ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

בעזרת פרוטוקול זה, אנו יכולים לצפות ישירות בפיצול דנ"א ספציפי לאתר על ידי הגבלת אנדונוקלאזות ברמת המולקולה הבודדת. הגישה המרובבת שלנו מאפשרת לנו למדוד את הזמן שלוקח למאות REases בודדים להשלים את המחזור הקטליטי. ריבוב מאפשר לנו לייצר זמן שהייה מאוכלס היטב להתפלגויות מחשוף שאנו יכולים להתאים להתפלגות הסתברות גמא כדי לקבל תובנות על מנגנון פיצול הדנ"א.

התחילו בהכנת צינורית טרייה לכל אוליגונוקלאוטיד מרחף ב-50 מיקרוליטר של האוליגונוקלאוטיד ו-50 מיקרוליטר של תמיסת DTT טרייה לכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה את כל הנפח של כל תערובת דגימה בעדינות על עמוד מוכן וצנטריפוגה ב 750G במשך שתי דקות. לאחר הצנטריפוגה, אחסנו דגימות שלא ישמשו באופן מיידי בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי למנוע חמצון של קבוצות התיול והיווצרות קשרים דיסולפידים.

פיפטה אחת של 50 מיקרוליטר ממלאי הנקודות הקוונטיות לתוך מכשיר דיאליזה לכל מבנה שיש לבצע, תוך הקפדה לא לגעת בקרום עם קצה הפיפטה. נטרל כנגד נפח של חיץ CHES שהוא לפחות פי 1,000 מנפח הדגימה עם ערבוב ב-100 סל"ד למשך 15 דקות. בעזרת צינור, שלפו בזהירות את הנקודות הקוונטיות המרחפות ממכשיר הדיאליזה והעבירו אותן לצינור טרי המכיל נפח שווה של תמיסת Sulfo-SMCC טרייה, תוך פיפטציה מעלה ומטה כדי לערבב.

דגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם טלטול ב -1, 000 סל"ד כדי לאפשר ל- Sulfo-SMCC להגיב עם האמינים הראשוניים על הנקודות הקוונטיות. לאחר מכן, השתמש בצינור כדי להעביר בזהירות כל דגימה למכשיר דיאליזה טרי. כדי להסיר עודף Sulfo-SMCC, dialyze כנגד נפח של חיץ CHES כי הוא לפחות 1, 000 פעמים נפח הכלול במכשיר דיאליזה עם ערבוב במשך 15 דקות.

החליפו את החיץ פעמיים ובצעו דיאליזה עם חיץ CHES טרי שלוש פעמים בסך הכל, מה שמאפשר לדיאליזה להמשיך במשך 15 דקות לאחר כל החלפת חיץ. לאחר מכן חזור על הדיאליזה עם PBS. באמצעות פייטר, לשחזר בזהירות את התמיסה המכילה את הנקודות הקוונטיות ממכשיר הדיאליזה ולהעביר כל דגימה לתוך צינור טרי המכיל כמות שווה של אוליגונוקלאוטיד מורחב מדולל PBS.

לדגור במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם רעד ב 1, 000 סל"ד. הוסף BSA לכל דגימה לקבלת ריכוז סופי של 0.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן השתמשו בפילטר כדי להעביר בזהירות כל דגימה למכשיר דיאליזה טרי ולבצע דיאליזה כנגד מאגר אחסון.

לאחר דיאליזה, בזהירות לשחזר כל דגימה ומניחים אותו לתוך צינור טרי. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שלב דגימה של נקודה קוונטית המסומנת אוליגונוקלאוטידים עם עודף מולארי פי עשרה של אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה.

מחממים את התערובת בגוש חום ל-75 מעלות צלזיוס ומחזיקים אותה בטמפרטורה זו למשך 5 דקות. לאחר מכן כבו את בלוק החום ואפשרו לתערובת להתקרר באיטיות. אחסנו את המבנה שהושלם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות כלי רב-תכליתי סיבובי ידני המצויד בסיבית גלגל נקודת יהלום מחודדת, קדח שני חורים בפינות מנוגדות של מגלשת הקוורץ כדי לשמש ככניסה ויציאה.

הקפידו לאבטח את המגלשה במקומה, לשמן את החלק ולהחליק כל הזמן במים בזמן הקידוח. לאחר כל ניסוי, לשחזר את שקופית קוורץ מוכן על ידי השריית המכשיר בשימוש אצטון כדי להמיס את דבק אפוקסי. השליכו את שאר הרכיבים.

שלב 25 מיקרוליטר של תמיסת סטרפטווידין עם 80 מיקרוליטר של PBS ו -20 מיקרוליטר של חיץ חוסם. מצפים מכסה שעבר טיפול ב-PEG בתערובת זו, ודגרו בסביבה לחה במשך 30 דקות. במהלך הדגירה של חלקת הכיסוי, הכינו את ספייסר ההדמיה ליצירת ערוץ זרימה.

חתכו פיסה מרובעת בגודל 1 אינץ' של חומר ספייסר הדמיה, ולאחר מכן סמנו תעלה ברוחב 2 מילימטר המיושרת לקצות החורים שנקדחו בשקופית הקוורץ. חותכים את התעלה מחומר הספייסר בעזרת אזמל. נקו היטב את מגלשת הקוורץ עם אצטון כדי להסיר שאריות דבק מניסויים קודמים.

מקלפים צד אחד של הגב מהספייסר של התמונה ומניחים אותו בזהירות על שקופית הקוורץ, תוך הקפדה שלא לכסות את חורי הכניסה והיציאה. יש לשטוף את המכסה במים ולייבש באוויר דחוס. הסירו את הצד השני של הגב מהספייסר ההדמיה ודחפו אותו בין מגלשת הקוורץ לבין הכיסוי המצופה סטרפטאבידין המתפקד באמצעות פינצטה מפלסטיק כדי ללחוץ על המכלול יחד ולהסיר בועות אוויר מהדבק.

חתכו את קצה הצינור בזווית כדי להבטיח זרימה חופשית של התמיסה. לאחר מכן הכנס צינורות פוליאתילן באורך 30 ס"מ לכל חור בשקופית הקוורץ. החזק את הצינורות במקומם באמצעות מתלה צינורות, ולאחר מכן השתמש באפוקסי כדי לאטום את הצינורות במקומם ואת קצוות המכשיר שהורכב.

לאחר הגדרת האפוקסי, הכנס את המחט הקהה על מזרק ריק לתוך צינור היציאה של המכשיר ושקע את קצה צינור הכניסה במיכל מלא במאגר החסימה. משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי למלא את המכשיר במאגר חוסם. לאחר מכן השאירו את המכשיר לדגור לפחות 30 דקות לפני השימוש.

חבר את המכשיר המיקרופלואידי ללוח שלב המיקרוסקופ באמצעות סרט הדבקה. הבא את המטרה במגע עם החלק התחתון של המכשיר ומקם את המטרה כך ששדה הראייה יהיה בתוך התעלה המיקרופלואידית. לאחר חיבור צינור היציאה למשאבת המזרק, שטפו את התעלה המיקרופלואידית בחיץ חוסם טרי על ידי משיכת בוכנה של המזרק.

בדקו שאין בועות כלואות בצינורות או בתעלה. לדלל 1 מיקרוליטר של מצע DNA מוכן לתוך 1 מיליליטר של חיץ חוסם. מניחים את צינור הכניסה לתוך מצע הדנ"א המדולל ומזרימים 800 מיקרוליטר של תמיסת המצע דרך התעלה בקצב של 200 מיקרוליטר לדקה.

אפשרו לתמיסת הדנ"א לדגור בתעלה במשך 15 דקות לאחר הפסקת הזרימה. לאחר הדגירה, הזרימו לפחות 800 מיקרוליטר של חיץ חוסם דרך התעלה בקצב של 200 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף את הדנ"א הלא קשור מתוך התעלה. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ כך שהנקודות הקוונטיות הקשורות לפני השטח ייראו בבירור.

שטפו את המכשיר המיקרופלואידי ב-800 מיקרוליטר של חיץ ניסיוני ללא מגנזיום בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לדקה. מוסיפים את ה-REase לאליקוט של חיץ ניסיוני ללא מגנזיום ומערבבים בעדינות על ידי פיפטטינג. זרימה של 800 מיקרוליטר של 400 יחידות למיליליטר של EcoRV דרך הערוץ בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לדקה.

התחל את הניסוי על ידי הזרמת המאגר הניסיוני המכיל מגנזיום ופלואורסצאין בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לדקה. התחל ללכוד נתונים מיד לאחר הפעלת משאבת המזרק. עצור את איסוף הנתונים לאחר הזרמת 800 מיקרוליטר של חיץ.

לאחר החדרת מצע הדנ"א לתא הזרימה ושטיפת עודפי דנ"א ונקודות קוונטיות, יש בדרך כלל אלפי נקודות קוונטיות בודדות בשדה הראייה. הם מחוברים ביציבות למשטח הזכוכית ואינם עוברים עמעום ניכר או הלבנה משמעותית לאורך כל הניסוי. כאשר ה-REase זורם בערוץ בהיעדר מגנזיום, לפחות 95% מהנקודות הקוונטיות שהיו קיימות בתחילת הניסוי עדיין ניתן לראות בסוף תקופת התצפית.

עם זאת, כאשר המאגר המכיל מגנזיום מוזרם מיד לאחר REase, עד מחצית מהנקודות הקוונטיות נעלמות בסוף תקופת התצפית, בדומה למה שנצפה כאשר REase ומגנזיום מוזרמים דרך התעלה יחד. היעלמות נקודה קוונטית מתרחשת במהירות וגורמת לירידה חדה במסלול העוצמה, מה שמספק אינדיקציה ברורה לזמן שבו מולקולת דנ"א נתונה נבקעת. ניסוי זה בוצע עם סוג II P REase EcoRV.

התאמת עקומת הריבועים הפחותים הלא ליניארית ואומדן פרמטר הסבירות המרבית שימשו לחילוץ הערכים של n ובטא מהנתונים. שתי שיטות הערכת הפרמטרים היו בהסכמה. בהתאמת הריבועים הפחות ליניאריים, n היה 3.52 ובטא היה 5.78 שניות.

לפי הערכת הסבירות המרבית, n היה 3.41 ובטא היה 6.06 שניות. בדיקה זו יכולה לספק עדות לנוכחותם של שלבי ביניים לאורך מסלול המחשוף. ביצוע בדיקה זו בתנאי תגובה משתנים יכול לעזור לקבוע את טבעם של מתווכי תגובה שלא ניתן לצפות בהם ישירות.