Name: הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למד הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית ומעקב זמן בזברה Danio rerio. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של תהליכי התפתחות העין בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת קוואן בעבר ובהווה על עבודה על גישות ודיונים על גישות ודיונים על פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01 EY025378 ו- R01 EY025780 ל- KMK; F31 EY030758 ל- SL; ו-T32 GM007464 ל-MAC).

<ol><li>Adler, R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+optic+vesicle+development%3A+complexities%2C+ambiguities+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies.</a> Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).</li>
<li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+development+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).</li>
<li>Fuhrmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+morphogenesis+and+patterning+of+the+optic+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle.</a> Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Shaping the vertebrate eye.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).</li>
<li>Yang, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+cell-extrinsic+growth+factors+in+vertebrate+eye+pattern+formation+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).</li>
<li>Bogdanovic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb%2FNumbl-Opo+antagonism+controls+retinal+epithelium+morphogenesis+by+regulating+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis.</a> Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).</li>
<li>Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+cup+morphogenesis+requires+neural+crest-mediated+basement+membrane+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly.</a> Development. 147 (4), (2020).</li>
<li>Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+laminin+alpha+1+results+in+multiple+structural+defects+and+divergent+effects+on+adhesion+during+vertebrate+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis.</a> Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).</li>
<li>Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2FEphrin+signalling+maintains+eye+field+segregation+from+adjacent+neural+plate+territories+during+forebrain+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis.</a> Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).</li>
<li>England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+fate+map+of+the+forebrain+shows+how+vertebrate+eyes+form+and+explains+two+causes+of+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia.</a> Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).</li>
<li>Gordon, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+cell+motility+and+optic+fissure+and+stalk+formation+during+vertebrate+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis.</a> Development. 145 (22), (2018).</li>
<li>Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+acquisition+of+neuroepithelial+character+in+the+eye+field+underlies+the+onset+of+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis.</a> Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139 (2), 359-372 (2012).</li>
<li>Martinez-Morales, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ojoplano-mediated+basal+constriction+is+essential+for+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis.</a> Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).</li>
<li>Miesfeld, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+regulate+retinal+pigment+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate.</a> Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).</li>
<li>Nicolas-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cellular+behavior+and+cytoskeletal+dynamics+reveal+a+constriction+mechanism+driving+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Picker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+coupling+of+pattern+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000214(2009).</li>
<li>Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+cell+migration+serves+as+the+driving+force+for+optic+vesicle+evagination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination.</a> Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).</li>
<li>Sidhaye, J., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+action+of+neuroepithelial+basal+shrinkage+and+active+epithelial+migration+ensures+efficient+optic+cup+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+issue+of+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish issue of Development.</a> Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).</li>
<li>Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR-Cas9-based+methods+for+generating+deletion+mutations+and+F0+embryos+that+lack+gene+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish.</a> Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Almeida, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+Fates%3A+a+new+approach+to+the+study+of+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina.</a> Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li>
<li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Llgl1+in+retinal+neuroepithelia+reveals+links+between+apical+domain+size%2C+Notch+activity+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis.</a> Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).</li>
<li>Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+cell+divisions+during+neurogenesis+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina.</a> Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).</li>
<li>Kay, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+requirement+for+ganglion+cells+during+assembly+of+retinal+synaptic+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers.</a> Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).</li>
<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Suzuki, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+marginal+zone+of+the+zebrafish+retina%3A+clonal+and+time-lapse+analysis+of+a+continuously+growing+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue.</a> Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).</li>
<li>Yoshimatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+partner+selection+during+retinal+circuit+reassembly+varies+with+timing+of+neuronal+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo.</a> Nature Communications. 7, 10590(2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+visualization+tool+for+multi-channel+confocal+microscopy+data+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).</li>
<li>Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoRender%3A+an+application+of+2D+image+space+methods+for+3D+and+4D+confocal+microscopy+data+visualization+in+neurobiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Pacific+Visualization+Symposium%22%5BJournal%5D)">FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research.</a> IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).</li>
<li>Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LongAxis%3A+a+MATLAB-based+program+for+3D+quantitative+analysis+of+epithelial+cell+shape+and+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation.</a> Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור תיוג הטוטו והדמיה 4D timelapse של מורפוגנזה אופטית. אנו עוברים את התהליך של יצירת חלבונים פלואורסצנטיים קידוד RNA capped כדי לסמן תאים תת-תאיים שונים; הזרקת עוברי דג זברה 1-תא; הטמעת עוברים של 11 כ"ס באגרוז להדמיה מרובת-קס; ורכישת ערכות נתונים 4D של עוברים מרובים למשך מורפוגנזה אופטית (12-24 כס).

ניתן לענות על מספר רב של שאלות עם ערכות נתונים צפופות מידע אלה. ניתן לדמיין נתונים 4D ולנתח כמותית במגוון דרכים. למרות שמחוץ להיקף פרוטוקול זה, אנו כוללים כאן כמה מהמטרות והיישומים הסטנדרטיים שלנו כדוגמה לסוגי הדברים שניתן להשיג. כמובן, שיטות ניתוח תמונה כמותית מפותחות כל הזמן, וניתן להשתמש בכלים מסחריים ובנויים בהתאמה אישית. אם אחד לא השתמש בשיטות כאלה לפני, אחד צריך להיות מוכן לעבוד דרך אופטימיזציה מסוימת כדי להבטיח כי ערכות הנתונים שנרכשו מתאימים לגישת הניתוח הכמותי של בחירה.

הדמיה והערכה כמותית של ערכות הנתונים 4D יכולות להיות מאתגרות, בשל גודל הקבצים. ניתן להשתמש בתוכנת הרכישה כדי להפריד את ערכות הנתונים לעוברים בודדים, ו- ImageJ/Fiji יכול לשמש להמרת קבצי קונפוקל מתבניות מסחריות לערימות tif סטנדרטיות יותר, שבהן כל נקודת זמן נשמרת כקובץ נפרד. פעולה זו תקטין את גדלי הקבצים ותתקן את תבניות הקובץ. ניתן להרכיב מקטעים אופטיים בודדים מכל נקודת זמן כ- timelapse 2D (XY) באמצעות ImageJ/Fiji, המאפשרים הדמיה והערכה מהירה של הנתונים. סרט 1 הוא דוגמה בדיוק לכך: קטע אופטי יחיד לאורך זמן שהורכב כזמן של המדגם האופטימלי המוצג באיור 4I'''. משם, להדמיה תלת-ממדית ו-4D, אנו משתמשים בדרך כלל ב- FluoRender35,36, הזמינה באופן חופשי אך יש לה דרישות ספציפיות לכרטיס גרפי. באמצעות FluoRender, ניתן לסובב נתונים מעובדים בתלת-ממד בכל ציר, לדמיין את ערכת הנתונים ב- 4D לאורך זמן, ליצור חתכים בכל מישור ולשמור את הסיבובים והפריטים החזותיים כסרט או כסדרה של תמונות tif.

במונחים של ניתוח כמותי, ישנן שאלות רבות שיש לענות עליהן. פיתחנו תוכנה בתוך הבית כדי לסייע המטרות הספציפיות שלנו של הבנת התנהגויות התא שבבסיס מורפוגנזה אופטית. התוכנית שלנו, LongTracker, משתמשת באות הגרעיני כנציג למיקום למעקב אחר תאים13. עם נתונים אלה, אנו יכולים לקבוע מתי, היכן וכיצד תאים נעים; כמה מהר וכמה רחוק תאים נעים; ותדירות חלוקת התאים. בנוסף לתוכנה שלנו, ישנן מספר אפשרויות זמינות מסחרית ובנוי מותאם אישית למעקב אחר תאים 4D. פיתחנו גם את התוכנית LongAxis כדי לבצע פילוח תאים ולכומת את צורת התא ואת הארגון בתוך הרשתית העצבית37. עם זאת, קלט ערכות הנתונים ל- LongAxis הן ערימות Z בודדות, הנלקחות ברזולוציה גבוהה. אתגר מתמשך כבר יצירת ערכות נתונים timelapse עם רזולוציה גבוהה מספיק כי תאים ניתן לפלח בביטחון ואת המורפולוגיה שלהם אקסטרפולציה. חלופה אחת היא תיוג פסיפס (דליל) באמצעות פלואורופור פוטו-קונברלי כמו Kaede להדמיה ישירה של צורת התא, כפי שאנו ואחרים ביצענו בעין המתפתחת8,11,13. פעולה זו מפשטת את בעיית פילוח התא, וניתן לכמת בקלות את צורת התא ואת גודלו באמצעות עיבוד תלת-ממדי ב- FluoRender.

כל שלב בפרוטוקול זה היה מותאם במיוחד למטרות שלנו. הספציפיות של פרוטוקול זה גורמת למספר מגבלות: הפרוטוקול, כפי שנכתב, אינו מותאם להדמיית היבטים אחרים של התפתחות העיניים של דגי הזברה (כגון נוירוגנזה ברשתית), מבני עיניים אחרים, שלבים התפתחותיים אחרים או תאים תת-תאיים אחרים. הכיוון של הטבעה, מהירות ההדמיה והתוויות נועדו כולם לאפשר לנו לענות על השאלות הביולוגיות שלנו. על מנת לדמיין נוירוגנזה רשתית, למשל, הכיוון העושי של העובר כמתואר כאן לא יכול לאפשר הדמיה של תכונות ספציפיות של עניין, ואת מהירות ההדמיה לא יכול להיות מתאים. היבטים רבים של הפרוטוקול ניתן להתאים ולשנות עבור מגוון רחב של צרכים, בהתאם לאינטרסים הספציפיים של האדם ומטרות. ראשית, שימוש בזריקות RNA הופך את תהליך התיוג לגמיש מאוד. ניתן להשתמש במבנים של היתוך חלבון פלואורסצנטי כדי לסמן מבנים תת-תאיים בעלי עניין, וניתן לשנות את כמות הזרקת הרנ"א כדי לייעל את התיוג. בהתבסס על העבודה שלנו עם פלואורופור Kaede photoconver, זריקות RNA נראה לתמוך פרץ של תרגום כי הוא מעל על ידי 12 hpf11,13. רמות גבוהות של ביטוי חלבון פלואורסצנטי מהזרקת RNA יכולות להילחם להלבנה פוטו, אך גישה כזו אינה תומכת בביטוי מתמשך של תווית הפלואורסצנטית של עניין. אם יש צורך בביטוי מתמשך, כגון כאשר עוברים הדמיה בשלבים מאוחרים יותר, קווים מהונדסים הם אופציה, ובניית קווים חדשים בדגי זברה היא פשוטה24.

לאחר מכן, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לשלבים מאוחרים יותר של פיתוח. מכיוון פיגמנט עלול לעכב הדמיה בשלבים מאוחרים יותר, עוברים ניתן לטפל עם phenylthiourea (PTU) כדי לעכב היווצרות פיגמנט, או מוטציות גנטיות עבור סינתזת פיגמנטים ניתן להשתמש. כדי למנוע עוויתות עובר, ניתן להוסיף טריקיין לפתרונות כיסוי אגרוז ושכבת-על של אמצעי התקשורת של העובר, וניתן להתאים את אחוז האגורוז לפי הצורך. ככל שהעין גדלה, ייתכן שיהיה צורך לשנות את כיוון ההרכבה; כאן, אנו הר עוברים דורי, אבל בשלבים מאוחרים יותר, זה עשוי להיות הגיוני יותר לעלות לרוחב או לפני העניין, בהתאם למבנה העניין. מכיוון ותהליכים שונים מתרחשים על פני סולמות מרחביים וטמפורליים שונים, ניתן גם למטב את שלב Z ואת שלב הזמן של רכישת תמונה. תכונות אלה יכולות להיקבע רק אמפירית לצרכי כל מעבדה.

לבסוף, פרוטוקול זה פותח במיוחד עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר, עם עוברים מוטבעים באחוז גבוה יחסית של אגרוז בשלב מוקדם של התפתחות העין. אם אחד הוא הדמיה בזמנים שונים או במקומות שונים במהלך פיתוח העין, פרוטוקול זה יצטרך להיות מותאם לתהליך העניין. גישות הדמיה רבות ושונות אפשריות כיום, כאשר יותר מפותחות על ידי מהנדסים אופטיים. כל גישה מביאה מערכת אתגרים משלה, החל מדרכים שונות להטמיע ולהרכיב עוברים להדמיה, ועד לגדלי קבצים ופורמטים שונים. אנו מתארים שיקולים במבוא להנחות את תהליך האופטימיזציה, שבו רזולוציה מרחבית וטמפורלית מקסימלית מאוזנת עם ליבנה, פוטוטוקסיות וגדלי קבצים עצומים. אנו מקווים כי עקרונות כלליים אלה, בנוסף למידע המעשי המתואר לעיל, יסייעו לאחרים בקביעת גישות הדמיה timelapse ללמוד את השאלות הפתוחות הרבות בהתפתחות העין.

התפתחות העין החולייתית מתחילה עם הופעתה, או התחמקות, של שלפוחיות אופטיות מן נוירופיליום המוח הפוטנציאלי. שלל אופטי לאחר מכן לעבור סדרה של שינויים בצורת רקמות, מוארך ולאחר מכן פולשניות כדי ליצור את הכוס האופטית. בכוס האופטית, הרשתית העצבית ואפיתל הפיגמנט ברשתית, שניהם נגזרים מהנוירו-אפיתליום, עוטפים את העדשה המתהווה, הנגזרת מהקטודרם של פני השטח. התהליך כולו דורש סדרה מורכבת של תנועות תאים ורקמות ואיתות מולקולרי, המתואם בין נוירופיליום, ectoderm, ואוכלוסיות תאים מזנכימליים. אירועים ראשוניים אלה קובעים את המבנה הבסיסי של העין, וצעדים מאוחרים יותר של התפתחות העין, כולל היווצרות קשתית וקורנית, הם פירוט על ארגון מוקדם. הפרעות בהתפתחות עיניים מוקדמת ומורפוגנזה עומדות בבסיס תנאי ליקוי ראייה רבים בבני אדם, כולל אנופותלמיה, מיקרופתלמיה וקולובומה. פתיחת המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים במורפוגנזה של אופטית חיונית להבנת התפתחות מערכת הראייה והתנאים הפתולוגיים הנובעים מכך שתהליכים אלה משתהים.
ההבנה שלנו של התפתחות העין החולייתית ומורפוגנזה צמחה מכמות עצומה של עבודה המשתרעת על פני מחקרים היסטולוגיים קלאסיים לגישות עובריות וגנטיות במגוון אורגניזמים מודל כולל עכבר, אפרוח, צפרדע, ודגים1,2,3,4,5. בעוד גוף עבודה זה הקים מנגנונים מולקולריים המסדירים את התפתחות העין המוקדמת, מבחינה היסטורית קיימת הבנה לקויה של המורפוגנזה של העין: הופעתו של מבנה תלת-ממד שלה. עיקר הממצאים הללו הגיעו מעוברים חלקי הדמיה בנקודות זמן נפרדות. אמנם זה מספיק כדי לספק תצוגה של מורפולוגיה של רקמות ב 2 ממדים, מורפוגנזה הוא דינמי, תהליך 3D. על מנת לקבוע כיצד צורת הרקמה משתנה ב -3 ממדים לאורך זמן, כיצד תאים בודדים מתנהגים, וכיצד התנהגויות אלה תורמות לשינויים בצורת רקמה תלת-ממדית, יש צורך בגישות שונות.
פתרון אחד לטיפול בפער משמעותי זה בידע הוא הדמיה חיה, המאפשרת תצפית דינמית של תאים ורקמות בזמן אמת עם עיצוב האיבר. למרבה הצער, זה לא אפשרי בקלות באורגניזמים מודל רבים בשל האילוצים של התפתחות עוברית. לדוגמה, עוברים עכבר וגוזל (המתפתחים ברחם או בתוך קליפת ביצה) אינם נגישים בקלות, ועוברים חיים רבים אינם שקופים אופטית, מה שגורם לפיזור אור משמעותי ומגביל את העומק שאליו ניתן לרכוש תמונות. דגי זברה, עם התפתחות חיצונית ועוברים שקופים, מספקים הזדמנות ייחודית לבצע הדמיה חיה של מורפוגנזה בעיניים6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. קווים מהונדסים ומוטנטים בשפע זמינים גם כן, כמו גם כלים ליצירת טרנסגנים ומוטנטים חדשים20,21,22,23,24. יתר על כן, מורפוגנזה אופטית מתרחשת במהירות דג זברה, על פני מסגרת זמן של 12 שעות (12-24 שעות לאחר ההפריה, HPF), מה שהופך את ההדמיה של התהליך כולו ריאלית.
מאמצי ההדמיה החיה הואצו על ידי התרחבות ואופטימיזציה של משפחת החלבונים הפלואורסצנטיים, המאפשרים תיוג חיוני מקודד גנטית של מבנים תת-תאיים, כמו גם שיפורים וחידושים בשיטות מיקרוסקופיה. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ולא בגישות עכשוויות אחרות להדמיית עוברי דגי זברה, כולל מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק ספינינג, מיקרוסקופיה סלקטיבית של תאורת מטוס (SPIM וגרסאותיה), ושיטות מיקרוסקופיות מיוחדות אחרות. עבור עין דג הזברה המתפתחת, מצאנו כי מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק ספינינג לא היה מספיק להדמיה עמוקה יותר ברקמה. למרות ש-SPIM מתגאה בזמן הדמיה מהיר ביותר ונעשה בשימוש נרחב יותר, הטיפול ערכות הנתונים הגדולות להדמיה וניתוח נותר אתגר. לעומת זאת, מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר נגישה בקלות, במיוחד עבור אנשים חסרי מומחיות בהרכבת חומרה אופטית. אנו מקווים כי הזמינות הרחבה של מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר תהפוך את הפרוטוקול שלנו שימושי עבור מעבדות רבות.
כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו ללכידת ערכות נתונים 4D של מורפוגנזה אופטית, באמצעות תיוג טוטו של העובר עבור ממברנות וכרומטין, ומיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר לרכישת תמונה (סכמטי באיור 1). החלבונים הפלואורסצנטיים המשמשים כאן (EGFP-CAAX ו- H2A). F/Z-mCherry) נבחרו לספק תיוג רקמות ברזולוציה של תא בודד. אנו משתמשים בערכות נתונים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה עבור מגוון פונקציות ניתוח תמונה ופריטים חזותיים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות אם מבנים תת-תאיים אחרים רצויים. תיוג קרום פלזמה נבחר להדמיה של צורת התא: אנו משתמשים EGFP-CAAX, שבו 21 חומצות האמינו האחרונות של H-ras, המשמשות כרצף אות פרנילציה, מותכות ל- C-terminus של EGFP13. חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדים אחרים של קרום פלזמה (למשל, היתוך טרנס-מברן או מיריסטוילציה) צפויים לעבוד באותה מידה. כדי לסמן גרעינים, בחרנו H2A. F / Z-mCherry, שבו mcherry מותך חלבון histone13. פעולה זו מבטיחה כי חלוקת התא, כולל כיוון ציר מיטוטי, הוא הדמיה בקלות.
עם כל גישה של הדמיה חיה, יש לשקול פשרות בין הגברת מהירות ההדמיה תוך מקסום יחס האות לרעש, רזולוציה צירית ושימור מדגם. מיטבנו את השיטות שלנו כדי למקסם את איכות התמונה ואת מספר העוברים שניתן לדמיין בריצה אחת. לעתים קרובות, המטרה היא לדמיין מורפוגנזה אופטית בעובר מוטנטי הומוזיגוס, אשר עשוי להיות פנוטיפי להבחין מן הסוג הפראי בתחילת מורפוגנזה אופטית וצאצאים של פולש הטרוזיגוס (25% מהעוברים הם הסוג הרצוי). על ידי אופטימיזציה, ולאחר מכן רכישת תמונה multiplexing, יש סבירות מוגברת של לכידת קבוצת נתונים של עובר מוטציה הומוזיגוס.
רזולוציית זמן, או התדירות שבה נרכשים נתוני נפח (ערימות Z), היא היבט מרכזי של הדמיית timelapse. בהתאם למטרה עבור ערכות נתונים כאלה, קיימות דרישות שונות למהירות. בתחילה פותח פרוטוקול זה למעקב ידני אחר תאי 4D. מעקב אחר תאים בודדים בתוך רקמה המסומנת באופן אחיד דורש רזולוציה טמפורלית גבוהה מספיק כדי לספק ביטחון כי כל תא אחד נמצא במעקב רציף לאורך זמן. מצאנו כי Z-ערימות של מורפוגנזה דגי זברה אופטיים חייבים להיות נרכשים לפחות כל 3.1 דקות מעל 12 שעות; כאן, יש לנו אופטימיזציה הרכישה שלנו על מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר כך שנוכל לרכוש Z-ערימות של 4-5 עוברים כל 2.5 דקות.
יצירת גודל שלב Z הייתה שלב מכריע באופטימיזציה של הפרוטוקול: עבור עיבוד ופריטים חזותיים תלת-ממדיים, נתונים איזוטרופיים הם אידיאליים, שבהם גודל שלב Z שווה לממד הפיקסלים XY. במציאות, קשה מאוד להשיג נתונים כאלה timelapse עם דגימות חיות, בהתחשב באילוצים עם זמן הדמיה והלבנה. לכן, קביעת גודל Z-step נאות חשובה לצרכי העיבוד וההדמיה של הניסוי, ובאופן ספציפי, מה יחס X:Y:Z voxel נדרש כדי למקסם את המידע צירי תוך שמירה על מהירות ומניעת הלבנת תמונות. עבור פרוטוקול זה, יחס voxel שנקבע היה 1:1:3.5 (0.6 מיקרומטר x 0.6 מיקרומטר x 2.1 מיקרומטר Z-צעד גודל באמצעות 40x מרחק עבודה ארוך טבילת מים מטרה). בעת רכישת עומק Z של 130-140 מיקרומטר, זה מניב נתוני נפח עם רזולוציה זמנית מתאימה והלבנת פוטו קטן.
כפי שנדון לעיל, פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור הדמיה 4D של מורפוגנזה אופטית דג זברה, באמצעות עוברים טוטו שכותרתו עבור קרום פלזמה כרומטין, ומיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר. הפרוטוקול שלהלן ניתן להתאים בקלות עבור מגוון של ניסויים וצרכים. ראשית, ביחס למבנים תת-תאיים, ניתן לדמיין כל מבנה שעבורו קיים סמן תא חי. לאחר מכן, למרות שההתמקדות כאן היא אך ורק על מורפוגנזה אופטית, הדמיית timelapse ניתן להתאים לשלבים אחרים של התפתחות העין, למשל, neurogenesis25,26,27,28,29,30,31,32,33. להדמיה בשלב מאוחר יותר, ייתכן שיהיה צורך לשקול אימוביליזציה של העובר (כאשר פעילות השרירים הספונטנית מתחילה בסביבות 24 כ"ס), פיגמנטציה (שמתחילה להגיח סביב 24 כ"ס), גודל הרקמה (העין גדלה באופן משמעותי בנפח במהלך נוירוגנזה) ומהירות הדמיה (שיש להתאים בהתאם למהירות תהליך העניין). ניתן לנהל בקלות את כל השיקולים הללו. הפרוטוקול גמיש למדי; בנוסף לפרטי הפרוטוקול הספציפי כאן, ישנם עקרונות כלליים שיסייעו למעוניינים בהדמיה חיה היבטים אחרים של התפתחות העין.

<table><tbody><tr><td>צלחת דלתא TPG 0.17 מ"מ שקופה</td><td>Bioptechs</td><td>0420041500C</td><td>תחתית זכוכית כיסוי לתאימות אופטית</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר חד פעמיות</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>אורך כולל 14.6 ס"מ (53/4 אינץ')</td></tr> <tr><td>Dumont #5, #55, או #5SF מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11254-20</td><td>לסגנון #5: קצה ישר, קצה 0.05 x 0.01 מ"מ, אינוקס, באורך 11 ס"מ</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה בוער/חום</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Immersol W</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>4449690000000</td><td>נוזל טבילה למטרות פליטת מים, נטול הלוגן, פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>נמוך עובש מיקרו-הזרקה</td><td>כלי מדע אדפטיביים</td><td>TU-1</td><td>שש רמפות, צד אחד 90 מעלות וצד אחד משופע 45 מעלות.</td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Microloader, קצה למילוי מיקרו-נימי זכוכית, 0.5 &ndash; 20 ומיקרו; </td></tr><tr><td>ערכת תמלול L mMessage mMachine SP6</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>מכילה תערובת אנזים SP6, מאגר תגובה פי 10, 2XNTP&frasl; פתרון CAP, פתרון GTP, pTRI-Xef, TURBO DNase, תמיסת עצירת אמוניום אצטט, תמיסת משקעים ליתיום כלוריד ומאגר טעינת ג'ל וכולם מאוחסנים ב-&ndash; ניתן לאחסן מים ללא גרעין בכל טמפרטורה.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו Nikon SMZ645</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>המשמש להזרקת עוברים (ראה איור 2B)</td></tr> <tr><td>אנזים NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td>מגיע עם צבע טעינת ג'ל, סגול (6X)</td></tr> <tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>ברזולוציה עדינה, אגרוז נמס נמוך</td></tr><tr><td>אובייקטיבי LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27</td><td>Carl Zeiss מיקרוסקופיה</td><td>421867-9970-000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו אולימפוס SZX16</td><td>אולימפוס</td><td>SZX2-ZB16</td><td>המשמש להקרנה, הטמעת עוברים (ראה איור 3A)</td></tr> <tr><td>תמיסה אדומה פנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0.5% ב-DPBS, מסונן סטרילי, נבדק אנדוטוקסין, נבדק תרבית תאים</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק פיקו-ליטר</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>PLI-100</td><td>זריקות פמטוליטר למיקרוליטר; קריאות דיגיטליות לספירת זריקות, זמן ולחץ; מכיל 5 לחצים כולל הזרקה, איזון, ניקוי, מילוי והחזקה</td></tr><tr><td>משאבת פיפטה פיפטור</td><td>SP Bel-Art</td><td>F37898</td><td>מתאים לפיפטה פסטר חד פעמית, מכיל גלגל אגודל בצד לשאיבה או חלוקה ובוכנה לריקון מהיר</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט קיר דק פרימיום</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>G100T-4</td><td>1.0 x 0.78 מ"מ</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>מכיל QIAquick Spin Columns, חוצצים, שפופרות איסוף (2 מ"ל)</td></tr> <tr><td>ללא RNase H2O</td><td>Invitrogen</td><td>AM9906</td><td>DNase, בדרגת ביולוגיה מולקולרית, ללא RNase</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>מכיל RNeasy Mini Spin Columns, צינורות איסוף (1.5 מ"ל ו-2 מ"ל), ריאגנטים ומאגרים ללא RNase</td></tr><tr><td>Stage Attachment Z PIEZO WSB 500</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>432339-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>שלב הכנס Z PIEZO WSB מיקרוסקופיה אוניברסלית</td><td>Carl Zeiss</td><td>432339-9030-000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 עם Airyscan</td><td>Carl Zeiss מיקרוסקופ</td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ Axio Observer הפוך</td></tr><tr><td>Zen Black 2.3 SP1 תוכנה</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Zeiss Efficient Navigation (ZEN) שולט בכל מערכות מיקרוסקופ האור מבית Zeiss</td></tr></tbody></table>

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

פונקציית מערכת הראייה דורשת הקמת מבנים מדויקים של רקמות ואיברים. בעין החולייתית, פגמים מבניים הם סיבה נפוצה לליקוי ראייה, אך מנגנונים של מורפוגנזה בעיניים עדיין מובנים היטב. הארגון הבסיסי של העין העוברית נשמר בכל בעלי החוליות, ולכן הדמיה חיה של עוברים דגי זברה הפכה לגישה רבת עוצמה להתבוננות ישירה בהתפתחות העין בזמן אמת בתנאים נורמליים ופתולוגיים. תהליכי תאים דינמיים כולל תנועות, מורפורוגיות, אינטראקציות, חלוקה ומוות יכולים להיות חזותיים בעובר. פיתחנו שיטות לתיוג אחיד של מבנים תת-תאיים ומיקרוסקופיה קונפוקלית של timelapse של התפתחות עיניים מוקדמת בדגי זברה. פרוטוקול זה מתאר את השיטה ליצירת mRNA כתרים להזרקה לעובר דג זברה בן תא אחד, הרכבת עוברים בשלב צעיפים אופטיים (~ 12 שעות לאחר ההפריה, HPF), וביצוע הדמיה רב-ממדית של מורפוגנזה של אופטית על מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, כך שערכות נתונים מרובות נרכשות ברצף באותה הפעלת הדמיה. גישה כזו מניבה נתונים שניתן להשתמש בהם למגוון מטרות, כולל מעקב אחר תאים, מדידות נפח, עיבוד תלת-ממדי (תלת-ממד) והדמיה חזותית. הגישות שלנו מאפשרות לנו לאתר במדויק את המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים את פיתוח הכוס האופטית, הן בסוג הפרא והן בתנאי מוטציה גנטית. שיטות אלה יכולות להיות מועסקות ישירות על ידי קבוצות אחרות או מותאמות לדמיין היבטים רבים נוספים של התפתחות העין דג זברה.

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

ההבנה שלנו של מורפוגנזה העין מגיעה ממחקרי רקמות קבועים קודמים. עם זאת, מחקרים אלה חסרים דינמיקת תאים ורקמות. באמצעות הדמיה של זמן לשגות, אנו מסוגלים ללכוד את כל התהליך הזה להדמיה וניתוח.השיטה שלנו המנצלת את ההתפתחות החיצונית בבהירות אופטית של עוברים דגי זברה, המאפשרים הדמיה חיה, ומשתמשת במיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר הזמינה ברוב קמפוסי המחקר. חוקרים חדשים בשיטה זו צריכים לצפות לניסוי וטעייה לפני קבלת ערכת נתונים שמיש. צעדים רבים, במיוחד הזריקות וההטבעה, חייבים ללכת טוב כדי להצליח, אז יש סבלנות.ברגע שדג הזברה מתחיל להתרבות, בזמן שהוא ממתין 15 עד 20 דקות כדי להבטיח שהביצים מופרות, השתמש בפיפטה P10 ובמיקרוליטר P10 כדי לגבות לטעון מחט הזרקת מיקרו נימית מזכוכית משוך עם 2.5 עד 5 מיקרוליטרים של דילול RNA של עניין. כאשר הביצים מוכנות, השתמש פיפטה העברה ומיקרוסקופ לנתח כדי לטעון את הביצים בזהירות לתוך תבנית ההזרקה, באמצעות מלקחיים כדי לגלגל את העוברים, כך התא הבודד גלוי לפי הצורך. לאחר מכן הזריקו את כל העוברים בשלב של תא אחד, תוך התמקדות בתא ולא בחלמון כדי להבטיח תיוג אחיד של העובר המתפתח.בערך 11 שעות לאחר ההפריה, מניחים עליקוט של 1 עד 5 מיליליטר של 1.6% אגז נמס נמוך ב- E3 בינוני בבלוק חום של 42 מעלות צלזיוס והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן עוברים מוזרקים בהצלחה עם בהירות כוללת של פלורשנס. תספור את הסומיטים כדי לביים כראוי את העוברים. ב 11 שעות לאחר ההפריה, שלושה סומיטים יש לראות.מדגם אידיאלי יהיה אותות EGFP ו mCherry חזקים ולהיות בשלב ההתפתחותי הנכון. לפני הרכבה, מניחים את העוברים בצלחת מצופה אגר ומשתמשים במלקחיים כדי להסיר את הכוריון מכל עובר. כאשר כל העוברים הוקעו, השתמש בצינור גליל זכוכית כדי לשאוף עובר אחד.יש לפלוט כמה שיותר E3 כך שהעובר יושב בקצה זכוכית פיפטת פסטר ושחררו את העובר לתוך צינור האגארוז מבלוק החום. תן לעוברים לשקוע לתוך האגורוז במשך כמה שניות לפני שאיפה נפח קטן של אגרוז יחד עם העובר, תוך טיפול כי העובר נשאר בקצה הצינור. מוציאים את העובר והאגורה לטיפת אגרוז בצלחת תחתונה של זכוכית ומנצלים במהירות אך בזהירות מלקחיים כדי לכוון את צד הגב של העובר כלפי מטה לפני שהטיפת אגרוז מתקשה.לאחר הרכבה 10 עד 12 עוברים באותו אופן, להוסיף מספיק agarose כדי לכסות לחלוטין את החלק התחתון של המנה עוטף את כל הטיפות בדיסק אגרוז אחד. כאשר האגורוז התקשה, שכבה E3 מעל האגורוז כדי לשמור על הדגימות hydrated. לאחר הגדרת המיקרוסקופ הקונפוקל סורק לייזר לפרמטרים המתאימים להדמיה בזמן לשגות, מצפים בנדיבות את החלק התחתון של צלחת התחתונה של הזכוכית עם מדיום טבילה התואם את האינדקס השבירה של מים, דואג להימנע מבועות אוויר, ולהחיל טיפה קטנה של מדיום טבילה על המטרה של מים 40X.אבטחו את צלחת הזכוכית התחתונה בהכנסת הבמה והוסיפו מדיום E3 נוסף כדי לשמור על העוברים לחים למשך הלילה. השתמש חימר דוגמנות כדי לאטום את מכסה הפלסטיק מעל המנה ולהעלות את המטרה כדי ליצור קשר עם המנה. תחת כותרת המיקום של תוכנת המיקרוסקופ, לחץ על הוסף כדי לשמור את מידע XYZ של המדגם הראשון שיחו על-ידי זמן קצר ולבחור מדגם עם פלואורסצנטיות חזקה והרכבה אופטימלית.תחת הכרטיסיה איתור, חפש את הדוגמה הבאה ולחץ על מיקום והוסף כדי לבחור את הדוגמה כפי שהודגמה. לאחר בחירת כל הדוגמאות, סמן את המיקום הראשון ולחץ על מעבר אל. תוך כדי סריקה רציפה, מסדרים את ההבל האופטי בתוך המסגרת, ומשאירים מקום רב באזורים הנעשים והדיסטליים ביחס ללסת הראייה והמוח.כדי להקצות את פרוסת Z הראשונה והאחרונה, בחר את הסט הראשון והגדר אחרון תוך כדי מעבר דרך כיוון Z עם ידית המיקוד העדינה, תוך שמירה על מספר פרוסה כולל של כ-63 כדי להתאים לצמיחת הכוס האופטית. כלול חדר נוסף בצד הגחון של ארסית הראייה כדי לאפשר מקום לצמיחה. לאחר שנקבעו פרוסות Z הראשונה והאחרונה, לחץ על C כדי לעבור למרכז מחסנית Z ולהתאים את כוח הלייזר ולהשיג עבור שני הלייזרים.לאחר הגדרת עוצמת הלייזר והרווח, הפסק את הסריקה ולחץ על העדכון כדי לעדכן את פרטי המיקום. כדי לעבור למיקום הבא, לחץ על מיקום 2. לאחר שגם פרוסת Z הראשונה וגם האחרונה הוגדרו כפידגמו, פתח את כותרת סידרת הזמן והגדר את מספר המחזורים ל- 300 ואת מרווח הזמן ל- 2.5 דקות.לאחר סקירת ההגדרות כדי לוודא שהכל סופי, לחץ על התחל כדי להתחיל את זמן ההפוגה ואשר כי הסיבוב הראשון של הדמיה נלכד כראוי לפני מתן אפשרות לתקופת זמן לרוץ בן לילה. הזרקה ישירה לתא הבודד נחוצה לתיוג אחיד ופלואורסצנטיות חזקה. עם טבילתם באגרוז, העוברים צריכים להיות מרווחים באופן שווה לאורך כל המנה.אם העוברים מבוימים כראוי, פלואורסצנטיים מספיק ומורכבים כראוי, הם יישארו במסגרת ההדמיה במהלך מעידת הזמן, מה שיאפשר את הדימוי של האיבר כולו. דגימות שאינן מכוונות לאורך ציר הגב, כגון אלה אופקיות או אלכסוניות, יגדלו מתוך מסגרת ההדמיה ככל שהזמן יפוג ולא ניתן יהיה להשתמש בהן לניתוח נוסף. עובר שסובב יתר על המידה יגרום לשקיעת זמן אחורית יותר.עובר שאינו מסובף לא יאפשר רק את הרקמה הימנית ביותר לצפייה. בנוסף, דגימות המותקנות ביחס לכיוון המסגרת נוטות יותר להניב זמן מוצלח. הטיה זו כלפי הצד הגחון מספקת מרחב נוסף לצמיחת רקמות בכיוון הגחון וכתוצאה מכך מעידת זמן אופטימלית.כאשר קריטריונים אלה אינם מתקיימים, זמן-לשגות כבר לא ללכוד את כל נפח 3D של הרקמה כפי שהוא מתפתח ולא ניתן להשתמש בו לניתוח נוסף. ניתן לנתח ערכות נתונים עשירות במידע אלה בדרכים רבות, כולל מעקב אחר תאים 4D עם מהירות תאים וכימות מסלול, מדידות נפח תאים ורקמות ופריטים חזותיים 3 ו- 4D.

4-dimensional-imaging-of-zebrafish-optic-cup-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית ומעקב זמן בזברה Danio rerio. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמי של תהליכי התפתחות העין בביולוגיה התפתחותית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

גלה סרטונים נוספים