גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי יעיל של שילובי גנים או גנים שחוסמים פלישה לסרטן אצל הצופה. על פני התרבות אינו דורש מתקני בעלי חיים מתקדמים לתחזוקה. ככלל, כמו ספריות מיוחדות כלליות או כלליות ניתן להקרין בתוך כמה שבועות בצופה.

מערכת סינון זו תסייע לחוקרים לגלות מטרות גנטיות טיפוליות חדשניות או שילובים של מטרות גנים שניתן להשתמש בהם כדי לחסום גרורות סרטן. להזרקת IV, מרכזים תאים ל-0.5 עד 1 מיליון תאים למיליליטר, תוך שימוש ב-1X PBS קר כקרח כדי לדלל או להשעות מחדש את התאים. צפו שיהיה צורך במיליליטר אחד של השעיית תאים עבור כל 10 עוברים.

כדי להרכיב את מנגנון ההזרקה, להרכיב מחט על המזרק, ולאחר מכן להאריך את מחט המזרק עם חתיכה ארוכה של שלושה עד חמישה סנטימטרים של צינורות. לשבור את קצה המחט borosilicate באמצעות מלקחיים עדינים. לטעון את המזרק עם 50 עד 200 microliters של השעיית התא הסרטני.

ולהכניס את מחט borosilicate לתוך הצינורות. בדוק את המחט עבור סתימת תאים ובועות אוויר. אם סתימת תאים נצפתה בתוך נימי, להסיר את נימי, להשעות מחדש את התאים ולהחליף אותו עם נימי חדש.

השתמש בוכנה לדחוף החוצה כל בועות. הסר את מכסה הכיסוי והעביר את העובר מתחת לסטריאוסקופ. זהה את הווריד המתאים להיות מוזרק על פני השטח CAM;אשר בדרך כלל רק מעט רחב יותר מאשר הקוטר של קצה מחט borosilicate וממוקם באמצע הדרך בין העובר לקיר צלחת שקילה.

בדרך כלל קל יותר להזריק בנקודה הסמוכה לתפרות הווריד. לחץ על קצה המחט על דופן כלי הדם והפעל לחץ עדין באותו כיוון כמו זרימת הדם. במידת הצורך, להשתמש צמר גפן כדי לעזור לעגן או לייצב את כלי כי הוא מוזרק.

לדכא בעדינות את הבוכנה מזרק במשך 2 עד 10 שניות עד הנפח הרצוי מוזרק. יש להשליך את העובר אם מופיעים דימום מוגזם או הצטברות נוזל ברורה באתר ההזרקה. הסר את המחט מן CAM בעדינות לטבול את אתר ההזרקה עם צמר גפן כדי להסיר כל דם או תאים סרטניים עודפים.

מכסים את העובר המוזרק בצלחת השקילה עם המכסה ומחזירים אותו לאינקובטור. חזור על ההליך עד שכל העוברים מוזרקים. בדוק חזותית את העוברים עבור חיידקים או זיהום עובש או מוות.

ולהשליך עוברים מזוהמים על פי נהלי סילוק מעבדה. ודא כי מושבות גרורתיות מופיעות אחידות בכושר במהלך הראשון עד שלושה ימים לאחר ההזרקה. ולזהות מושבות גרורתיות פולשניות או לא פולשניות בימים 4 עד 5 לאחר ההזרקה.

ביום החמישי לאחר ההזרקה, להסיר את העוברים מן האינקובטור ולבדוק ולאתר את CAMs העובר עבור התפלגות המושבה גרורתית. תחת מיקרוסקופ הניתוח, משוך בעדינות את רקמת CAM המכילה את המושבה גרורתית של עניין כלפי מעלה באמצעות מלקחיים עדינים, ולחתוך אותו עם מספריים כירורגיים. מעבירים את רקמת CAM לצינור ריק וסטרילי של 1.5 מיליליטר וסוגרים את מכסה הצינור.

חזור על הליך כריתת עד שכל המושבות מעניינים נאספים לצינורות נפרדים. טחון בעדינות את רקמת CAM בצינור צנטריפוגה מיקרו, באמצעות מחט סטרילית נפרדת 18 מד עבור כל מושבה. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת קולגן-A 1X ודגרו במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

סובבו את התאים ורקמת CAM במהירות של פי 300 ג'י במשך חמש דקות בטמפרטורת הסביבה. שאפו את תמסת הקולגן-A והשעו מחדש את התאים מדיה לא שלמה עבור קו העניין של התא. ואז לסובב את התאים והרקמות שוב.

להשעות מחדש תאים וחתיכות רקמות במיליליטר אחד של מדיה מלאה גורם בחירה, אם בכלל. לאחר מכן מעבירים לצלחת אחת של תרבית רקמות 12-well היטב. במשך שבוע עד שלושה שבועות הבאים, לפקח על התאים הסרטניים מדי יום לצמיחה וזיהום.

כאשר התאים מגיעים 70 עד 80% של confluency להעביר אותם לתוך צלחת תרבות נפח גדול יותר. המשך לרצף או לסיבוב הבחירה הבא, ברגע שיגיעו למספרי תאים סרטניים נאותים. עוברים המציגים הצטברות של תאים סרטניים עקב הזרקה לא מוצלחת, ניתן לראות ברוב הנימים.

כאשר ריכוז התא האופטימלי ומשך ההזרקה מושגים, היום החמישי תאים transduced לאחר הזרקה צריך לייצר מגוון רחב של פנוטיפים המושבה, עם רוב המושבות פולשניות כפי שנקבע על ידי התאים הסרטניים המופיעים מפוזרים ברקמת CAM. יש לשים לב למושבות גרורתיות שנראות קומפקטיות וממוקמות רחוק מספיק מהמושבות השכנות, כך שניתן לחתוך עם מלקחיים ומספריים וחתיכה אחת של רקמת CAM. פגיעת מסך חיובית מבודדת צריכה להציג את פנוטיפ המושבה הקומפקטית בעת הזרקה מחדש.

למדידה של מגעי כלי הדם של התא הסרטני, יש להקדיש תשומת לב לבהירות כתם דופן כלי הדם ויש להזריק את הכמות המתאימה של לקטינים לאות קיר כלי הדם. בעת ניסיון פרוטוקול זה להימנע תחת או מעל הזרקה ולהסיר דימום מוגזם או הצטברות נוזלית. מספר גנים חדשניים המניעים פלישה לתאי סרטן בצופה זוהו באמצעות טכניקה זו.