אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

פרוטוקול זה תומך באפיון תפקידם של גני יתושים המעורבים במגוון מסלולים פיזיולוגיים, כולל, למשל, עמידות בפני חרקים והתפתחות טפיל מלריה. השיטה מניעה הכנסת טרנסג'ן למקומות גנומיים בודדים מאופיינים מראש ולכן מאפשרת להשוות ישירות פנוטיפים הנובעים מטרנסג'נים חלופיים ובכך נמנעת ביעילות מבעיית אפקט המיקום. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מיני חרקים בעלי חשיבות בריאותית וחקלאית ציבורית ויישומיה משתרעים באופן נרחב מחיידקים לתאי יונקים.

התחילו בתכנון פלסמידים תורמים של ATTB הנושאים את סמן הפלורסצנטי הדומיננטי, אתרי רקומבינציה של ATTB ומטען הטרנסג'ן הרצוי. השתמש באתר attB יחיד לשילוב של הפלסמיד כולו הנושא את הקלטת המהונדסת או שני אתרי attB הפוכים להחלפת קלטות. טיהור פלסמידים של תורמים ועוזרים באמצעות ערכת טיהור נטולת אנדוטוקסין.

שלבו את הפלסמיד התורם המתויג ATTB הנושא את הטרנסג'ן של עניין ואת פלסמיד העוזר הנושא את האינטגרה כדי לקבל תערובת עם ריכוז סופי של 350 ננוגרם לכל מיקרוליטר של פלסמיד התורם ו 150 ננוגרם לכל מיקרוליטר של פלסמיד עוזר. לזרז את ה- DNA על ידי הוספת 0.1 נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן ו 2.5 כרכים של קר כקרח 100% אתנול, אז מערבולת. משקעים לבנים צריכים להיות גלויים מיד.

לשטוף את הכדור ולנצל אותו מחדש במאגר הזרקה כדי להגיע לריכוז סופי כולל של 500 ננוגרם לכל מיקרוליטר. לאחר מכן להכין aliquots של 10-15 microliters כל אחד ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. דם מזין יתושים בני ארבעה עד שבעה ימים מקו העגינה הרצוי ומקביליהם הפראיים 72 שעות לפני הזרקת המיקרו.

בצע Anopheles gambiae עובר זריקות מיקרו ב 25 מילימולרי נתרן כלורי על ידי מיקוד הקוטב האחורי של העובר בזווית של 45 מעלות. בצע Anopheles stephensi עובר זריקות מיקרו בשמן halocarbon על ידי מיקוד הקוטב האחורי בזווית של 30 מעלות. מיד לאחר ההזרקה, מעבירים את הביצים לצלחת פטרי מלאה במים מזוקקים סטריליים ומחזירים אותן לתנאי החרקים.

עם הבקיעה, מעבירים זחלי G0 למגש עם מים מזוקקים מלוחים מדי יום ומאחור לגלמים. מיין ג'י-0 גולם לפי מין תחת סטריאוסקופ. אפשר לזכרים להופיע בכלובים נפרדים בקבוצות של שלושה עד חמישה ולהוסיף עודף של פי עשרה של נקבות מסוג בר תואמות גיל.

אפשר לנקבות להופיע בכלובים נפרדים בקבוצות של 10 עד 15 ולהוסיף מספר שווה של זכרים מסוג בר תואמי גיל. אפשר למבוגרים להזדווג במשך ארבעה עד חמישה ימים ולספק לנקבות ארוחת דם. לאסוף את הביצים ואת האחורי המתעוררים הדור הבא G1s.

לאסוף G1, L3, ו L4 זחלים בצלחת פטרי מרופד בנייר מסנן רטוב או על שקופית מיקרוסקופ ולהקרין אותם באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי לנוכחות הסמן שהוצג עם המטען מתויג attB. עבור עיצובי attB בודדים, מסך לנוכחות של הסמן החדש והקיים מראש. עבור עיצובי attB כפולים להחלפת קלטות, מסך לנוכחות הסמן החדש ואובדן הסמן הקיים.

מיין את גולם G1 השתנה על ידי מין ולחצות אותם בהמוניהם עם בני המין השני מותאם גיל אנשים פראיים תואמים. אפשר למבוגרים להזדווג במשך ארבעה עד חמישה ימים ולספק ארוחת דם. לניסויי אינטגרציה בודדים, אספו ביצים ישירות מהצלב ההמוני.

לניסויי החלפת קלטות, לאסוף ביצים מנקבות בודדות ולשמור על צאצאים נפרדים עד שההערכה המולקולרית תושלם בשל נוכחות פוטנציאלית של שתי כיווני קלטות חלופיים. מסננים את צאצאי G2 לנוכחות הסמן הפלואורסצנטי ומניחים בצד תת-קבוצה של אנשים חיוביים G2 לניתוח מולקולרי. תרים את השאר לבגרות.

בצע אימות מולקולרי של אתרי ההכנסה עם PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאינטגרציה יחידה, ודא כי אתר הכניסה החזוי נושא את מבנה העגינה המקורי, בתוספת כל הרצף של פלסמיד התורם בין שני האתרים ההיברידיים attL ו- attR. עבור חילופי קלטות, ודא כי אתר ההוספה החזוי זהה לזה של קו העגינה שבו אתרי attL היברידיים הפוכים מחליפים את אתרי ה- ATTP ההפוכים המקוריים ותבנית החליפין מחליפה את הקלטת הקיימת במקור ביניהם.

הפרוטוקול שימש ליצירת קו מהונדס אנופלס יציב בתוך כ -10 שבועות. אימות פנוטיפי של טרנספורמציה בוצע על ידי הקרנה עבור סמנים פלואורסצנטיים מוסדר על ידי מקדם 3xP3 מוצגים כאן. קו חדש של אנופלס סטיבנסי הושג על ידי החדרת קלטת מסומנת אדומה DS לקו עגינה המסומן ב- CFP אשר הביא לצאצאי G1 המבטאים את שני הסמנים כפי שצוין על ידי פלואורסצנטיות אדומה וכחולה בעיניים.

עיצובים של החלפת קלטות גורמים להחלפת הסמן שהוכנס במקור לקו העגינה עם זה של הפלסמיד התורם. חילופי סמן זה הודגם בקו עגינה אנופלס גמביאה שבו סמן CFP אבד ואת סמן YFP שנרכש וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות עין צהובה חוט עצב. מדי פעם, RMCE יכול לגרום לאירוע אינטגרציה יחיד במקום חילופי של הקלטת הטרנסגנית הרצויה שבה זחל מסומן הן עם CFP המקורי והן סמני YFP החדשים.

בעת הקרנה לנוכחות של סמן פלואורסצנטי, חשוב להבחין האות שלה מן פלואורסצנטיות אוטומטית רקע אפשרית. הגדלת ההגדלה והתמקדות ברקמות ובאיברים שבהם פלואורסצנטיות צפויה להיות מונעת על ידי האמרגן יש צורך לזהות אנשים חיוביים CFP אמיתי. שנאים בודדים נבדקו גם מולקולרית באמצעות PCR כדי לאשר את אתר הכניסה הצפוי.

אימות PCR אצל אנשים מקו חילופי אנופלס גמביה מוצג כאן. אפילו טכניקת הזרקת מיקרו מתאימה, תכנון מדויק והכנה של פלסמידים התורם והעוזר, כמו גם בעקבות תוכנית גידול יתושים המתאימה הם המפתח להשגת אנשים מהונדסים. הליך זה יכול לשמש כדי להוסיף אלמנטים הגורמים ביטוי יתר של גנים או השתקה, למשל, מערכת GAL4 / UAS, כמו גם אלמנטים כונן גנים ומולקולות אנטי פתוגן לשליטה גנטית יתושים.