בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים בתחום הקרניופאציאלי להשוות כמותית תכונות תנועה קולקטיבית בתאי שליטה ותאים מוטנטיים כאמצעי להבנת שיפוץ מזנכימלי במהלך העלאת מדף פלטאלית. השימוש בתאים מזנכימליים הפליאטוניים של עכבר ראשוניים ובהדמיה של זמן-לשגות מספקים שיטת פרוקסי נגישה להערכת דינמיקת העלאת מדף פלטלית. כדי לקצור קליפות פלטאליות מעובר עכבר, השתמש בכף מחוררת מעוקרת כדי למקם יום עוברי 13.5 עובר לתוך צלחת סטרילית 10 ס"מ מלא מדיום תרבות MEPM סטרילי תחת מיקרוסקופ סטריאו.

לאחר עריפת ראש, הכנס קצה אחד של מלקחיים מס '5 מעוקרים לתוך הפה ממש בתוך הלחי ולדחוף את קצה המלקחיים עד שהוא יוצא מהחלק האחורי של הגולגולת. כוון את המלקחיים כך שהזרוע השנייה תרחף ממש מעל תעלת האוזן לפני שצבטים את המלקחיים שנסגרו כדי לחתוך את הרקמה. חזור על החתך בצד השני של הראש, המשך הליך לחתוך קמצוץ עד הלסת התחתונה, הלשון, ואת החלק הנחות של הגולגולת הוסרו, חושף את המדפים palatal.

עם הראש מונח על צדו, למקם את קצות של זוג מספריים קטנים, סטריליים, נירוסטה מול ומאחורי הגולגולת רק על גובה העיניים של העובר לחתוך רק מעל העיניים כדי להסיר את הגולגולת של הגולגולת, יצירת משטח שטוח. לאחר מכן, למקם את הראש הפוך עם ההיבט העליון נח שטוח על החלק התחתון של המנה ולאתר את המדפים palatal, אשר צריך להיות גלוי כמו שני גשרים מוגבהים משני צדי החריץ המרכזי בחלק האחורי של הראש. כדי לאבטח את הראש לצלחת, הכנס קצה אחד של מלקחיים עדינים דרך הרקמה ליד אזור האף של הקדמי הראש למדפי palatal, והשני דרך הבסיס של הגולגולת אחורי אל המדפים palatal.

הכנס את שתי הנקודות של זוג שני של מלקחיים חדים מאוד, עדינים לתוך הרקמה בבסיס המשטח לרוחב של המדף לאט ובזהירות לצבוט כדי לחתוך את הרקמה. חזור על החתכים לאורך בסיס המשטח המהודל של המדף ובקצוות הקדמיים והאחוריים של המדף כדי לנתק את המדף מהקשר שלו לראש, ואז הרם בעדינות את המדף, מה שהופך צביטות נוספות לפי הצורך כדי לשחרר לחלוטין את הקליפה מהרקמה שמסביב. כאשר המדף החיך השני הוסר באותו אופן, השתמש פיפטה העברת נורת פלסטיק סטרילית כדי להעביר את המדפים לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מיליליטר בכ 500 microliters של PBS על קרח.

כדי להגדיר תרבית תא MEPM, כאשר כל המדפים נאספו, לשאוף PBS מבלי להפריע לרקמות ומיד להוסיף 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס 0.25%טריפסין לכל שפופרת של רקמת מדף palatal. השתמש 1,000 פיפטה מיקרוליטר להצינור לזמן קצר את הרקמות כמה פעמים ולדגירה את הרקמות במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, pipetting לזמן קצר לאחר חמש דקות. בסוף הדגירה, pipette את הרקמות שוב לפני הוספת 800 microliters של תרבות MEPM מדיום לכל צינור וצנטריפוגה הצינורות כדי לאסוף את התאים.

לאחר שאיפת supernatant, resuspened הכדורים במיליליטר אחד של מדיום תרבית MEPM טרי לכל צינור, צלחת התאים לתוך בארות בודדות של צלחת תרבית רקמות שש היטב המכיל שני מיליליטר לבאר לסך סופי של שלושה מיליליטר לבאר, ולאחר מכן לאפשר לתאים לדבוק במשטח הפלסטיק במשך 12 שעות בחממה תרבית תאים סטרילית. כדי להגדיר תפילת הגירה קולקטיבית דו-ממד, הסר את החלק העליון של תוספת סיליקון סטרילית אחת בעלת שתי בארות לגובה של כמילימטר אחד לניתוח כל דגימה ולהשתמש במלקחיים סטריליים כדי לפלס את התוספות המקוצרות והסטרילית של שתי בארות למרכז בארות בודדות של צלחת בעלת שש בארות. לחץ למטה לאורך כל הקצוות כדי להבטיח כי התוספות דבקות באופן מלא תחתיות באר וזרע 300 MEPM תאים למילימטר מרובע של מוסיף סיליקון מקוצר בנפח כולל של 40 עד 50 microliters של מדיום תרבות MEPM לתוך כל להוסיף עבור דגירה לילה בחממת תרבית התא.

כדי להגדיר תיקון פצעים, השתמש במלקחיים סטריליים כדי למקם סיליקון סטרילי אחד ללא שינוי שתי בארות במרכז באר אחת של צלחת שש בארות לכל דגימה ולחץ בחוזקה על קצוות ההוספה כדי לחבר את ההוספה ללוח התרבות. ואז לזרוע 1, 400 תאים למילימטר מרובע ב 100 microliters של תרבית MEPM מדיום לתוך כל להוסיף ולדגירה את התאים במשך 48 שעות במדיום תרבית התא. בעת ביצוע נדידת נדידה קולקטיבית דו-מימדית, זריעת התאים בתוספות סיליקון דו-שלבי בצלחת תרבית גדולה בדרך כלל מספקת צפיפות תאים טובה יותר להדמיה.

טבעות קטנות בהדפסה תלת-ממדית הממוקמות בצלחת 35 מ"מ יכולות לשמש גם לניתוח תנועתיות 2D. לבדיקות לתיקון פצעים, התאים גדלים בתוספות סיליקון של שתי בארות עד למפגש גבוה. לאחר מכן, התוספות מוסרות והפצע מדמה עד לסגירת מעגל.

מסלולי MEPM הם מתמידים ואת הכיוון של תנועתיות התא נשמר במשך כמה שעות. ההעתקה הממוצעת לעומת ניתוח הזמן מצביעה על כך שההתמדה בצורת תזוזה היא פרופורציונלית לזמן שחלף. ניתוח זרימה של נתוני תנועתיות מגלה כי אשכולות תאי MEPM נעים שיתוף הם כ 300 מיקרון בגודל.

הבדל תנועתיות עמוק בין סוג פראי ותאי MEPM מוטנטיים הוא ציין גם. הליך זה יכול לשמש על קווי עכבר מהונדסים שונים ולטפל בתאי MEPM עם ריאגנטים ביוכימיים שונים כדי לחקור את השפעתם על תנועת התאים. התמקדנו בתאי מזנכיים הפליאתיים העיקריים, אך ניתן להשתמש בהדמיה בזמן ובניתוחים כמותיים כדי לחקור את תכונות ההעברה של כל סוג תא ססמה בתהליכים התפתחותיים דינמיים.