותחו לאחרונה עם השפעה פרה-קלינית מבטיחה בניסויים מבוססי תאים במבחנה או ב- vivo, הראו תוצאות מאכזבות בניסויים קליניים7. לעומת זאת, מחקרים פרה-קליניים המבוססים על PDX במחקרי vivo שיקפו את הפעילות הקלינית של סוכנים אנטי-ניאופלסטיים הרבה יותר בנאמנות8. מאז רקמת PDX משקף מקרוב את המאפיינים היסטולוגיים ומולקולריים של הגידול התורם, מודלים PDX הם דרך טובה להפיץ את כמויות מוגבלות מאוד לעתים קרובות של רקמת גידול קיימא כדי לשמור על השלמות של ביובנק ולאפשר חילופי דגימות בין קבוצות מחקר ומוסדות. יתר על כן, קווי תאים סרטן נגזר רקמת PDX ניתן להקים באופן משמעותי קל יותר מאשר קווי תאים סרטני ראשוני9. בשנים האחרונות הקימה קבוצת העבודה שלנו ביו-בנק משולב מקיף של סרטן המעי הגס והלבלב על ידי סטנדרטיזציה ואופטימיזציה של זרימת העבודה עבור כל הדגימות הביולוגיות המדוברות (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה וארגון של הביובנק <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table><tbody><tr><td>בצילול&רג; AF; 1L</td><td>Bode, Hartmann</td><td>REF 973380</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה PP חיטוי, 15 מ"ל;</td><td>גריינר ביו סטרילי One</td><td>GBO Cat. מס':</td><td>צינור צנטריפוגה</td></tr><tr><td>188271 צינור צנטריפוגה PP, 50 מ"ל, סטרילי</td><td>Sarstedt</td><td>מספר הזמנה: 62.547.254</td><td>צינור צנטריפוגה</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II מזרק 20 מ"ל</td><td>BD</td><td>REF 300296</td><td>איסוף דם</td></tr><tr><td>סרום 7,5 מ"ל Sarstedt Monovette</td><td>Sarstedt</td><td>מספר פריט: 01.1601</td><td>איסוף דם</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>REF 86.1254.001</td><td>העברת נוזלים</td></tr><tr><td>Pipetboy ratiolab&reg; accupetta</td><td>Ratiolab</td><td>מספר פריט:</td><td>העברת נוזלים</td></tr><tr><td>RL3200300 PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>VWR Cat.No: 613-4438</td><td>העברת</td></tr><tr><td>נוזלים DPBS; ללא Ca & מ"ג</td><td>פאן ביוטק</td><td>חתול. מס': P04-36500</td><td>שטיפת</td></tr><tr><td>Pancoll Human</td><td>Pan Biotech</td><td>Cat. מס': P04-60500</td><td>צנטריפוגת שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (Dulbecco' s Modified Eagle Medium)</td><td>PAN Biotech</td><td>Cat. מס': P04-41500</td><td>גידול תאים</td></tr><tr><td>FBS Good Forte (סרום בקר מסונן)</td> <td>PAN Biotech</td><td>Cat. מס': P40-47500</td><td>גידול תאים</td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ</td><td>PAN ביוטק</td><td>חתול. מס': P04-80100</td><td>גידול תאים</td></tr><tr><td>טריפסין / EDTA</td><td>PAN ביוטק</td><td>חתול. מס': P10-023100</td><td>גידול תאים</td></tr><tr><td>DMSO (דימתיל סולפוקסיד לתרבית תאים)</td> <td>PanReac AppliChem</td><td>VWR Cat.No: A3672.0250</td><td>הקפאת תאים</td></tr><tr><td>מדיום מקפיא (FCS עם 10% DMSO)</td> <td>CryoPure מתוצרת עצמית</td><td>---</td><td>הקפאת תאים</td></tr><tr><td>cryotube- CryoPure 2 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>הקפאת תאים</td></tr><tr><td>6-באר צלחת תרבית תאים; סטריל; עם מכסה</td><td>Greiner bio-one</td><td>Cat.-No.: 657 גידול 160</td><td>תאים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 92 x 16 מ"מ, נ.ב. ללא מצלמות</td><td>חתול Sarstedt</td><td>. מס': 82.1472.001</td><td>הכנת רקמות</td></tr><tr><td>להבים כירורגיים סטריליים</td><td>B.Braun (Aesculap)</td> <td>REF BB510</td><td>הכנת רקמות</td></tr><tr><td>BD DiscarditTM II מזרק 10 מ"ל</td><td>BD</td><td>REF 309110</td><td>מסננת תאים להכנת רקמות</td></tr><tr><td>; צהוב; 100& m</td><td>Falcon</td><td>REF 352360</td><td>הכנת רקמות</td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>biocision</td><td>מספר פריט:</td><td>מיכל קירור 210004 עם -1&deg; C/min</td></tr><tr><td>Dewar&nbsp; ספינת תובלה מסוג 27 B, 2 ליטר, 138 מ"מ</td><td>KGW</td><td>Cat. מס':</td><td>מערכת הובלה</td>HT39.1</tr><tr><td>קצה פיפטה 200&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.760.002</td><td>העברת נוזלים</td></tr><tr><td>קצה מסנן 1000&micro; l</td><td>Sarstedt</td><td>REF 70.762.411</td><td>העברת נוזלים</td></tr><tr><td>פיפטה 200 ומיקרו; l,</td> חתול <td>אפנדורף</td> צהוב<td>. מס': 3121 000.082</td><td>העברת נוזלים</td></tr><tr><td>פיפטה 1000&מיקרו; l,</td> חתול <td>אפנדורף</td> כחול<td>. מס': 3121 000.120</td> חממת <td>העברת נוזלים</td></tr><tr><td>&nbsp; BB 6220 CU</td><td>Heraeus</td><td>Cat.-No.:</td> צלחת חימום <td>לגידול תאים</td></tr><tr><td>51012839 PR&Auml; ZITHERM</td><td>הארי Gestigkeit GmbH</td><td>---</td><td>חימום</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss Primo Vert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>מספר סידורי. 3842000839</td><td>תרביות תאים הדמיה</td></tr><tr><td>ספסל סטרילי זרימה בטוחה 1.8 nunc</td><td>nunc GmbH & Co. KG</td><td>---</td><td>סטרילי ספסל עבודה</td></tr><tr><td>מקפיא -80&deg; C</td><td>Kryotec-Kryosafe GmbH</td><td>---</td><td>אחסון דוגמאות</td></tr><tr><td>איזון אלקטרוני MP-300</td><td>Ch</td><td>---</td>yo <td>Scale</td></tr><tr><td>BD מיקרו-עדין, מזרק אינסולין U100</td><td>BD</td><td>REF</td><td>הזרקת 324826 הרדמה</td></tr><tr><td>Rompun 2%; 25 מ"ל</td><td>מספר אישור Bayer</td><td>: 6293841.00.00</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>קטמין 100 מ"ג/מ"ל, 25 מ"ל</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>מספר אישור: 401650.00.00</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>GES3S קורא</td><td>Datamars</td><td>לא זמין</td><td>קורא RFID</td></tr><tr><td>ISO-משדר FDX-B (1,4x8 מ"מ)</td> <td>Peddymark</td><td>---</td><td>שבב RFID</td></tr><tr><td>Cotrim-ratiopharm&reg; &nbsp; אמפולן SF 480&nbsp; מ"ג/5&nbsp; מ"ל</td><td>רציופארם</td><td>PZN-03928197</td><td>אנטיביוטיקה מי</td></tr><tr><td>שתייה צלחת חימום #FM-20 42x28 ס"מ</td> <td>---</td><td>דרקון</td> <td>חימום</td></tr><tr><td>מנורת חימום</td><td>פטרה חשמלית, בורגאו</td><td>---</td><td>חימום</td></tr><tr><td>משחה לעיניים ולאף (5% Dexpanthenol) Bepanthen</td><td>Bayer</td><td>PZN-01578675</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה אנטומית</td> להגנה על העיניים <td>B.Braun Aesculap</td><td>BD21 OR</td><td>מכשירים כירורגיים</td></tr><tr><td>פינצטה כירורגית</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BD50 1 R</td> מספריים <td>מכשירים כירורגיים</td></tr><tr><td></td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BC05 6R</td><td>מחט מכשירים כירורגיים</td></tr><tr><td>&nbsp; מחזיק</td><td>B.Braun Aesculap</td><td>BH1 1 OR</td><td>מכשירים כירורגיים</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8870. P32</td><td>חומר תפר כירורגי</td></tr><tr><td>נגדי אדי לחות חבישה ספריי חדיר</td><td>Smith& אחיין</td><td>REF 66004978, PZN- חומר</td><td>תפר כירורגי</td>02063507</tr><tr><td>וילון צמצם דבק</td><td>מחסום</td><td>REF 904622</td> החלפת <td>גזה רקמה סטרילית OP</td></tr><tr><td>Gazin&reg;; סטריל; 10x10 ס"מ</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>REF 18506</td><td>רקמת OP סטרילית</td></tr><tr><td>Raucotupf אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>Lohmann& Rauscher</td><td>REF 11969</td><td>מוליך</td></tr><tr><td>Corning&reg; מטריג'ל מטריצת ממברנה מרתף</td><td>קורנינג</td><td>Cat.-No.: 354234</td><td>תמיסת יוד מטריצת ממברנת מרתף</td></tr><tr><td>ברונול (7,5 גרם יוד פובידון)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>מספר פריט: 18839</td><td>deinfection</td></tr><tr><td>MACS&reg; פתרון אחסון רקמות</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>מספר הזמנה: 130-100-008</td><td>פתרון אחסון</td></tr><tr><td>Formafix 4%</td> <td>Grimm med. Logistik GmbH</td><td>מספר פריט:</td><td>פתרון קיבוע</td></tr><tr><td>F10010G תוכנה FreezerworksBasic</td><td>Dataworks Development, Inc</td><td>---</td><td>sample ארגון</td></tr><tr><td>Zebra TLP 2844 מדפסת</td><td>תוויות זב</td><td>---</td><td></td>רה</tr></tbody></table>

יצירה ותחזוקה של ביובנק חי - איך אנחנו עושים את זה

Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

לאור הידע הגובר על המאפיינים הבין-אינדיבידואליים וההטרוגניות של סרטן, התחום המתפתח של רפואה מותאמת אישית דורש פלטפורמה למחקר פרה-קליני. במהלך השנים האחרונות, הקמנו biobank של סרטן המעי הגס והלבלב המורכב רקמת הגידול העיקרי, רקמה נורמלית, סרה, לימפוציטים בדם היקפי מבודד (PBL), קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX), כמו גם קווי תאים סרטניים ראשוניים ומשניים. מאז רקמת הגידול המקורי מוגבל ואת קצב הקמת של קווי תאים סרטניים ראשוניים הוא עדיין נמוך יחסית, PDX לאפשר לא רק שימור והרחבת biobank אלא גם את הדור של קווי תאים סרטניים משניים. יתר על כן, דגמי PDX הוכחו להיות המודל האידיאלי vivo עבור בדיקות סמים פרה-קוליניות. עם זאת, ביובנקינג דורש הכנה קפדנית, הנחיות קפדניות ותשתית מכווננת היטב. Colectomy, תריסריון או גרורות resected דגימות נאספים מיד לאחר כריתה ומועברים למחלקה הפתולוגית. כיבוד העדיפות של דו"ח היסטופטולוגי משוחד, על פי שיקול דעתו של הפתולוג המטפל שמבצע את הניתוחים, חתיכות גידול קטנות ורקמה שאינה גידול נקצרים. 
חלקים נמקיים מושלכים ורקמת הגידול הנותרת נחתכת לקוביות קטנות וזהות וקריפטופדית לשימוש מאוחר יותר. בנוסף, חלק קטן של הגידול הוא טחון ומתוח עבור תרבות תאים סרטניים ראשונית. בנוסף, דגימות דם שנלקחו מהמטופל לפני ואחרי הניתוח, מעובדות כדי להשיג סרום ו- PBLs. עבור תחריט PDX, הדגימות cryopreserved מופשרים ומושתלים תת עורית לתוך האגפים של עכברים immunodeficient. PDX וכתוצאה מכך recapitulate מקרוב את ההיסטולוגיה של "התורם" גידולים והוא יכול לשמש גם עבור קסנוגרפטינג הבאים או cryopreserved לשימוש מאוחר יותר. בעבודה הבאה, אנו מתארים את השלבים האינדיבידואליים של יצירה, תחזוקה וניהול של ביובנק גדול של סרטן המעי הגס והלבלב. יתר על כן, אנו מדגישים את הפרטים החיוניים ואת האזהרות הקשורות biobanking.

בידינו, שיעור ההקמה של תרביות תאים ראשוניות (איור 2A &amp; B) היה 12.9% בסדרה גדולה9. רוב הניסיונות לבודד תאים סרטניים הניתנים להרחבה מדגימות כירורגיות טריות שנכשלו נכשלו בשל חוסר התרחבות או זיהום מוקדם. הקמת קו התא נחשב מוצלח לאחר 3 קטעים עם צמיחה יציבה בתנאי תרבות סטנדרטיים (DMEM, 10% FCS, כלי תרבות סטנדרטי) ואימות של בידול אפיתל באמצעות FACS-ניתוח10. קווי התאים הנגזרים מגידולי PDX (איור 2C &amp;D) הראו שיעור הקמה גבוה יותר של 23.6% אשר נובע גם מהאפשרות של ניסיונות חוזרים ונשנים לעומת גידולים ראשוניים9. עם זאת, חלק מהתרבויות המעורבות (איור 2E)אינן יכולות להשתחרר מצמיחה פיברובלסטית או אפילו ללכת לאיבוד עקב צמיחת יתר פיברובלסטית(איור 2F).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig02.jpg"> איור 2: תרבות התאים. קווי תאים סרטניים ראשוניים, נגזר גרורות של מקרה סרטן המעי הגס HROC313, מעבר 21 (A) ומקרה סרטן הלבלב HROP88, קטע 5 (B). PDX נגזר קווי תאים סרטניים של המעי הגס PDX HROC285 T0 M2 (D) ולבלב PDX HROP10 T5 M2, מעבר 4 (E). תרבות מעורבת של פיברובלסטים ותאי סרטן מסרטן הלבלב HROP75, מעבר 8 (C) וגימת יתר פיברובלסטית (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בהתחשב בשינויים בפרוטוקול הדור PDX, זנים העכבר בשימוש וגם ניסויים על פני מספר שנים, כמו גם הבדלים גדולים בכמות רקמת הגידול זמין עבור חריטה, זה לא טריוויאלי לתת את שיעור ההצלחה הכולל של דור PDX. בסדרה עדכנית מאוד של ניסויי דור PDX שבוצעו על ידי שני חוקרים (S.M. ו- F.B.), נצפו שיעורי שגשוג ראשוניים של 63% עבור PDX המעי הגס (היסטולוגיה למופת ניתן לתאר מאיור 3A) ו -48% עבור PDX הלבלב (איור 3B). תולדות הלימפומה המורינית או האנושית באתר ההשתלה נדירות יחסית, אך יכולות לחקות את תנופת PDX המוצלחת(איור 3C). מלבד בדיקה היסטופתולוגית, קונקורדנציה בין מודלים PDX לבין המטופלים התורמים שלהם אושרה באופן קבוע על ידי ניתוח חוזר טנדם קצר (STR) (איור 3D). עד היום הביובנק כולל &gt;50 צבעים ראשוניים ו-&gt;50 משניים, 3 קווי תאים משניים לסרטן הלבלב ו-6 קווים משניים של סרטן הלבלב, כמו גם &gt;150 דגמי PDX המעי הגס ו-19 דגמי PDX בלבלב.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62065/62065fig03.jpg"> איור 3: השוואה היסטולוגית מייצגת של המעי הגס (A) ושל PDX הלבלב (B). לימפומה אנושית באתר ההשתלה מחקה את PDX מצמח (C). בדיקות זהות גנטית של מודל PDX (HROC430 T1 M2) לרקמת הגידול המקורית של המטופל (HROC430Tu) על ידי ניתוח חוזר טנדם קצר (STR). השוואה בין תשעת הלוקוסים STR, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (צבע FAM) ו- D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (צבע HEX) באמצעות PCR מולטיפלקס עם פריימרים עם תווית פלואורסצנטית בעקבות אלקטרופורזה נימי אישר קונקורציה גנטית של PDX וגידול (DDX) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62065/62065fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

בעבודה הבאה, אנו מתארים את הצעדים הרצופים הדרושים להקמת ביובנק גדול של סרטן המעי הגס והלבלב.

In light of the growing knowledge about the inter-individual properties and heterogeneity of cancers, the emerging field of personalized medicine requires ...

יצירה ותחזוקה של ביובנק חי איך אנחנו עושים את זה. מבוא. ביובנקים מסורתיים מכילים בדרך כלל דגימות רקמות ודם שאינן בנות קיימא. למרות המשקף כראוי את המגוון של אוכלוסיות חולי סרטן ומאפשר ניתוחים גנטיים והיסטולוגיים, הם אינם מתאימים מבחנים פרה-קוליניים להערכת אסטרטגיות טיפוליות.ביובנק המשלב גם מודלים שמקורם בחולה מתגבר על מגבלות אלה. ובכך מאפשר בדיקות פונקציונליות לרפואה מדויקת. רכישה לדוגמה.עבור biobanking של סרטן המעי הגס והלבלב, לבחור מקרים עם אבחון מוכח, כמו גם גודל גידול מספיק, תבלין הודיע של המטופל הוא חובה. לפני תחילת הניתוח, לצייר 20 מ"ל של דם באמצעות מזרק הפריני ו 7.5 מ"ל נוספים עם מונובט בסרום. עיבוד סרום ובידוד PBL.לאחר צנטריפוגה ב 1, 128 RCF במשך 15 דקות בארבע מעלות הסרום הוא aliquoted ב cryotube שכותרתו מראש שקוע ישירות חנקן נוזלי. הדם הפריני מועבר לצינור פוליפרופילן ומדולל עם PBS 15 מ"ל. השתמש פיפטה סרולוגית לאט underlay את התערובת עם 15ml Pancoll.לאחר צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, השכבה האטומה המכילה את התאים המונו-גרעיניים נלקחת עם פיפטה סרולוגית ומועברת לצינור PP חדש. לאחר שטיפה עם PBS ו pelleting את התאים mononuclear על ידי צנטריפוגה, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה במדיום מקפיא לוותר על cryotubes שכותרתו מראש. מעבירים את הצינורות למיכל קירור המתאים להקפאה איטית עם מעלה אחת לדקה ומאחסנים זמנית ב-80 מעלות.עיבוד רקמות. ברגע שדגימה רקמה הוא resected על ידי המנתח, לשים אותו לתוך מיכל מתאים. הימנע בכל הנסיבות כי הרקמה מכוסה פורמלין.הובלה מהירה ככל האפשר לפתולוגיה לכריתת חומר הגידול אינה רלוונטית להערכה פתולוגית של שולי הריתוס. חתיכת הגידול צריך להיות מטופל אספטי ככל האפשר. יתר על כן, להשיג דגימה של רקמה בריאה ומניחים הן בצינורות נפרדים ממולאים מראש עם פתרון אחסון רקמות על קרח.חזור מיד למעבדה כדי להתחיל עיבוד רקמות בתנאים סטריליים. חתיכת הרקמה מונחת על צלחת פלסטיק סטרילית מלאה בתמיסת אחסון רקמות כדי למנוע התייבשות. קודם כל, בלו אחד או יותר חתיכות בגודל pinhead עבור הצמד הקפאה בהתאם לגודל של דגימת הרקמה המתקבלת.מניחים את הרקמה המקומית לתוך cryotubes שכותרתו מראש לטבול מיד חנקן נוזלי. חותכים את הרקמה הנותרת לקוביות של שלוש על שלוש על שלושה מילימטרים מעוקבים. קח בחשבון כי רקמה נמקית חייב להיות מנותח לחלוטין אבל לא צריך להיות מושלך.סדר את הקוביות בארבעה כדי לקבוע את מספר aliquots עבור אחסון חיוני. תווית מספר נאות של cryotubes ולמלא אותם מראש עם 1.5 מ"ל מקפיא בינוני כל אחד. מאז DMSO במדיום המקפיא הוא ציטוטוקסי, ביצע את השלבים הבאים במהירות וללא הפרעה.השתמש להבי אזמל כדי לגרוף את ארבע חתיכות רקמה לכל צינור. ודא כי כל החלקים שקועים לחלוטין במקפיא בינוני באופן אידיאלי בתחתית הצינור במהירות להקפיא צינורות באמצעות מיכל הקפאה. המשך באותו אופן עם הדגימה הבריאה.לאחסון ארוך טווח, אחסנו את כל האליטרוטים במיכל חנקן נוזלי. תרבות תאים. טוחנים את שרידי עיבוד רקמת הגידול, כולל החלקים הנמקיים עם להבי האזמל קטנים ככל האפשר.מניחים מסננת תאים בחלק העליון של צינור PP סטרילי ושואפים את ההשעיה עם פיפטה סרולוגית לעבור דרך מסננת התא. השתמש בוכנה של מזרק לשימוש יחיד ללחוץ על הרקמה נשאר דרך מסננת התא כדי ליצור השעיה תא יחיד. יש לשטוף באמצעות PBS ולחזור על שלבים אלה עד שלא יישאר חומר.הסר את מסננת התא וצנטריפוגה ההשעיה ב 180 RCF במשך שבע דקות. בינתיים, להכין קולגן מצופה מראש שש באר צלחת עם קומפוזיציות מדיה שונות כדי להגדיל את ההסתברות של גידול לגדול. השלך את supernatant ו resuspend גלולה ב PBS ולחלק 500 microliters לכל באר.לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור סטנדרטי. דור של קסנוגרפט שמקורו בחולה. עבור הדור של קסנוגרפטים שמקורם בחולה בעכברים immunocompromised, בעלי חיים צריכים להישמר בסביבה ספציפית ללא פתוגן.ללבוש ציוד מגן אישי הכולל קרצוף, סינר, מסכת פנים, כיסוי שיער וכפפות. לאחר סידור סביבת העבודה שלך, לקחת את דגימת הגידול תשוקה ממיכל חנקן נוזלי. מלא צינור PP טרי עם PBS 35 מ"ל ולאחר מכן לשטוף את תהליך ההפשרה בזהירות להטות את צינור cryo למעלה ולמטה.ברגע התוכן הופך רפוי, שפכו לתוך PBS ולשטוף את חתיכות הגידול. השלך את רוב PBS ורוקן את הקוביות לתוך המכסה. מניחים צלחת פלסטיק סטרילית על חבילת קרח ומוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר Matrigel.השתמש מלקחיים למקם את חתיכות הגידול Matrigel ולהדגיר את הגידול במשך 10 דקות. בינתיים, תחטא שני עכברים. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הרגל של החיה.כל תנועה מצביעה על הרדמה לא מספקת ודורשת המתנה מסוימת או מינון נוסף. החל משחת עיניים, לצבוט את העכבר על ידי הצוואר ולהזריק שבב תת עורי. בצע את השלבים הבאים במקביל.לחטא את האגפים של העכברים ולעשות חתך עור קטן עם מספריים Metzenbaum פסים וליצור כיס תת עורי על ידי הכנה בוטה. השתמש מלקחיים אנטומיים כדי להכניס את חתיכות הגידול. ודא כי החתיכה ממוקמת בקצה האחורי של כיס העור.שאפתן את Matrigel הנותרים ולחלק באופן שווה לכל ארבעת הכיסים. המתינו לריפוי הג'ל וסגרו את העור בתפרים עם כפתור יחיד מבלי לפגוע בחלקי הגידול עם המחט. חותכים את החוט קצר ככל האפשר מעל הקשר ולהחיל רוטב ספריי כדי למנוע נוי של התפרים.סרוק את השבב והוסיף את מידע הגידול למסד הנתונים לזיהוי מאוחר יותר של החיה. מכינים כלוב עם מצעים טריים וחומר קינון, מניחים את העכברים מול מנורת אינפרא אדום ומנטרים את החיה עד שההרדמתה שככה. הסבר של PDX.לאחר הגידול PDX הגיע לגודל הנדרש, העכבר הוא מורדם על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם הבאים. לנתח בזהירות את העור מהגידול ולהסיר את PDX לחלוטין. תוצאות מייצגות.מניחים גידול על צלחת פלסטיק סטרילית ומשתמשים בלהבי אזמל סטריליים לעיבוד נוסף. חותכים חור עם הפרוסות, מניחים אותם בקלטת היסטולוגיה ושקעים בפורמלין כדי ליצור דגימה משובצת פרפין להערכה היסטולוגית במועד מאוחר יותר. מעבירים את שאר הגידול לתמיסת אחסון רקמות ויוצרים דגימה קפואה חדשה שהשתמרה באופן חיוני ונשברת עבור הביובנק.בנוסף, השתמש בשרידי הגידול PDX מקביל לתרבות תא הפרק כדי להקים קווי תאים סרטניים משניים. כדי ליצור PDX נוסף, להעביר שתי חתיכות גידול או יותר עם Matrigel לעכבר נמען חדש כפי שמוצג קודם לכן. מסקנה. באמצעות הפרוטוקול שהוצג, הצלחנו עד כה להקים תשעה דגמי PDX של הלבלב ויותר מ-100 חולי המעי הגס, כמו גם 19 דגמי PDX בלבלב ומעל 150 צבעים.

creation-and-maintenance-of-a-living-biobank-how-we-do-it

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

גידולים עוריים נמחקים לעתים קרובות לאחר ניתוח microsraphic Mohs. פרוטוקול מתואר כאן המאפשר לצוות התמיכה הקלינית לעבד ולאחסן באופן יעיל גידול סרטני ( כגון קרצינומה של תאי קשקש , קרצינומה של תאי בסיס ומלנומה) עבור יישומים במעבדה במורד הזרם מבלי להפריע לפעולות קליניות.

הקמת מאגר ביולוגי המבוסס על מרפאה

היישום המעשי והביצועים של שיטות לדור של דגימות רקמה נציג של חזירי מודלים בבעלי חיים עבור קשת רחבה של ניתוחים במורד הזרם בפרויקטים biobank מודגמות, כולל volumetry, דגימה אקראית שיטתית, ועיבוד דיפרנציאלית של דגימות רקמה עבור סוגי ניתוחים כמותיים מורפולוגיות ומולקולרית.

אסטרטגיות דגימה ועיבוד של דגימות רקמה Biobank של מודלים ביו חזירי

שיטה זו כוללת ניצול של נתוני אבחון קליני עבור חולי סרטן הערמונית על מנת להנחות את הליכי הדגימה, כאשר רקמת biobanking בעקבות כריתת רדיקלים קיצוניים. זה מתגבר על בעיות עם שיטות שפורסמו בעבר סביב יעילות וזמינות של רקמות טריות עבור מגוון רחב יותר של יישומי במטה.

שימוש של תהודה מגנטית הדמיה נתונים ביופסיה כדי להנחות הליכי דגימה עבור סרטן הערמונית ביאובאנקינג

פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר מסלולים בודדים של הזדקנות המוח באמצעות תוכנית תרומת מוח ואפיון נכון של המוח. תורמי מוח מעורבים במחקר אורכי ארוך טווח כולל הערכות רב מימדיות סדרתיות. הפרוטוקול מכיל תיאור מפורט של עיבוד המוח ומתודולוגיית אבחון מדויקת.

פרוטוקול בנק המוח Abbiategrasso לאיסוף, עיבוד ואפיון מוחות מזדקנים

ביובנקים הם משאבים חיוניים למחקר ביו-רפואי והיחידה לרפואה תרגומית ודיגיטלית במכון האירופי לאונקולוגיה היא מודל בתחום זה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של ביו-בנקים לניהול סוגים שונים של דגימות ביולוגיות אנושיות.

ביובנק לרפואה תרגומית: נהלי הפעלה סטנדרטיים לניהול דגימות אופטימלי

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקל על איסוף דגימות מדגימות כריתת ערמונית רדיקלית. המטרה היא למפות, לאפיין ולנתח במיקרו-מאקרו דגימות רקמה מהדגימות על סמך קריטריונים אנטומופתולוגיים לפני אחסונן בביובנק.

שיפור האמינות הביו-בנקאית של גידול הערמונית באמצעות טכניקת דגימה משופרת ואפיון היסטולוגי

פרוטוקול זה מציג פלטפורמה משולבת של מאגר ביולוגי לאיסוף, ביאור וביו-בנקאות סטנדרטיים של הומור מימי אנושי באיכות גבוהה וביופסיות נוזליות בזגוגית עבור אנליזות מולקולריות במורד הזרם, כולל פרוטאומיקה, מטבולומיקה וגליקומיקה.

ביובנק של ביופסיות נוזליות מימיות וזגוגיות אנושיות לאנליזות מולקולריות

פרוטוקול זה מציע מסגרת שיטתית להקמת אורגנואידים של סרטן השחלות משלבי מחלה שונים ונותן מענה לאתגרים של שונות ספציפית למטופלת כדי להגדיל את התשואה ולאפשר התרחבות חזקה לטווח ארוך ליישומים הבאים. הוא כולל שלבים מפורטים לעיבוד רקמות, זריעה, התאמת דרישות מדיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

אסטרטגיה לביו-בנקאות של אורגנואידים של סרטן השחלות: טיפול בהטרוגניות הבין-אשפוזית על פני תת-סוגים היסטולוגיים ושלבי מחלה

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לאיסוף דגימות סרטן השד, שנועד לייעל את התועלת שלהן עבור בנקאות ביולוגית, רפואה מותאמת אישית ויישומי מחקר אחרים. זרימת העבודה לאיסוף דגימות, כולל ביופסיה של השד והליכי כריתת שד, מתוארת בפירוט, תוך התמקדות במזעור נזק לרקמות ומקסום איכות הדגימה.

אופטימיזציה של ביופסיית שד והליכי איסוף דגימות כריתת שד עבור ביו-בנקאות, רפואה מותאמת אישית ויישומי מחקר

נסביר פרוטוקול למידול במיקרו-סביבה של biophysical שבו crosslinking וקשיחות מוגברת של קרום במרתף (BM) הנגרמת על ידי endproducts גליקציה מתקדמים (גילאי) יש רלוונטיות פתולוגי.

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

למדו כיצד ליצור ולתחזק ביובנק חי לסרטן מעי גס ולבלב, הכולל דגמי PDX וקווי תאים מגידולי מטופלים. פרוטוקול זה מאפשר בדיקות טרום-קליניות לרפואה מותאמת אישית.

יצירה ותחזוקה של ביובנק חי - איך אנחנו עושים את זה

גלה סרטונים נוספים