Name: ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: חקור מנגנוני חיתוך DNA על ידי אנדונוקלאזות הגבלה ברמה של מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופיית פלורסצנציה ורב-שידור. שיטה זו מאפשרת למדוד זמני שהייה ולהבין את המחזור הקטליטי של האנזימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס מספר K12GM074869 CME מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים או המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+restriction+enzymes+became+the+workhorses+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5905-5908 (2005).</li>
<li>Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+of+the+DNA+cutters%3A+a+short+history+of+the+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 3-19 (2014).</li>
<li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBASE--a+database+for+DNA+restriction+and+modification%3A+enzymes%2C+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 298-299 (2015).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+and+jumping+of+single+EcoRV+restriction+enzymes+on+non-cognate+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Sliding and jumping of single EcoRV restriction enzymes on non-cognate DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 4118-4127 (2008).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 96 (8), 50-52 (2009).</li>
<li>Blainey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecifically+bound+proteins+spin+while+diffusing+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).</li>
<li>Huang, C. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+DNA+recognition+by+restriction+endonuclease+EcoRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of DNA recognition by restriction endonuclease EcoRI.</a> Journal of Experimental & Clinical Medicine. 5 (1), 25-29 (2013).</li>
<li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+biomolecular+nanoarrays+for+parallel+single-molecule+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Selective biomolecular nanoarrays for parallel single-molecule investigations.</a> Journal of American Chemical Society. 133 (20), 7656-7659 (2011).</li>
<li>Reinhard, B. M., Sheikholeslami, S., Mastroianni, A., Alivisatos, A. P., Liphardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+plasmon+coupling+to+reveal+the+dynamics+of+DNA+bending+and+cleavage+by+single+EcoRV+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of plasmon coupling to reveal the dynamics of DNA bending and cleavage by single EcoRV restriction enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2667-2672 (2007).</li>
<li>van den Broek, B., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-tension+dependence+of+restriction+enzyme+activity+reveals+mechanochemical+properties+of+the+reaction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA-tension dependence of restriction enzyme activity reveals mechanochemical properties of the reaction pathway.</a> Nucleic Acids Research. 33 (8), 2676-2684 (2005).</li>
<li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li>
<li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li>
<li>Loparo, J. J., van Oijen, A. Single-molecule enzymology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoparo%2C+JJ+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22">Handbook of Single-Molecule Biophysics</a>. Hinterdorfer, P., Oijen, A. , Springer. New York, NY. 165-182 (2009).</li>
<li>Taylor, J. D., Badcoe, I. G., Clarke, A. R., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoRV+restriction+endonuclease+binds+all+DNA+sequences+with+equal+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity.</a> Biochemistry. 30 (36), 8743-8753 (1991).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1529(2009).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1689(2010).</li>
<li>Baldwin, G. S., Vipond, I. B., Halford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reaction+analysis+of+the+catalytic+cycle+of+the+EcoRV+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid reaction analysis of the catalytic cycle of the EcoRV restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 34 (2), 705-714 (1995).</li>
<li>Winkler, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal-structure+of+Ecorv+endonuclease+and+of+Its+complexes+with+cognate+and+non-cognate+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The crystal-structure of Ecorv endonuclease and of Its complexes with cognate and non-cognate DNA fragments.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1781-1795 (1993).</li>
<li>Sioss, J. A., Stoermer, R. L., Sha, M. Y., Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated%2C+Au%2FAg+striped+nanowires+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Silica-coated, Au/Ag striped nanowires for bioanalysis.</a> Langmuir. 23 (22), 11334-11341 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים

מצע הדנ"א של בדיקה זו מסומן בנקודה קוונטית באמצעות סכמת תגובה דו-שלבית באמצעות sulfo-SMCC. קרוסלינקר דו-תפקודי זה מורכב ממויטי אסטר NHS שיכול להגיב עם אמין ראשוני, ומויטי מלימיד שיכול להגיב עם קבוצת סולפידריל20. האוליגונוקלאוטידים התיאולטיים המשמשים להכנת המצע נשלחים בצורתם המחומצנת. חשוב להפחית ולטהר אותם, כמתואר, לפני שתמשיך בהליך הצימוד, או שהיעילות של תגובת הצימוד תפחת. חיוני להכין פתרונות DTT ו-sulfo-SMCC טריים מיד לפני השימוש. מולקולות אלה עוברות הידרוליזה במהירות בתמיסה מימית. יש לנקוט משנה...

אנדונוקלאז הגבלה (REases) הם אנזימים המשפיעים על הפסקות דו-גדיליות ספציפיות לרצף בדנ"א. גילוי REases בשנות השבעים הוביל לפיתוח טכנולוגיית DNA רקומביננטי, ואנזימים אלה הם כיום כלי מעבדה חיוניים לשינוי גנטי ומניפולציה1. REases מסוג II הם האנזימים הנפוצים ביותר בקבוצה זו מכיוון שהם מבקעים דנ"א במיקום קבוע בתוך או בסמוך לרצף הזיהוי שלהם. עם זאת, קיימת שונות רבה בין REases מסוג II, והם מחולקים למספר תת-סוגים המבוססים על תכונות אנזימטיות מסוימות ולא מסווגים על פי היחסים האבולוציוניים שלהם. בין כל תת-סוג, ישנם חריגים תכופים לסכמת הסיווג, ואנזימים רבים שייכים למספר תת-סוגים2. אלפי REases מסוג II זוהו, ומאות מהם זמינים מסחרית.
עם זאת, למרות הגיוון בין REases סוג II, מעט מאוד REases נחקרו בפירוט. על פי REBASE, מסד הנתונים של אנזימי הגבלה שהוקם על ידי סר ריצ'רד רוברטס בשנת 19753, נתוני קינטיקה שפורסמו זמינים עבור פחות מ -20 אנזימים אלה. יתר על כן, בעוד שחלק מה-REases נצפו ישירות ברמת המולקולה הבודדת תוך כדי פיזור לאורך הדנ"א לפני המפגש והקישור לרצף הזיהוי שלהם 4,5,6,7, ישנם מעט מאוד מחקרים על מולקולות בודדות של קינטיקה של תגובת המחשוף שלהם. המחקרים הקיימים אינם מדווחים על נתונים סטטיסטיים מספיקים כדי לבצע ניתוח מפורט של השונות בזמנים שבהם אירועי מחשוף יחיד מתרחשים 8,9,10 או שאינם מסוגלים ללכוד את ההתפלגות המלאה של פיהמחשוף 11. סוג זה של ניתוח יכול לחשוף את נוכחותם של מתווכים קינטיים בעלי תוחלת חיים ארוכה יחסית ויכול להוביל להבנה טובה יותר של מנגנוני פיצול ה- DNA בתיווך REase.
ברמת המולקולה הבודדת, תהליכים ביוכימיים הם סטוכסטיים - זמן ההמתנה למופע יחיד של התהליך להתרחש, τ, משתנה. עם זאת, מדידות רבות של τ צפויות לציית להתפלגות הסתברות, p(τ), המעידה על סוג התהליך המתרחש. לדוגמה, תהליך חד-שלבי, כגון שחרור מולקולת מוצר מאנזים, יציית לסטטיסטיקה של פואסון, ו-p(τ) ילבש צורה של התפלגות מעריכית שלילית:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq1v3.png">
כאשר β הוא זמן ההמתנה הממוצע. שימו לב שקצב התהליך, k, יהיה שווה ל-1/β, ההופכי של זמן ההמתנה הממוצע. עבור תהליכים הדורשים יותר משלב אחד, p(τ) יהיה הפיתול של ההתפלגויות המעריכיות הבודדות עבור כל אחד מהצעדים הבודדים. פתרון כללי לפיתול של N פונקציות דעיכה חד-מעריכיות בעלות זמני המתנה ממוצעים זהים, β, הוא התפלגות הסתברות הגמא:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62112/62112eq2v3.png">
כאשר Γ(N) היא פונקציית הגמא, המתארת את האינטרפולציה של העצרת של N-1 לערכים שאינם שלמים של N. למרות שניתן להשתמש בפתרון כללי זה כקירוב כאשר זמני ההמתנה הממוצעים של צעדים בודדים דומים, יש להבין כי הימצאותם של צעדים מהירים יחסית תווסווה על ידי צעדים בעלי זמני המתנה ארוכים משמעותית. במילים אחרות, הערך של N מייצג גבול נמוך יותר למספר השלבים12. עם מספר מספיק של מדידות זמן המתנה, ניתן להעריך את הפרמטרים β ו- N על ידי כריכת האירועים והתאמת התפלגות הגמא להיסטוגרמה המתקבלת או על ידי שימוש בגישת הערכת סבירות מרבית. סוג זה של ניתוח יכול אפוא לחשוף את נוכחותם של צעדים קינטיים שלא ניתן לפתור בקלות במבחני אנסמבל ודורש מספר רב של תצפיות כדי להעריך פרמטרים במדויק12,13.
מאמר זה מתאר שיטה לשימוש בדנ"א המסומן בנקודות קוונטיות ובמיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי לצפות במאות אירועי מחשוף דנ"א בודדים בתיווך REase במקביל. תכנון הבדיקה מאפשר לאגד תוצאות של מספר ניסויים ויכול ליצור התפלגות זמן שהייה המכילה אלפי אירועים. יציבות האור הגבוהה והבהירות של נקודות קוונטיות מאפשרות רזולוציית זמן של 10 הרץ מבלי להקריב את היכולת לצפות באירועי מחשוף המתרחשים אפילו דקות רבות לאחר תחילת הניסוי. רזולוציית זמן טובה וטווח דינמי רחב, בשילוב עם היכולת לאסוף מערך נתונים גדול, מאפשרים אפיון מדויק של התפלגויות זמן השהייה כדי לחשוף את נוכחותם של שלבים קינטיים מרובים במסלולי המחשוף של REases, שיש להם שיעורי תחלופה בטווח של 1 דקות 1 . במקרה של EcoRV, ניתן לפתור שלושה שלבים קינטיים, שכולם זוהו באמצעים אחרים, המאשרים כי הבדיקה רגישה לנוכחותם של צעדים כאלה.
מצעי דנ"א דו-צדדיים המכילים את רצף הזיהוי המעניין מיוצרים על ידי חישול אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה לגדיל משלים המסומן בנקודה קוונטית ננו-גבישית מוליכים למחצה יחידים. מצעים אלה מוחדרים לתעלת זרימה הבנויה על גבי כיסוי זכוכית עם מדשאה של מולקולות פוליאתילן גליקול (PEG) בעלות משקל מולקולרי גבוה המחוברות באופן קוולנטי לפני השטח שלה. מצעי הדנ"א נלכדים באמצעות קישור ביוטין-סטרפטווידין-ביוטין על ידי חלק קטן ממולקולות ה-PEG שיש להן ביוטין בקצה החופשי שלהן. במיקרוסקופ TIRF, גל אוונסנטי הדועך באופן אקספוננציאלי עם המרחק מממשק זכוכית-נוזל מספק תאורה; עומק החדירה הוא בסדר גודל אורך הגל של האור בו נעשה שימוש. בתנאים אלה, רק נקודות קוונטיות הקשורות לפני השטח על ידי מולקולת דנ"א שנלכדה על משטח הזכוכית המתפקד יעוררו. נקודות קוונטיות חופשיות בתמיסה לא יוגבלו בתוך האזור המואר ולכן לא יאירו אותן. אם הדנ"א הקושר נקודה קוונטית לפני השטח ייבקע, אותה נקודה קוונטית תהיה חופשית להתפזר הרחק מפני השטח, והיא תיעלם מהתמונה הפלואורסצנטית.
אף על פי שידוע כי REases רבים מסוג II קושרים דנ"א בהיעדר מגנזיום14, כולם דורשים מגנזיום כדי לתווך את מחשוף הדנ"א15. REases אלה יכולים לקשור את הדנ"א המשותק בפני השטח בהיעדר מגנזיום. כאשר חיץ המכיל מגנזיום מוזרם דרך תעלה עם REase מראש לדנ"א, המחשוף מתחיל מיד, כפי שמצוין על ידי היעלמות של נקודות קוונטיות. הסנכרון המושג על ידי קשירה מוקדמת של מולקולות REase, ולאחר מכן התחלת פיצול DNA על ידי החדרת מגנזיום, מאפשר מדידה של זמן הפיגור עד להשלמת פיצול DNA באופן עצמאי עבור כל מולקולה באוכלוסיית האנזימים שנצפתה בניסוי. פלואורסצאין נכלל כצבע נותב במאגר המכיל מגנזיום כדי לציין את הגעתו של מגנזיום לשדה הראייה. מכיוון שאף אנזים אינו כלול במאגר המכיל מגנזיום, זמן הפיגור מהגעתו של חיץ המכיל מגנזיום להיעלמותו של כל נקודה קוונטית מציין את הזמן שלוקח ל-REase שכבר קשור לדנ"א לבקע את הדנ"א ולשחרר את הנקודה הקוונטית מפני הזכוכית. היעלמות נקודה קוונטית מתרחשת במהירות וגורמת לירידה חדה במסלול העוצמה, מה שמספק אינדיקציה ברורה לזמן שבו מולקולת דנ"א נתונה נבקעת. קביעת זמני האירועים מושגת על ידי ניתוח מתמטי של מסלולי עוצמה, וניסוי טיפוסי מביא למאות אירועי מחשוף הניתנים לזיהוי. ניתן לאגד את התוצאות של ניסויים מרובים כדי לספק סטטיסטיקה נאותה שתאפשר הערכה של הפרמטרים, N ו- β, על ידי ריבועים לא ליניאריים או ניתוח סבירות מרבית.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td>חנות בקופסת ייבוש</td></tr><tr><td>5 דקות אפוקסי</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td>שימוש לאיטום המכשיר המיקרופלואידי</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Pharmco</td><td>329000ACS</td><td>שימוש לניקוי כיסויים</td></tr><tr><td>סוניקטור אמבטיה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>CPXH דגם 2800</td><td>מספר קטלוגי 15-337-410</td></tr><tr><td>, זכוכית, 100 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>שולחנית</tr><tr><td>ביוטין-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td><td>ל-Laysan Bio</td><td>BIO-SVA-5K</td><td>Succinimidyl valerate יש זמן מחצית חיים ארוך יותר מאשר succinimidyl קרבונט</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטיד ביוטינילאוטיד</td><td>טכנולוגיות DNA</td><td>משולבות מותאמות אישית - ראה פרוטוקול לשיקולי תכנון</td><td>בקש שינוי ביוטין 5' ו </td></tr> אלבומין סרום בקר לטיהור HPLC <tr><td>(BSA)</td><td>VWR</td><td>0903-5G</td><td>מכינים תמיסה של 10 מ"ג/מ"ל (aq) ומחממים ל-95 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>ב-Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns</td><td>Princeton Separations</td><td>CS-100 או CS-101</td><td>המשמשים לטיהור אוליגונוקלאוטידים תיאולטיים לאחר הפחתת צינורות הצנטריפוגה של קשר הדיסולפיד</td></tr><tr><td>1.5. mL</td><td></td><td></td><td></td></tr> Coverslips, <tr><td>מחזיקי</td><td></td><td></td><td></td>כיסוי</tr><tr><td>זכוכית</td><td></td><td></td><td></td>מרובעת בגודל 1 אינץ'</tr><tr><td>גלגל נקודת יהלום</td><td>Dremel</td><td>7134</td><td>שימוש לקידוח חורים בתא זרימת קוורץ טופר</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td>פורמט ללא שקילה, 7.7 מ"ג/בקבוקון</td></tr><tr><td>מעמד תחנת עבודה לכלי סיבובי</td><td>Dremel</td><td>220-01</td><td>מקל על קידוח קוורץ</td></tr><tr><td>EcoRV (REase המשמש להפקת נתונים לדוגמה)</td> <td>New England Biolabs</td><td>R0195T או R0195M</td><td>השתמש ב-100,000 יחידות/מ"ל מלאי כדי להימנע מהוספת עודף גליצרול בדוק REBASE עבור ספקים של REases</td></tr><tr><td>אחרים אתנול</td><td></td><td>CAS 64-17-5</td><td>מפוגל או 95% מקובלים, שימוש לניקוי כיסויים</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>BioUltra, נטול מים, לאחסן בקופסת ייבוש</td></tr><tr><td>Flea Micro Spinbar</td><td>Fisherbrand</td><td>14-513-65</td><td>גודל 3 מ"מ x 10 מ"מ להתאמה מתחת למתלה כיסוי</td></tr><tr><td>פלואורסצאין</td><td>Acros Organics</td><td>17324</td><td>שימוש לייצור חוצצים ניסיוניים</td></tr><tr><td>תנור הסעת כבידה</td><td>קלסר</td><td>9010-0131</td><td></td></tr><tr><td>כלי סיבובי כף יד</td><td>Dremel</td><td>8220</td><td>שימוש לקידוח חורים בטופר תא זרימת קוורץ</td></tr><tr><td>ImagEM X2 EM-CCD מצלמה</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-23B</td><td>קירור אוויר מתאים לניסוי זה, השתמש בתוכנת HCImage או דומה לשליטה</td></tr><tr><td>מרווח הדמיה, דו צדדי, צנצנת דביקה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, זכוכית עם מכסה בורג, (בקוטר של כ-50 מ"מ על גובה 50 מ"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP214-500</td><td>משתמשים לייצור מאגר ניסיוני עם</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td> <td>מגנזיום MATLAB</td><td>ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>פינצטה מתכתית</td><td>פישר ברנד</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>מתוקסי-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)</td><td>Laysan Bio</td><td>M-SVA-5K</td><td>שני ה-PEG צריכים להיות בעלי אותו אסטר NHS כך שקצב התגובה יהיה מיקרוצנטריפוגה עקבית</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מגנטי רב-מצבי</td><td>VWR</td><td>12621-022</td><td></td></tr><tr><td>N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)</td><td>Acros Organics</td><td>AC20818</td><td>CAS 103-47-9, משמש לייצור</td></tr><tr><td>שייקר מסלולי חיץ CHES ומחמם עבור צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Q Instruments</td><td>1808-0506</td><td>עם מתאם 1808-1061 לצינורות 24 x 2.0 מ"ל או 15 x 0.5 מ"ל</td></tr> צינורות <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE60 פוליאתילן (קוטר פנימי 0.76 מ"מ, קוטר חיצוני 1.22 מ"מ)</td><td>6258917 תוך-רפואי</td><td></td><td>22 גרם מחטים קהות מתאימות לגודל צינור זה</td></tr><tr><td>מי מלח פוספט חוצץ (PBS) 10x</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P7059</td><td>השתמש בעוצמה של 1x</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>VWR כימיקלים BDH</td><td>BDH9262</td><td>השתמש בתמיסה של 1 M לניקוי כיסויים</td></tr><tr><td>Qdot 655 ITK Amino (PEG) נקודות קוונטיות</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>קוורץ שקופיות, 1 אינץ' מרובע, 1 מ"מ</td><td>עובי מיקרוסקופ אלקטרונים יש</td> לקדוח חורים במדעים <td>72250-10</td><td>בפינות להכנסת צינורות כניסה ויציאה</td></tr><tr><td>פינצטה מפלסטיק מחוזק</td><td>Rubis</td><td>K35a</td><td>שימוש לטיפול בכיסויים ובניית מכשיר מיקרופלואידי.</td></tr><tr><td>יריעות דבק</td><td>SecureSeal Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td>חתוכות ליצירת מרווח למכשיר מיקרופלואידי,</td></tr><tr><td>משאבת מזרק חד ערוצית למיקרופלואידיקה</td><td>מערכות</td> <td>משאבות עידן חדשNE-1002X-US</td><td>מצויד במזרק של 50 מ"ל ומחט קהה של 22 גרם</td></tr><tr><td>התקני דיאליזה Slide-a-Lyzer MINI, 10 kDa MWCO, 0.1 מ"ל</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570 או 69572</td><td>המשמשים להחלפת חיץ במהלך צימוד נקודות קוונטיות ל-DNA</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0320</td><td>משמש ליצירת חיץ לתפקוד פני השטח; 100 מ"מ, pH 8</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>מקרון</td><td>7581-12</td><td>השתמש לייצור מאגרים ניסיוניים</td></tr><tr><td>תמיסה דו-בסיסית של נתרן פוספט (BioUltra, 0.5 מ' במים)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>94046</td><td>משמש לייצור 100 מ"מ מאגר נתרן פוספט</td></tr><tr><td>תמיסה מונו-בסיסית נתרן פוספט (BioUltra, 5M במים)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>74092</td><td>משמש להתאמת pH של 100 מ"מ מאגר נתרן פוספט</td></tr><tr><td>סטרפטווידין מ-Streptomyces avidinii</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4762</td><td>ממיסים ב-1 מ"ג/מ"ל ומאחסנים 25 מ"ל אליקוטים ב-20</td></tr>?<tr><td>Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A39268</td><td>פורמט ללא שקילה, מזרק 2 מ"ג/בקבוקון</td></tr> מצויד <tr><td>במשאבת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק מחט</td><td></td><td></td><td></td>קהה 21 גרם</tr><tr><td>אוליגונוקלאוטיד אוליגונוקלאוטיד</td><td>משולב</td><td>מותאם אישית - ראה פרוטוקול לשיקולי</td> <td>תכנוןבקש 5 'Thiol Modifier C6 S-S ומערכת הדמיה TIRF מטוהרת HPLC</td></tr><tr><td>עם תאורת לייזר 488 ננומטר</td><td></td> Tris -HCl מוצרי מחקר בינלאומיים T60050 <td>נבנו בהתאמה אישית</td>לשימוש לייצור מאגרים ניסיוניים בסיס Tris JT Baker 4101 להשתמש לייצור מאגרים ניסיוניים Tween-20 Sigma P7949 להשתמש כדי ליצור חסימה <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מאגר</td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td></td> מים <td></td> טהור במיוחד VWR 10153-842 <td></td></tr><tr><td>Wash-N-Dry Coverslip Rack</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70366-16</td><td>המשמש לפונקציונליזציה של פני השטח של כיסויים</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף dna בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

בדיקה חדשנית זו המבוססת על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת מאפשרת מדידה סימולטנית של אורך המחזור הקטליטי עבור מאות מולקולות אנדונוקלאז הגבלה אינדיבידואליות (REase) בניסוי אחד. בדיקה זו אינה דורשת תיוג חלבונים וניתן לבצע אותה בערוץ הדמיה יחיד. בנוסף, ניתן לאגד את התוצאות של ניסויים בודדים מרובים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב. ניתוח ההתפלגויות המתקבלות בזמן השהייה יכול לעזור להבהיר את מנגנון פיצול הדנ"א על ידי חשיפת נוכחותם של צעדים קינטיים שלא ניתן לצפות בהם ישירות. נתונים לדוגמה שנאספו באמצעות בדיקה זו עם REase שנחקר היטב, EcoRV - אנדונוקלאז הגבלה דימרי מסוג IIP המבקע את הרצף הפלינדרומי GAT↓ATC (כאשר ↓ הוא האתר החתוך) - תואמים מחקרים קודמים. תוצאות אלה מצביעות על כך שישנם לפחות שלושה שלבים במסלול לפיצול DNA שמתחיל על ידי החדרת מגנזיום לאחר ש- EcoRV קושר DNA בהיעדרו, עם קצב ממוצע של 0.17 s-1 לכל שלב.

תא הזרימה מחובר ישירות למטרת הגדלה של 60x צמצם מספרי גבוה במיקרוסקופ הפוך המצויד בתאורת לייזר להדמיית TIRF אובייקטיבית (איור 5A). לאחר החדרת מצע הדנ"א ושטיפת עודפי דנ"א ונקודות קוונטיות, יש בדרך כלל אלפי נקודות קוונטיות בודדות בשדה ראייה (איור 5B). נקודות קוונטיות אלה מחוברות ביציבות למשטח הזכוכית, והן אינן עוברות עמעום ניכר או הלבנה משמעותית לאורך סקאלת הזמן של הניסוי. עם זאת, אם מאגר המכיל גם מגנזיום וגם REase מתאים זורם דרך ערוץ הזרימה, בתום תקופת תצפית טיפוס...

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

בעזרת פרוטוקול זה, אנו יכולים לצפות ישירות בפיצול דנ"א ספציפי לאתר על ידי הגבלת אנדונוקלאזות ברמת המולקולה הבודדת. הגישה המרובבת שלנו מאפשרת לנו למדוד את הזמן שלוקח למאות REases בודדים להשלים את המחזור הקטליטי. ריבוב מאפשר לנו לייצר זמן שהייה מאוכלס היטב להתפלגויות מחשוף שאנו יכולים להתאים להתפלגות הסתברות גמא כדי לקבל תובנות על מנגנון פיצול הדנ"א.התחילו בהכנת צינורית טרייה לכל אוליגונוקלאוטיד מרחף ב-50 מיקרוליטר של האוליגונוקלאוטיד ו-50 מיקרוליטר של תמיסת DTT טרייה לכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה את כל הנפח של כל תערובת דגימה בעדינות על עמוד מוכן וצנטריפוגה ב 750G במשך שתי דקות. לאחר הצנטריפוגה, אחסנו דגימות שלא ישמשו באופן מיידי בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי למנוע חמצון של קבוצות התיול והיווצרות קשרים דיסולפידים.פיפטה אחת של 50 מיקרוליטר ממלאי הנקודות הקוונטיות לתוך מכשיר דיאליזה לכל מבנה שיש לבצע, תוך הקפדה לא לגעת בקרום עם קצה הפיפטה. נטרל כנגד נפח של חיץ CHES שהוא לפחות פי 1,000 מנפח הדגימה עם ערבוב ב-100 סל"ד למשך 15 דקות. בעזרת צינור, שלפו בזהירות את הנקודות הקוונטיות המרחפות ממכשיר הדיאליזה והעבירו אותן לצינור טרי המכיל נפח שווה של תמיסת Sulfo-SMCC טרייה, תוך פיפטציה מעלה ומטה כדי לערבב.דגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם טלטול ב -1, 000 סל"ד כדי לאפשר ל- Sulfo-SMCC להגיב עם האמינים הראשוניים על הנקודות הקוונטיות. לאחר מכן, השתמש בצינור כדי להעביר בזהירות כל דגימה למכשיר דיאליזה טרי. כדי להסיר עודף Sulfo-SMCC, dialyze כנגד נפח של חיץ CHES כי הוא לפחות 1, 000 פעמים נפח הכלול במכשיר דיאליזה עם ערבוב במשך 15 דקות.החליפו את החיץ פעמיים ובצעו דיאליזה עם חיץ CHES טרי שלוש פעמים בסך הכל, מה שמאפשר לדיאליזה להמשיך במשך 15 דקות לאחר כל החלפת חיץ. לאחר מכן חזור על הדיאליזה עם PBS. באמצעות פייטר, לשחזר בזהירות את התמיסה המכילה את הנקודות הקוונטיות ממכשיר הדיאליזה ולהעביר כל דגימה לתוך צינור טרי המכיל כמות שווה של אוליגונוקלאוטיד מורחב מדולל PBS.לדגור במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם רעד ב 1, 000 סל"ד. הוסף BSA לכל דגימה לקבלת ריכוז סופי של 0.5 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן השתמשו בפילטר כדי להעביר בזהירות כל דגימה למכשיר דיאליזה טרי ולבצע דיאליזה כנגד מאגר אחסון.לאחר דיאליזה, בזהירות לשחזר כל דגימה ומניחים אותו לתוך צינור טרי. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שלב דגימה של נקודה קוונטית המסומנת אוליגונוקלאוטידים עם עודף מולארי פי עשרה של אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה.מחממים את התערובת בגוש חום ל-75 מעלות צלזיוס ומחזיקים אותה בטמפרטורה זו למשך 5 דקות. לאחר מכן כבו את בלוק החום ואפשרו לתערובת להתקרר באיטיות. אחסנו את המבנה שהושלם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות כלי רב-תכליתי סיבובי ידני המצויד בסיבית גלגל נקודת יהלום מחודדת, קדח שני חורים בפינות מנוגדות של מגלשת הקוורץ כדי לשמש ככניסה ויציאה.הקפידו לאבטח את המגלשה במקומה, לשמן את החלק ולהחליק כל הזמן במים בזמן הקידוח. לאחר כל ניסוי, לשחזר את שקופית קוורץ מוכן על ידי השריית המכשיר בשימוש אצטון כדי להמיס את דבק אפוקסי. השליכו את שאר הרכיבים.שלב 25 מיקרוליטר של תמיסת סטרפטווידין עם 80 מיקרוליטר של PBS ו -20 מיקרוליטר של חיץ חוסם. מצפים מכסה שעבר טיפול ב-PEG בתערובת זו, ודגרו בסביבה לחה במשך 30 דקות. במהלך הדגירה של חלקת הכיסוי, הכינו את ספייסר ההדמיה ליצירת ערוץ זרימה.חתכו פיסה מרובעת בגודל 1 אינץ' של חומר ספייסר הדמיה, ולאחר מכן סמנו תעלה ברוחב 2 מילימטר המיושרת לקצות החורים שנקדחו בשקופית הקוורץ. חותכים את התעלה מחומר הספייסר בעזרת אזמל. נקו היטב את מגלשת הקוורץ עם אצטון כדי להסיר שאריות דבק מניסויים קודמים.מקלפים צד אחד של הגב מהספייסר של התמונה ומניחים אותו בזהירות על שקופית הקוורץ, תוך הקפדה שלא לכסות את חורי הכניסה והיציאה. יש לשטוף את המכסה במים ולייבש באוויר דחוס. הסירו את הצד השני של הגב מהספייסר ההדמיה ודחפו אותו בין מגלשת הקוורץ לבין הכיסוי המצופה סטרפטאבידין המתפקד באמצעות פינצטה מפלסטיק כדי ללחוץ על המכלול יחד ולהסיר בועות אוויר מהדבק.חתכו את קצה הצינור בזווית כדי להבטיח זרימה חופשית של התמיסה. לאחר מכן הכנס צינורות פוליאתילן באורך 30 ס"מ לכל חור בשקופית הקוורץ. החזק את הצינורות במקומם באמצעות מתלה צינורות, ולאחר מכן השתמש באפוקסי כדי לאטום את הצינורות במקומם ואת קצוות המכשיר שהורכב.לאחר הגדרת האפוקסי, הכנס את המחט הקהה על מזרק ריק לתוך צינור היציאה של המכשיר ושקע את קצה צינור הכניסה במיכל מלא במאגר החסימה. משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי למלא את המכשיר במאגר חוסם. לאחר מכן השאירו את המכשיר לדגור לפחות 30 דקות לפני השימוש.חבר את המכשיר המיקרופלואידי ללוח שלב המיקרוסקופ באמצעות סרט הדבקה. הבא את המטרה במגע עם החלק התחתון של המכשיר ומקם את המטרה כך ששדה הראייה יהיה בתוך התעלה המיקרופלואידית. לאחר חיבור צינור היציאה למשאבת המזרק, שטפו את התעלה המיקרופלואידית בחיץ חוסם טרי על ידי משיכת בוכנה של המזרק.בדקו שאין בועות כלואות בצינורות או בתעלה. לדלל 1 מיקרוליטר של מצע DNA מוכן לתוך 1 מיליליטר של חיץ חוסם. מניחים את צינור הכניסה לתוך מצע הדנ"א המדולל ומזרימים 800 מיקרוליטר של תמיסת המצע דרך התעלה בקצב של 200 מיקרוליטר לדקה.אפשרו לתמיסת הדנ"א לדגור בתעלה במשך 15 דקות לאחר הפסקת הזרימה. לאחר הדגירה, הזרימו לפחות 800 מיקרוליטר של חיץ חוסם דרך התעלה בקצב של 200 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף את הדנ"א הלא קשור מתוך התעלה. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ כך שהנקודות הקוונטיות הקשורות לפני השטח ייראו בבירור.שטפו את המכשיר המיקרופלואידי ב-800 מיקרוליטר של חיץ ניסיוני ללא מגנזיום בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לדקה. מוסיפים את ה-REase לאליקוט של חיץ ניסיוני ללא מגנזיום ומערבבים בעדינות על ידי פיפטטינג. זרימה של 800 מיקרוליטר של 400 יחידות למיליליטר של EcoRV דרך הערוץ בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לדקה.התחל את הניסוי על ידי הזרמת המאגר הניסיוני המכיל מגנזיום ופלואורסצאין בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לדקה. התחל ללכוד נתונים מיד לאחר הפעלת משאבת המזרק. עצור את איסוף הנתונים לאחר הזרמת 800 מיקרוליטר של חיץ.לאחר החדרת מצע הדנ"א לתא הזרימה ושטיפת עודפי דנ"א ונקודות קוונטיות, יש בדרך כלל אלפי נקודות קוונטיות בודדות בשדה הראייה. הם מחוברים ביציבות למשטח הזכוכית ואינם עוברים עמעום ניכר או הלבנה משמעותית לאורך כל הניסוי. כאשר ה-REase זורם בערוץ בהיעדר מגנזיום, לפחות 95% מהנקודות הקוונטיות שהיו קיימות בתחילת הניסוי עדיין ניתן לראות בסוף תקופת התצפית.עם זאת, כאשר המאגר המכיל מגנזיום מוזרם מיד לאחר REase, עד מחצית מהנקודות הקוונטיות נעלמות בסוף תקופת התצפית, בדומה למה שנצפה כאשר REase ומגנזיום מוזרמים דרך התעלה יחד. היעלמות נקודה קוונטית מתרחשת במהירות וגורמת לירידה חדה במסלול העוצמה, מה שמספק אינדיקציה ברורה לזמן שבו מולקולת דנ"א נתונה נבקעת. ניסוי זה בוצע עם סוג II P REase EcoRV.התאמת עקומת הריבועים הפחותים הלא ליניארית ואומדן פרמטר הסבירות המרבית שימשו לחילוץ הערכים של n ובטא מהנתונים. שתי שיטות הערכת הפרמטרים היו בהסכמה. בהתאמת הריבועים הפחות ליניאריים, n היה 3.52 ובטא היה 5.78 שניות.לפי הערכת הסבירות המרבית, n היה 3.41 ובטא היה 6.06 שניות. בדיקה זו יכולה לספק עדות לנוכחותם של שלבי ביניים לאורך מסלול המחשוף. ביצוע בדיקה זו בתנאי תגובה משתנים יכול לעזור לקבוע את טבעם של מתווכי תגובה שלא ניתן לצפות בהם ישירות.

single-molecule-dwell-time-analysis-restriction-endonuclease-mediated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה המבוסס על העברת בזמן אמת התבוננות במערכות ה-dna לנטישה של exchange התגובה מתווכת על-ידי Rad51 פותחו. באמצעות פרוטוקולים המובאת כאן, אנחנו מסוגלים לזהות את היווצרות התגובה intermediates, המרה שלהם לתוך מוצרים, במהלך ניתוח גם את קינטיקה אנזימטי של התגובה.

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

מוצג כאן הוא פרוטוקול לביצוע מולקולה בודדת Förster העברת אנרגיה ללמוד החלטה ג'ונסון. עירור שני הצבעים משמש לקביעת קבועי הדיסוציאציה. הזמן חד צבע לשגות smfret הוא לאחר מכן בזמן אמת מחשוף בחני להשיג את התפלגות זמן לשכון לפני הרזולוציה ג'ונסון.

מולקולה בודדת Förster שיטות העברת אנרגיה בזמן אמת על החלטה של צומת הולידיי-GEN1

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

מחקר זה מציג בדיקת FRET רציומטרית פשוטה וידידותית למשתמש לאיתור והערכה כמותית של פעילות DNase, ומדגים את יישומו בניתוח נוקלאז חלש.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

חקור מנגנוני חיתוך DNA על ידי אנדונוקלאזות הגבלה ברמה של מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופיית פלורסצנציה ורב-שידור. שיטה זו מאפשרת למדוד זמני שהייה ולהבין את המחזור הקטליטי של האנזימים.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

גלה סרטונים נוספים