Name: שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: חקור הדמיה בזמן אמת של אותות סידן וגלוטמט מערכתיים ב-Arabidopsis thaliana בתגובה לפציעה. שיטה זו חושפת את דינמיקת האותות המהירים והמרחקים הארוכים בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של האגודה היפנית לקידום המדע (17H05007 ו 18H05491) ל MT, הקרן הלאומית למדע (IOS1557899 ו MCB2016177) ומינהל האווירונאוטיקה והחלל הלאומי (NNX14AT25G ו 80NSSC19K0126) ל SG.

1. הכנת חומר צמחי
<ol><li>במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל, פני השטח מעקרים את הזרעים של הצמח Arabidopsis thaliana (הצטרפות קול-0) המבטאים GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR על ידי טלטול עם 20% (v /v) NaClO במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים. הערה: הקווים המהונדסים של Arabidopsis המבטא GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR תוארו בעבר6.</li>
	<li>במכסה המנוע סטרילי, לזרוע 13 משטח מעוקר זרעים על צלחת פטרי פלסטיק 10 ס"מ מרובע מלא 30 מ"ל סטרילי (autoclaved) Murashige ו Skoog (MS) בינוני [1x MS מלחים, 1% (w/v) סוכרוז, 0.01% (w/v) מיונוציטול, 0.05% (w/v) MES ו-0.5% (w/v) מסטיק גלן; pH 5.7 מותאם עם 1N KOH]. החלף את המכסה ולעטוף עם קלטת כירורגית.</li>
	<li>לאחר הדגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 ימים, למקם את הצלחות אופקית ב 22 מעלות צלזיוס בתא צמיחה תחת אור רציף (90-100 מיקרומול m-2 s-1) במשך כ 2 שבועות לפני השימוש. לאחר שבועיים, לספור את מספר העלים Arabidopsis מן הבכור לצעיר44 (איור 1). תגובות הפצע מעדיפות לעבור מהעלה הפגום (n) לעלים ממוספרים n ± 3 ו- n ± 56. הערה: בפרוטוקול זה, צלחת פטרי תיפתח להדמיית הפצע ואפקטי גלוטמט תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן, השלבים הבאים בניסוי זה צריכים להתבצע בתנאי חדר מבוקר טמפרטורה ולחות. הסיבה לכך היא כי Ca2 + אותות הם גם עוררו על ידי שינויים בתנאים סביבתיים אלה. ידוע גם כי האור הכחול, הנפלט מהמיקרוסקופ במהלך ההקלטה לצורך עירור הפלואורסצנטיות של חלבון הביוסנסור, עשוי לגרום לעלייה של ריכוז Ca2+ ציטוזולי45 ולכן יש להסתגל להקרנת האור הכחול במשך מספר דקות לפני תחילת הניסוי.</li>
</ol>2. הכנה כימית
<ol><li>המסת L-גלוטמט במדיום צמיחה נוזלי [1/2x MS מלחים, 1% (w / v) סוכרוז ו 0.05% (w / v) MES; pH 5.1 מותאם עם 1N KOH] כדי להפוך פתרון עבודה 100 מ"מ. הערה: יש להימנע משימוש במלחי גלוטמט כגון נתרן גלוטמט למניעת השפעות אפשריות הקשורות לקטיון על הדינמיקה של Ca2+ .</li>
</ol>3. הגדרת מיקרוסקופ וביצוע הדמיה בזמן אמת
<ol><li>הפעל את סטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממונע המצויד בעדשה אובייקטיבית 1x (NA = 0.156) ומצלמת sCMOS (איור 2)וקבע את תצורת הגדרות ההתקן להקרין עם אור עירור של 470/40 ננומטר ולרכוש אור פליטה העובר דרך מסנן 535/50 ננומטר. הערה: כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיש ל- GFP יכול לשמש לגילוי אותות GCaMP3 ו- iGluSnFR בזמן אמת, אך עדשה אובייקטיבית בהספק נמוך ומצלמה רגישה מאוד עם שבב SCMOS רחב מומלץ לרכוש אותות מהמפעל כולו. מטרת ההספק הנמוך מאפשרת הדמיה של תגובת מפעל ערבידופסיס שלם ושימוש במצלמה רגישה ביותר מאפשר רכישת נתונים מהירה הדרושה כדי ללכוד את מהלך הזמן המהיר של גל Ca2+ המופעל על ידי פצעים. עבור מיקרוסקופ הפלואורסצנטי המשמש במחקר זה, הערכים המרביים של שדה הראייה והרזולוציה הזמנית הם 3 ס"מ x 3 ס"מ ו- 30 מסגרות לשנייה (fps), בהתאמה.</li>
	<li>מוציאים את המכסה ומניחים את המנה מתחת לעדשה האובייקטיבית.</li>
	<li>בדוק את אות הפלואורסצנטיות מהצמח ולאחר מכן המתן כ-30 דקות בחושך עד שהצמחים יתאימו את עצמם לתנאים הסביבתיים החדשים. שלב הסתגלות זה נדרש מכיוון ששינויים בלחות מעוררים [Ca2+] העלאתציט בצמחים שעלולים להפריע לכל אירוע הקשור לפצע.</li>
	<li>התאם את המיקוד וההגדלה כדי לראות את הצמח כולו בשדה הראייה. בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בהגדלה של 0.63x.</li>
	<li>לפני שתתחיל בהדמיה בזמן אמת, הגדר את פרמטרי הרכישה כדי לזהות את אותות הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת הדמיה של מיקרוסקופ. ההגדרות עבור דימות בפרוטוקול הנוכחי הן: זמני חשיפה ומרווח מוגדרים ל- 1.8 שניות ו- 2 שניות (כלומר, 0.5 fps), בהתאמה. הגדר את זמן ההקלטה ל- 11 דקות.</li>
	<li>תמונה במשך 5 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להסתגל הצמח להקרין אור כחול מן המיקרוסקופ, ואז להתחיל להקליט על ידי לחיצה על הפעל עכשיו, או הפקודה המקבילה בתוכנת מיקרוסקופ בשימוש. כדי לקבוע את הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת, רשום לפחות 10 מסגרות (כלומר, לפחות 20 שניות בפרוטוקול הנוכחי) לפני יישום פציעה או גלוטמט (ראה סעיף 4).<ol>
<li>להדמיה בזמן אמת של שינויים באפו [Ca2+ ]ו-[Glu],חתכו את הפטיולה או את האזור האמצעי של עלה L1 במספריים(איור 3 ואיור 4).</li>
		<li>להדמיה בזמן אמת של שינוייםבציט [Ca2+ ]המופעלים על-ידי גלוטמט, חותכים את הקצה (כ-1 מ"מ מקצה) של עלה 1 על פני הווריד הראשי עם מספריים. לאחר תקופת החלמה של 20 דקות לפחות, יש למרוח 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט על פני השטח החתוכים של העלה (איור 5). הערה: חיתוך מראש זה היה הכרחי כדי לאפשר גישה גלוטמט apoplast העלה על מנת לעורר תגובות. בנוסף, החלת טיפת מים מזוקקים על פני השטח החתוכים של עלה L1 נמצאה קריטית כדי למנוע מהדגימות להתייבש במהלך ההתאוששות לפני החלת גלוטמט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר סיום ההקלטה של 11 דקות, שמור את הנתונים.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן, הגדירו אזור עניין (ROI) במקום שבו יש לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות (איור 6 ואיור 7). לחישוב המהירות של גל Ca2+ , הגדר 2 החזרי ROIs (ROI1 ו- ROI2) לניתוח. בתוכנת ההדמיה, לחץ על מדידת זמן | הגדרת | מעגל , עיגול. למדוד את המרחק בין ROI1 ו ROI2 על ידי לחיצה על ביאורים ומדידה | | אורך קו פשוט (איור 6).</li>
	<li>מדוד את ערכי הפלואורסצנטיות הגולמיים (F) בכל החזר על ההשקעה לאורך זמן על-ידי לחיצה על מדידה. יצא נתונים גולמיים לתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להמיר את אות הפלואורסצנטי למספרים בכל נקודת זמן על-ידי לחיצה על הכל ל- Excel | יצא.</li>
	<li>קבע את ערך הפלואורסצנטיות הבסיסי, המוגדר כ- F0, על-ידי חישוב הממוצע של F מעל 10 המסגרות הראשונות (כלומר, לפני הטיפול) בנתונים המוקלטים.</li>
	<li>נרמל את נתוני F (על-ידי חישוב ΔF/F) באמצעות המשוואה ΔF/F = (F-F0)/F0, כאשר ΔF הוא השינוי תלוי הזמן בפלואורסצנטיות.</li>
	<li>עבור ניתוח גל מהירות גל Ca2+ , הגדר נקודת עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש כמייצג זיהוי של עלייה של Ca2+ בכל החזר השקעה (t1 ו- t2) באמצעות הקריטריון של עלייה ל- 2× סטיית התקן (2x SD) המחושבת מנתוני F0 באמצעות תוכנה סטטיסטית. 95% מנתוניה-F 0 נופלים בטווח של 2x SD מהממוצע, מה שמצביע על כך שעליית האות מעל רמה זו במקרה היא ≤5%. חשב את הפרש הזמן של עליית Ca2+ בין החזר על ההשקעה ל- ROI2 [t2- t1 השהיית זמן (Δt)]ומדוד את המרחק בין החזר על ההשקעה ל- ROI2 ולאחר מכן קבע את המהירות של כל גל Ca2+ .</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

איתות מערכתי חשוב לצמחים להגיב לגירויים סביבתיים חיצוניים מקומיים ולאחר מכן לשמור על הומאוסטזיס שלהם ברמת צמח שלמה. למרות שהם אינם מצוידים במערכת עצבים מתקדמת כמו בעלי חיים, הם משתמשים בתקשורת מהירה הן בתוך ובין איברים המבוססים על גורמים כגון אותות חשמליים ניידים (ואולי הידראוליים) וגלים מתפשטים של ROS ו- Ca2+ 46,47. הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת של פעילות מערכת איתות זו באמצעות ניטור הדינמיקה של Ca2+ וגלוטמט אפופלסטי ...

צמחים אינם יכולים לברוח מלחצים ביוטיים, למשל, חרקים הניזונים מהם, ולכן הם פיתחו חישת מתח מתוחכמת ומערכות העברת אותות כדי לזהות ואז להגן על עצמם מפני אתגרים כגון אוכלי עשב1. עם פציעה או התקפת אוכלי עשב, צמחים ליזום תגובות הגנה מהירה כולל הצטברות של חומצה ג'אסמונית phytohormone (JA) לא רק באתר הפצוע, אלא גם באיברים דיסטליים ניזוק2. JA זה אז הן מפעילה תגובות הגנה ברקמות שנפגעו ישירות וגורם מראש הגנות בחלקים ניזוקו של הצמח. ב Arabidopsis, הצטברות של JA הנגרמת על ידי פציעה זוהתה עלים דיסטליים, שלמים בתוך דקות ספורות של נזק במקומות אחרים במפעל מציע כי אות מהיר למרחקים ארוכים מועבר מן העלה הפצוע3. מספר מועמדים, כגון Ca2 +, מינים חמצן תגובתי (ROS), ואותות חשמליים, הוצעו לשמש אותם פצע למרחקים ארוכים אלה בצמחים4,5.
Ca2+ הוא אחד האלמנטים המגוונים ביותר בכל מקום שליח שני באורגניזמים אוקריוטיים. בצמחים, לעיסת זחל ופציעה מכנית גורמים לעלייה דרסטית בריכוז ציטוזולי Ca2+ ([Ca2+]ציט)הן בעל הפצוע והן בעלים מרוחקים לא מבוססים6,7. אות Ca2+ מערכתי זה מתקבל על ידי חלבונים תאיים Ca2+חישה, אשר מובילים להפעלת מסלולי איתות הגנה במורד הזרם, כולל JA biosynthesis8,9. למרות דיווחים רבים כאלה התומכים בחשיבות של Ca2 + אותות בתגובות פצע הצמח, מידע על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca2 + אותות הנגרמים על ידי פציעה מוגבל.
הדמיה בזמן אמת באמצעות מחווני Ca2+ מקודדים גנטית היא כלי רב עוצמה לניטור וכימות הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של אותות Ca2+ . עד כה פותחו גרסאות של חיישנים כאלה המאפשרות הדמיה של אותות Ca2+ ברמה של תא יחיד, לרקמות, איברים ואפילו צמחים שלמים10. הביוסנסור הראשון המקודד גנטית עבור Ca2+ המשמש בצמחים היה אקוורין החלבון הביולומינסנטי המופק ממדוזה Aequorea victoria11. למרות חלבון chemiluminescent זה שימש כדי לזהות Ca2 + שינויים בתגובה לחצים שונים בצמחים12,13,14,15,16,17,18, זה לא מתאים היטב עבור הדמיה בזמן אמת בשל אות זוהר נמוך מאוד שהיא מייצרת. Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוסס Ca2 + אינדיקטורים, כגון הגמלים הצהובים, שימשו גם בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה של מגוון של Ca2 + אירועי איתות במפעלים19,20,21,22,23,24. חיישנים אלה תואמים לגישות הדמיה ובדרך כלל מורכבים מ- Ca2 + חלבון מחייב calmodulin (CaM) ופפטיד מחייב CaM (M13) מתוך קינאז שרשרת אור מיוסין, כל התמזגו בין שני חלבוני פלואורופור, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וגרסה חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)10. Ca2+ מחייב CaM מקדם את האינטראקציה בין CaM ו M13 המוביל לשינוי קונפורמציה של החיישן. שינוי זה מקדם העברת אנרגיה בין CFP ו- YFP, אשר מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של YFP תוך הפחתת פליטת הפלואורסצנטיות מן CFP. ניטור מעבר זה מ- CFP לפלואורסצנטיות YFP מספק מדד לעלייה ברמת Ca2+ . בנוסף לחיישני FRET אלה, חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP)מבוסס Ca2+ biosensors, כגון GCaMP ו- R-GECO, תואמים גם הם לגישות הדמיה צמחית ומשמשים באופן נרחב לחקר [Ca2+] שינוייםבציט בשל הרגישות הגבוהה שלהם וקלות השימוש25,26,27,28,29,30. GCaMPs מכילים GFP יחיד שעבר מוטציה מעגלית (cp), שוב התמזגו עם CaM ופפטיד M13. האינטראקציה התלויה ב- Ca2+בין CaM ל- M13 גורמת לשינוי קונפורמי בחיישן המקדם שינוי במצב הפרוטונציה של cpGFP, ומשפר את אות הפלואורסצנטי שלו. לכן, כמו Ca2 + רמות עלייה, אות cpGFP עולה.
כדי לחקור את הדינמיקה של Ca2 + אותות שנוצרו בתגובה לפצעים מכניים או האכלת אוכלי עשב, השתמשנו בצמחי תלתנא ערבידופסיס מהונדסים המבטאים גרסה GCaMP, GCaMP3, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב6. גישה זו הצליחה לדמיין העברה מהירה של אות Ca2+ למרחקים ארוכים מאתר הפצע על עלה לצמח כולו. לכן, עלייה [Ca2+]ציט זוהה מיד באתר הפצע אבל זה Ca2 + אות הופץ אז לעלים השכנים דרך כלי הדם בתוך כמה דקות של פציעה. יתר על כן, מצאנו כי העברת אות הפצע המערכתי המהיר הזה מבוטלת בצמחי Arabidopsis עם מוטציות בשני גנים דמויי קולטן גלוטמט, קולטן גלוטמט כמו (GLR), GLR3.3, ו GLR3.66. GLRs מופיעים לתפקד כמו חומצת אמינו מגודר Ca2 + ערוצי מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים, כולל תגובת פצע3, צמיחת צינור אבקה31, פיתוח שורש32, תגובה קרה33, וחסינות מולדת34. למרות פונקציה פיזיולוגית רחבה ומובנה זו של GLRs, מידע על המאפיינים הפונקציונליים שלהם, כגון הספציפיות שלהם ליגנד, סלקטיביות היונים, לוקליזציה תת תאית, מוגבלים35. עם זאת, מחקרים אחרונים דיווחו כי GLR3.3 ו GLR3.6 הם מקומיים פלום ו xylem, בהתאמה. ל- GLRs של צמחים יש קווי דמיון לקולטני גלוטמט יונוטרופיים (iGluRs)36 ביונקים, המופעלים על ידי חומצות אמינו, כגון גלוטמט, גליצין ו- D-serine במערכת העצבים של היונקים37. אכן, הוכחנו כי היישום של גלוטמט 100 מ"מ, אבל לא חומצות אמינו אחרות, באתר הפצע גורם מהיר, למרחקים ארוכים Ca2 + אות Arabidopsis, המציין כי גלוטמט חוץ תאיים סביר פועל כאות פצע בצמחים6. תגובה זו מבוטלת glr3.3/glr3.6 מוטנט מציע כי גלוטמט עשוי לפעול דרך אחד או שניהם של ערוצים אלה דמויי קולטן ואכן, AtGLR3.6 הוכח לאחרונה להיות מגודר על ידי רמות אלה של גלוטמט38.
בצמחים, בנוסף לתפקידו כחומצת אמינו מבנית, גלוטמט הוצע גם כרגולטור התפתחותי מרכזי39; עם זאת, הדינמיקה המרחבית והטמפורלית שלו מובנת היטב. בדיוק כמו Ca2 +, מספר אינדיקטורים מקודדים גנטית גלוטמט פותחו כדי לפקח על הדינמיקה של חומצת אמינו זו בתאיםחיים 40,41. iGluSnFR הוא ביו-סנסור גלוטמט יחיד מבוסס GFP המורכב מ- cpGFP וחלבון מחייב גלוטמט (GltI) מ Escherichia coli42,43. השינוי הקונפורמי של iGluSnFR, המושרה על ידי גלוטמט מחייב GltI, תוצאות פליטת פלואורסצנטיות GFP משופרת. כדי לחקור אם גלוטמט חוץ-תאי פועל כמולקולה איתות בתגובת פצע הצמח, חיברנו את רצף iGluSnFR עם רצף הפרשת פפטיד אות chitinase בסיסי (CHIB-iGluSnFR) כדי להתאים את biosensor זה בחלל האפופלסטיק6. גישה זו אפשרה הדמיה של כל שינוי בריכוז הגלוטמט האפופלוסי ([Glu]apo) באמצעות צמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חיישן זה. גילינו עליות מהירות באות iGluSnFR באתר הפציעה. נתונים אלה תומכים ברעיון כי גלוטמט דולף מתוך התאים הפגועים / רקמות כדי apoplast על הפציעה ופועל כאות נזק הפעלת GLRs ומוביל למרחקים ארוכים Ca2 + אות בצמחים6.
כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת באמצעות biosensors מקודדים גנטית כדי לפקח ולנתח את הדינמיקה של Ca2+ למרחקים ארוכים אותות גלוטמט חוץ תאיים בתגובה לפציעה6. הזמינות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה וצמחים מהונדסים המבטאים ביו-סנסורים מקודדים גנטית מספקת גישה רבת עוצמה אך מיושמת בקלות לזיהוי אותות למרחקים ארוכים המועברים במהירות, כגון גלי Ca2+ .

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis expression GCaMP3</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis expression CHIB-iGluSnFR</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamate</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>מומס במצע גידול נוזלי [1/2x מלחי MS, 1% (w/v) סוכרוז ו-0.05% (w/v) MES; pH 5.1 מותאם עם 1N KOH].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) בינוני</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>הרכב: 1x מלחי MS, 1% (w/v) סוכרוז, 0.01% (w/v) מיואינוזיטול, 0.05% (w/v) MES ו-0.5% (w/v) גומי גלאן; pH 5.7 מותאם עם 1N KOH.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ25 סטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR ניתוח</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x עדשה אובייקטיבית (P2-SHR PLAN APO</td><td>)</td>מצלמת ניקון <td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מפלסטיק מרובעת</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב arabidopsis

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

צמחים מגיבים ללחצים מכניים כגון פצעים ואוכלי עשב על ידי גרימת תגובות הגנה הן בחלקים הפגועים והן בחלקים הלא פגומים. עם פציעת עלה, מתרחשת עלייה בריכוז יון הסידן הציטוזולי (Ca2+ אות) באתר הפצע. אות זה מועבר במהירות לעלים לא פגומים, שם מופעלות תגובות ההגנה. המחקר האחרון שלנו גילה כי גלוטמט דולף מהתאים הפצועים של העלה לתוך apoplast סביבם משמש אות פצע. גלוטמט זה מפעיל ערוצים חדירים דמויי קולטן גלוטמט Ca2+ , מה שמוביל להפצת אותות Ca2+ למרחקים ארוכים ברחבי הצמח. המאפיינים המרחביים והטמפורליים של אירועים אלה ניתן ללכוד עם הדמיה בזמן אמת של צמחים חיים המבטאים biosensors פלואורסצנטי מקודד גנטית. כאן אנו מציגים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת כדי לנטר את הדינמיקה של אותות Ca2+ ושינויים בגלוטמט אפופלסטי המתרחשים בתגובה לפציעה. גישה זו משתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ובצמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המבוסס על Ca2+ וביו-סנסורים גלוטמטים. בנוסף, אנו מציגים מתודולוגיה כדי לעורר בקלות פצע-induced, גלוטמט מופעלות מהירות למרחקים ארוכים Ca2 + התפשטות אות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים על לחצים צמחיים אחרים כדי לעזור לחקור כיצד איתות מערכתי צמח עשוי להיות מעורב ברשתות האיתות והתגובה שלהם.

הפצת אותות של [Ca2+]ct ו- [Glu]apo בתגובה לפציעה מוצגת באיור 3, איור 4, סרט S1וסרט S2. חיתוך פטיולה של העלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 (ב 0 s) הוביל לעלייה משמעותית [Ca2+]ציט כי היה במהירות המושרה באופן מקומי דרך כלי הדם (ב 40 s)(איור 3 ו סרט S1). לאחר מכן, האות הופץ במהירות לעלים שכנים (דף 3 ו-6) ת...

איתות סידן מערכתי המופעל על ידי גלוטמט חוץ-תאי הוא קריטי לגיוס תגובות הגנת הצמח לפצעים מכניים ולתקפת אוכלי עשב בצמחים. מאמר זה מתאר שיטה לדמיין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של שני גורמים אלה באמצעות צמחי תאליאנה ערבידופסיס המבטאים ביוסנסורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן וגלוטמט.

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה בזמן אמת של פעילות מערכת האיתות המערכתית של הצמח באמצעות ניטור הדינמיקה של הסידן והגלוטמט האפופלסטי בתגובה לפציעה. שיטת הדמיה זו בזמן אמת מספקת כלי חזק להבנת הדינמיקה של האותות המהירים והינעירוניים בצמחים, המשלבים רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה וקלות שימוש. פרוטוקול זה מציע את הפוטנציאל לספק תובנה חדשה על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של המערכת סידן איתות הן תגובות מתח ביוטי ו abiotic במינים אחרים של צמחים.הדגמת ההליך תהיה טאקויה אומורה, פוסט דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל על ידי הפעלת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי ממונע, מצויד בעדשה אובייקטיבית פי 1 ומצלמת sCMOS. קבע את תצורת הגדרות ההתקן כך שיוקרנו עם אור עירור שבמרכזו 470 ננומטר, שנבחר באמצעות מסנן המשדר אור בין 450 ל- 490 ננומטר.להשיג אור פליטה באמצעות מסנן המשדר בין 510 ל 560 ננומטר. מוציאים את המכסה מהתבשיל המכיל את הצמח ומניחים אותו מתחת לעדשה האובייקטיבית. בדוק את אות הפלואורסצנט מהצמח.לאחר מכן המתינו כ-30 דקות בחושך עד שהצמחים יתאימו את עצמם לתנאים הסביבתיים החדשים. התאם את המיקוד וההגדלה כדי לראות את הצמח כולו בשדה הראייה. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הרכישה כדי לזהות את אותות הפלואורסצנט באמצעות תוכנת ההדמיה של המיקרוסקופים.הגדר את זמן ההקלטה ל- 11 דקות. תמונה במשך חמש דקות לפני תחילת הניסוי כדי להסתגל הצמח להקרין אור כחול מן המיקרוסקופ, ואז להתחיל להקליט. כדי לקבוע את רשומת הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת לפחות 10 מסגרות לפני יישום פציעה או גלוטמט.להדמיה בזמן אמת של יון סידן ציטוזולי המושרה על ידי פצע ושינויי ריכוז גלוטמט אפופלסטיים, חותכים את הפטיולה או את האזור האמצעי של עלה L1 עם מספריים. להדמיה בזמן אמת של גלוטמט עוררה שינויים בסידן ציטוזולי, חותכים כמילימטר אחד מקצה העלה L1 על פני הווריד הראשי עם מספריים. לאחר 20 דקות לפחות יש למרוח 10 מיקרוליטרים של 100 גלוטמט מילימולארי על פני השטח החתוכים של העלה.לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן, הגדר אזור מעניין במקום שבו יש לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות. הגדר שני ROIs לחישוב המהירות של גל הסידן. בתוכנת ההדמיה לחץ על מדידת זמן, הגדרה ועיגול.למדוד את המרחק בין שני האזורים על ידי לחיצה על ביאורים ומדידה, אורך וקו פשוט. למדוד את ערכי פלורסנט גלם בכל החזר על ההשקעה לאורך זמן על ידי לחיצה על מידה, ולאחר מכן לייצא את הנתונים הגולמיים לתוכנת גיליון אלקטרוני, כדי להמיר את האות פלואורסצנטי למספרים בכל נקודת זמן. קבע את ערך הפלואורסצנטיות הבסיסית, הנוי אלוהי כ- F אפס, על-ידי חישוב ה- F הממוצע ב- 10 המסגרות הראשונות בנתונים המוקלטים ולאחר מכן נרמל את נתוני F כמתואר בכתב היד של הטקסט.לניתוח גל מהירות הסידן, הגדירו נקודת עלייה משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש כמייצגים זיהוי של עלייה בסידן בכל החזר השקעה. לחשב את הפרש הזמן בהגדלת הסידן בין שני ROIs ואת המרחק ביניהם כדי לקבוע את המהירות של כל גל סידן. התפשטות של שינוי מופעל פצע בריכוזים של יון סידן ציטוזולי גלוטמט אפופלסטי מוצג כאן.חיתוך פטיולה של עלה בצמחים המבטאים GCaMP-3 הוביל לעלייה משמעותית בסידן. זה היה המושרה באופן מקומי ולאחר מכן התפשט ברחבי כלי הדם. האות הופץ במהירות לעלים שכנים תוך דקות ספורות.עם חיתוך עלה וצמחים המבטאים צ'יטינז בסיסי אני מדביק רחרחן, עלייה מהירה גלוטמט אפופלסטי נצפתה סביב האזור לחתוך. בתוך כמה דקות, האות גם הופץ דרך כלי הדם. להדמיה בזמן אמת של התפשטות אות סידן המופעלת על ידי יישום של גלוטמט, קצה של עלה בצמחים המבטאים CCaMP-3 נחתך.זה גרם לעלייה מקומית בריכוז יון הסידן הציטוזולי, אבל האות נעלם תוך מספר דקות. לאחר כ -10 דקות, גלוטמט הוחל על פני השטח החתוכים, מה שגרם לעלייה מקומית מהירה בריכוז הסידן הציטוזולי ולאחר מכן להפצת אות זה לעלים דיסטליים. כדי למדוד את השינויים בתוך ריכוז סידן מוצק המושרה על ידי פציעה בעלה המערכתי, שינוי מסלול הזמן של עוצמת האות GCaMP-3 נמדד בשני אזורי עניין.כמו כן נמדדו שינויים בריכוז הגלוטמט האפופלסטי בתגובה לנזק מכני. חתימת הגלוטמט הגיעה לשיא אחד כ-100 שניות לאחר הפציעה. ניסוי זה צריך להתבצע בתנאים מבוקרים טמפרטורה ולחות כי הם גבוהים על ידי שינויים בתנאים סביבתיים אלה.פרוטוקול זה מציע פוטנציאל לספק תובנות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס איתות למרחקים ארוכים באמצעות מוטנטים כי האלמנטים הפגומים והפוטטיביים של מערכת האיתות במעבדה.

wide-field-real-time-imaging-local-systemic-wound-signals

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק...

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

פרוטוקול זה מתאר תהליך לאיסוף מהיר של תמונות של שתילי ארבידופסיס להגיב לגירוי הכבידה באמצעות סורקים שטוחים, זמינים מסחרי. השיטה מאפשרת לכידה של תמונות ברזולוציה גבוהה נוחות לניתוח אלגוריתמים במורד הזרם זול, בנפח גבוה.

שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לניתוח אותות סידן בצמחים שנוצר על ידי האכלה חרקים hemipteran, כגון כנימות. תודרנית לבנה טרנספורמציה עם החיישן סידן GFP GCaMP3 מאפשרים בזמן אמת אין ויוו ההדמיה של סידן דינמיקה עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

חקור הדמיה בזמן אמת של אותות סידן וגלוטמט מערכתיים ב-Arabidopsis thaliana בתגובה לפציעה. שיטה זו חושפת את דינמיקת האותות המהירים והמרחקים הארוכים בצמחים.

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

גלה סרטונים נוספים