Name: חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: חקור מערכת דימריזציה כימית ליצירת קונדנסטים של חלבונים על טלומרים בצורה הפיכה ומבוקרת בזמן. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של דינמיקת הקונדנסטים וחקר הרכבם הפונקציונלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (1K22CA23763201 ל H.Z., GM118510 עד D.M.C.) וקרן צ'ארלס א. קאופמן ל- H.Z. המחברים רוצים להודות לג'ייסון טונס על הגהת כתב היד.

1. ייצור קווי תאים ארעיים
<ol><li>תאי קבלה של U2OS על כיסויי זכוכית בקוטר 22 x 22 מ"מ (להדמיה חיה) או כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ (עבור IF או FISH) מצופים בפולי-D-ליצין בצלחת 6-well עם מדיום צמיחה (10% סרום בקר עוברי ופתרון 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב- DMEM) עד שהם מגיעים להשפעה של 60-70%.</li>
	<li>החלף את מדיום הצמיחה עם 1 מ"ל transfection בינוני (מדיום צמיחה ללא פתרון פניצילין-סטרפטומיצין) לפני transfection.</li>
	<li>עבור כל תחול היטב, להוסיף 4 ריאגנט transfection μL כדי 150 μL מופחת מדיה בסרום, מערבולת במשך 10 שניות ולאחר מכן דגירה במשך 5 דקות.</li>
	<li>עבור כל באר, להוסיף Plasmid לבנות Halo (מוטציה Halo-GFP-TRF1 או Halo-TRF1) ו- eDHFR לבנות plasmid (mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה) ביחס מסה 1:1 (0.5 מיקרוגרם Halo לבנות plasmid עם 0.5 μg eDHFR לבנות plasmid) כדי 150 μL מופחת מדיה בסרום, dropwise, לערבב על ידי pipetting. הערה: התגים קטנים יחסית (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) ולא נצפתה השפעה על הפרדת פאזה. עם זאת, מומלץ להשתמש במוטנטים כגון מוטציה SIM כדי לוודא שהתנהגות הפאזה רגישה למוטציות ולא לתגיות. ה-SIM הוא מ-PIASx28,30. SIM sequence is AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. מוטציה SIM נוצר על ידי מוטציה חומצות אמינו SIM VIDL כדי VADA28, והרצף הוא AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. הפקדנו את הפלסמידים שלנו כדי להוסיף: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 מוטציה mCherry-eDHFR-SIM.</li>
	<li>הוסף 150 μL של ריאגנט ריאגנט מופחת תערובת מדיה בסרום ל 150 μL מופחת סרום מדיה עם DNA, dropwise, לערבב על ידי pipetting, דגירה במשך 5 דקות.</li>
	<li>מוסיפים את 300 μL של תערובת ריאגנט-DNA transfection לתאים, dropwise ולאחר מכן למקם תאים בחזרה אינקובטור.</li>
	<li>המתן 24-48 שעות לפני הדמיה חיה, אימונופלואורסצנטיות (IF) או פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).</li>
</ol>2. דימרציה בטלומרים
<ol><li>ממיסים דימריזרס בדימתיל סולפוקסיד ב-10 מ"מ ומאחסנים בצינורות מיקרוצנטריפוגה מפלסטיק ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. הערה: במקום להשתמש בדמרייזר עם TMP המקושר ישירות Halo (TMP-Halo, TH), דימרייזר TMP-NVOC-Halo (TNH) שיש לו מקשר רגיש לאור, 6-ניטרבטריל אוקסיקרבוניל (NVOC), בין TMP להלוליגנד משמש31. הסיבה לכך היא שלוקח פחות זמן ל- TNH (~ 5 דקות) לפזר לתא מאשר TH (~ 20 דקות). ניתן להשיג את התוצאות המוצגות כאן גם באמצעות TH. בעת שימוש TNH, להיזהר לא לחשוף את dimerizer לאור כדי למנוע מחשוף NOVC. יש לטפל ב- TNH בחדר חשוך עם מנורת אור אדום עמומה, לאחסן את הדימרייזר בצינורות פלסטיק ענבר ולעטוף את המיכל המכיל TNH או תאים מטופלים בנייר אלומיניום. הדמיית TNH עם DIC היא בטוחה.</li>
	<li>קח aliquot של 10 mM dimerizer מ −80 °C (50 °F) לדלל מדיום הדמיה לריכוז מלאי של 10 μM ולאחסן ב -20 °C (50 °F).</li>
	<li>כאשר אתה מוכן לשימוש, לדלל dimerizers מ 10 תמיסת מלאי μM לריכוז עבודה סופי של 100 ננומטר במדיום צמיחה (עבור הדמיה קבועה) או מדיום הדמיה. לטפל בתאים עם 100 ננומטרים dimerizers (ריכוז סופי) על הבמה עבור הדמיה חיה או דגירה במשך 4-5 שעות עבור immunofluorescence (IF) פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH). הערה: הריכוז של dimerizers בשימוש משפיע על יעילות עמעום ובכך הפרדת שלב. ריכוז הדמירייזר המאפשר יעילות עמעום מקסימלית תלוי בסוג התא וריכוז חלבון עוגן, ולכן יהיה צורך לקבוע אותו לניסויים שונים. דרך פשוטה אחת היא לדגור על תאים המבטאים את חלבון העוגן ואת mCherry-eDHFR (מבלי להתמזג לשלב המפריד בין חלבון או להתמזג למוטנט מפריד שאינו פאזה) ולזהות את ריכוז הדימרייזר שבו מושגת עוצמת mCherry הגבוהה ביותר בעוגן. גישה שיטתית יותר היא לדגור על תאים המבטאים את העוגן רק בריכוזים שונים של דימריזרים ולאחר מכן עם צבע מחייב Halo כדי לעזור לקבוע את ריכוז הדימרייזר שבו עוצמת הצבע מחייב Halo מתחיל לרמה (כלומר, כל עוגנים הילו-התמזגו תפוסים על ידי דימרייזר ולא נשאר יותר עבור צבע כריכת Halo)32.</li>
	<li>כדי להפוך את הדממה, דגירה תאים עם dimerizers במשך 2-5 שעות (עם או בלי הדמיה חיה) או עד גודל טיפה הרצוי מושגת ולהוסיף 100 μM חינם TMP (ריכוז סופי) מדולל מדיום הדמיה לתאים.</li>
</ol>3. אימונופלואורסצנטיות (IF) 
<ol><li>זרע 105 תאים על כוסות כיסוי עגולות בקוטר 12 מ"מ מצופה פולי-D-ליסין בצלחת 6-well. לאחר מכן להעביר את שני plasmids (Halo-GFP-TRF1 עם mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה) ולחכות 24-48 שעות לפני שתמשיך immunofluorescence. הערה: המתן יותר מיממה לאחר ההדבקה יכול לקבל ביטוי גבוה יותר.</li>
	<li>לדלל dimerizers עם בינוני צמיחה כדי להגיע לריכוז הסופי של 100 ננומטר, להוסיף dimerizers מדולל לתאים לדגור ב 37 °C (4-5 שעות. הערה: הפרדת פאזה מושרה במהירות לאחר הוספת דימריזרים (< 30 דקות). דגירה ארוכה יותר מסייעת טיפות גסות לגדלים גדולים יותר. בעקבות גידול טיפה עם הדמיה חיה יכול לשמש כדי לקבוע את הזמן שלוקח טיפות להגיע למצב הרצוי.</li>
	<li>תקן תאים בתמיסת PBS המכילה 4% פורמלדהיד ו-0.1% טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחדר לתאים. לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS. הערה: לאחר שלב זה, ניתן להשהות אותו ותאים ניתן לאחסן ב 4 °C (70 °F) עד שבוע. אזהרה: פורמלדהיד מזיק על ידי שאיפה ואם נבלע, הוא גם מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור ומהווה סכנה אפשרית לסרטן. צריך ללבוש ציוד מגן אישי, להשתמש רק במכסה אדים כימי. גם לשים אותו במיכל פסולת לאחר השימוש, לא להיפטר ממנו בכיור.</li>
	<li>כביסה מכסה פעמיים עם 50 μL TBS-Tx ופעם אחת עם 50 μL חיץ דילול נוגדנים (AbDil). TBS-Tx נעשה על ידי TBS, 0.1% טריטון X-100 ו 0.05% Na-azide. עבדיל נעשה על ידי TBS-Tx, 2% BSA ו 0.05% Na-azide.</li>
	<li>דגירה כל כיסוי עם 50 μL ראשי אנטי PML (1:50 דילול בעבדיל) / אנטי SUMO1 (1:200 דילול ב AbDil) / נוגדן נגד SUMO2/3 (1:200 דילול ב AbDil) ב 4 °C בתא לח לילה. נוגדן mCherry יכול לשמש גם (1:200 דילול ב AbDil) כדי לעזור לזהות אות mCherry עבור דגים. הערה: דגים מרווה את האות פלואורסצנטי mCherry, מה שמקשה להבדיל בין תאים transfectds mCherry מאלה שאינם transfected בניסויים דגים. מומלץ להשתמש בנוגדן mCherry. לחלופין, ניתן ליצור קו תאים יציב המבטא eDHFR המכיל חלבון.</li>
	<li>לשטוף מכסה 3 פעמים עם AbDil כדי להסיר נוגדן ראשוני מאוגד.</li>
	<li>תאי דגירה עם נוגדן משני [נוגדן אנטי עכבר IgG (H+L) מצומד עם אלכסה פלור 647 עבור PML ו- SUMO, נוגדן משני נגד ארנב IgG (H + L) מצומד עם אלכסה פלור 555 עבור mCherry, שניהם בשעה 1:1000 דילול בעבד] במשך שעה אחת בקופסה כהה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כביסה מכסה 3 פעמים עם TBS-Tx.</li>
	<li>שקופיות תווית, לדלל DAPI במדיה הרכבה כדי להגיע לריכוז הסופי DAPI של 1 מיקרוגרם / מ"ל. לאחר מכן שים DAPI מדולל של 2 μL בשקופית. הפוך את כיסויי הכיסוי מעל ומניח אותם על טיפת DAPI, לשאוף נוזל נוסף מקצה כיסוי.</li>
	<li>אוטמים עם לק, נותנים לו להתייבש ולשטוף מראש כיסוי עם מים. שמור במקפיא להדמיה.</li>
</ol>4. פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH)
<ol><li>זרע 105 תאים על כוסות כיסוי עגולות בקוטר 12 מ"מ מצופה פולי-D-ליסין בצלחת 6-well. להעביר תאים עם Halo-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה plasmids ולחכות 24-48 שעות לפני שתמשיך דגים. שלב הדממה זהה לזה המתואר ב- 3.2. הערה: כאן TRF1 אינו התמזג עם GFP ולכן הערוץ הירוק הוא שוחרר לבדיקת DNA טלומר.</li>
	<li>תקן תאים עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושטוף 4 פעמים עם PBS. עבור IF-FISH, המשך לפרוטוקול IF מכאן ולאחר שטיפת נוגדן משני ב- IF (3.8), תאי refix עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>מייבש כיסויים בסדרת אתנול (70%, 80%, 90%, 2 דקות כל אחד).</li>
	<li>כיסויי דגירה עם גשושית PNA 488-telC (יחס של 1:2000) בפתרון היברידיזציה של 5 מיקרו-אל ב-75 °C (75 °F) למשך 5 דקות. פתרון הכלאה מכיל 70% פורממיד דה-יונאי, 10 מ"מ טריס (pH 7.4), 0.5% חסימת ריאגנט. ואז לדגור לילה בחדר לח בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף כיסויים עם חוצץ לשטוף (70% פורממיד, 10 mM Tris) 2 דקות במשך 3 פעמים בטמפרטורת החדר ולהרכיב עם DAPI 1 מיקרוגרם / מ"ל במדיה הרכבה להדמיה. הערה: פרוטוקול FISH הוא פרוטוקולשפורסם 33'34.</li>
</ol>5. הדמיה חיה
<ol><li>כאשר התאים מוכנים להדמיה, הרכב מכסה בתאים מגנטיים עם תאים מתוחזקים במדיום הדמיה של 1 מ"ל ללא פנול אדום על במה מחוממת בתא סביבתי.</li>
	<li>הגדירו מיקרוסקופ ומנגנוני בקרה סביבתית. התמונות נרכשו עם מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה 100x 1.4 NA, פיזו Z-Drive, אלקטרון הכפלת התקן מטען מצמיד (EMCCD) מצלמה, מודול מיזוג לייזר מצויד 455, 488, 561, 594 ו 647 ננומטר לייזרים הנשלטים על ידי תוכנת הדמיה. סמכויות הפלט של כל הלייזרים נמדדות בקצה הסיבים.</li>
	<li>אתר תאים עם אות GFP בהיר בטלומרים ואות mCherry מקומי באופן מפוזר בנוקלופלזם. מצא סביב 20 תאים, לשנן כל מיקום עם x, Y, z מידע ולהגדיר פרמטרים עבור הדמיה לשגות זמן עם מרווח של 0.5 מיקרומטר עבור סך של 8 מיקרומטר ב- Z ומרווח זמן של 5 דקות עבור 2-4 שעות עבור ערוצי GFP ו mCherry. השתמש ב-30% מ-594 ננומטר וב-50% מעוצמת הספק של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 200 אלפיות שני ומצלמה משיגה 300. הערה: כוח הפלט של יחידות לייזר הוא 20 mW. מוקדי GFP בהירים מציינים גודל עוגן גדול יותר שיכול לגרעין עיבוי בקלות רבה יותר. מצא תאים עם מגוון רחב של אות mCherry מכיוון שהפרדת פאזה תלויה בריכוז ה- SIM בתא. תאים עם אות mCherry עמום מדי או בהיר מדי עשויים שלא להפריד פאזה. כדי להימנע מהלבנת תמונות, אין להשתמש ביותר מדי כוח לייזר או זמן חשיפה ארוך מדי.</li>
	<li>התחל הדמיה וקח לולאה חד-פעמית כקדם-עמעום. השהה הדמיה, הוסף מדיית הדמיה של 0.5 מ"ל המכילה 15 μL של 10 מיקרומטר דימרייזר לתא ההדמיה על הבמה כך שריכוז הדמירייזר הסופי הוא 100 ננומטר. לחדש את ההדמיה.</li>
	<li>כאשר אתה מוכן להפוך את הדממה, השהה הדמיה, הוסף מדיית הדמיה של 0.5 מ"ל המכילה 2 μL של TMP מלאי 100 מ"מ לתא ההדמיה על הבמה כדי לקבל ריכוז סופי של 100 מיקרומטר TMP. המשך תאי הדמיה במשך 1-2 שעות.</li>
</ol>6. הדמיה קבועה
<ol><li>אותו מיקרוסקופ מוגדר כהדמיה חיה, חימום במה אינו נחוץ. השתמש ב- 488 ננומטר כדי לדמיין טלומר FISH, 561 ננומטר עבור mCherry IF ו- 647 ננומטר עבור PML או SUMO IF. הערה: אם לא משתמשים בנוגדן mCherry, רק תמונה ישירה חלבון mCherry אבל אות אולי עמום בגלל מרווה ב FISH.  עדיין להשתמש 561 ננומטר ולא 594 ננומטר לייזר כדי לדמיין mCherry כדי למנוע דימום אות דרך של Cy5 כדי mCherry.</li>
	<li>אתר סביב 30-50 תאים עם אות אדום (mCherry או mCherry IF) כדי לבחור עבור תאים שהודבקו.</li>
	<li>תמונות צולמו עם מרווח של 0.3 מיקרומטר עבור סך של 8 מיקרומטר ב- Z לאיסוף אותות נוספים. השתמש ב- 80% מ- 647 ננומטר, 80% מ- 561 ננומטר ו- 70% מעוצמת הספק של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 600 אלפיות שני ומצלמה להשיג 300.</li>
</ol>7. לעבד תמונות בזמן לשגות
<ol><li>הגדרת בינארי עבור טלומרים בחרו תא אחד עם כל הזמן ומידע מחסנית z, בחרו רק בערוץ GFP ויצרו שכבה בינארית על-ידי הגדרת סף. התאם את הערכים התחתונים והעליון של הסף והשתמש בפונקציות כגון "חלק", "נקי" ו"מלא חורים" כדי לראות עד כמה הסף מרים את האובייקטים הרצויים דרך כל נקודות הזמן.</li>
	<li>חיסור רקע בחר את כל הערוצים, צייר אזור מלבן של עניין (ROI) ברקע (מלבד התא). הגדר ROI זה כרקע ולאחר מכן הפחת את עוצמת הרקע.</li>
	<li>קישור טלומר בינארי לעוצמת הטלומר בחר טלומר בינארי וקשר אותו לערוץ GFP לחישוב עוצמת GFP באובייקטים הבינאריים כעוצמת טלומר.</li>
	<li>חישוב מספר טלומר ועוצמת לאורך זמן ציין איזה מידע יש לייצא, כגון זמן, מזהה אובייקט, עוצמת ממוצעת, עוצמת סכום וייצוא נתונים. השתמש בתוכנת התוויית איור כדי לקרוא את הטבלה המיוצאת וליצור דמויות של מספר טלומר ועוצמת טלומר (לסכם את עוצמת הנפח בכל טלומר ולאחר מכן ממוצע על כל הטלומרים בתא) לאורך זמן.</li>
</ol>8. עיבוד תמונות של תאים קבועים
<ol><li>הגדרת בינארי עבור APBs בחר תאים שהודבקו לניתוח על-ידי חיפוש אות בערוץ 561nm. לאחר ההליך ב- 7.1, הגדר סף הן GFP (דג DNA טלומר) והן Cy5 (PML או SUMO IF) כדי ליצור בינארי עבור טלומרים וגופי PML או SUMO, בהתאמה. מזגו שכבות בינאריות GFP ו-Cy5 ויצרו שכבה חדשה המכילה חלקיקים שיש להם אות GFP ו-Cy5 כדי לייצג לוקליזציה משותפת של גוף PML בטלומרים, וכך APBs.</li>
	<li>חישוב מספר ועוצמה של APB/SUMO הפחת רקע תמונה לאחר 7.2. קשר שכבה בינארית APB /SUMO לערוץ Cy5 לאחר 7.3. חשב מספר APB/SUMO ואת עוצמתו. ייצוא והתוויה של נתונים לאחר 7.4.</li>
</ol>

<ol><li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), (2017).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates in the nucleus.</a> Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).</li>
<li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1%CE%B1+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Hur, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK-Regulated+phase+separation+seeded+by+histone+genes+ensures+precise+growth+and+function+of+histone+locus+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies.</a> Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).</li>
<li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+phase+separation+in+live+cells%3A+diagnosis%2C+caveats%2C+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li>
<li>Peng, A., Weber, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+and+against+liquid-liquid+phase+separation+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Non-coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus.</a> Non-coding RNA. 5 (4), (2019).</li>
<li>Erdel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+heterochromatin+adopts+digital+compaction+states+without+showing+hallmarks+of+HP1-driven+liquid-liquid+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation.</a> Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+body+phase+separation+drives+telomere+clustering+in+ALT+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).</li>
<li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 5, 1-9 (2014).</li>
<li>Yeager, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase-negative+immortalized+human+cells+contain+a+novel+type+of+promyelocytic+leukemia+%28PML%29+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body.</a> Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).</li>
<li>Zhang, J. M., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+outlooks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks.</a> Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).</li>
<li>Corpet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML+nuclear+bodies+and+chromatin+dynamics%3A+catch+me+if+you+can%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can.</a> Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).</li>
<li>Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML+nuclear+body+biogenesis%2C+carcinogenesis%2C+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).</li>
<li>Dilley, R. L., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALTernative+telomere+maintenance+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">ALTernative telomere maintenance and cancer.</a> Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).</li>
<li>Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+DNA+repair+pathways+converge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge.</a> Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).</li>
<li>Draskovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+PML+body+function+in+ALT+cells+reveals+spatiotemporal+requirements+for+telomere+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726(2009).</li>
<li>Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres+through+two+distinct+break-induced+replication+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways.</a> Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).</li>
<li>Loe, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+heterogeneity+in+ALT+cells+is+maintained+by+PML-dependent+localization+of+the+BTR+complex+to+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres.</a> Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).</li>
<li>Potts, P. R., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SMC5%2F6+complex+maintains+telomere+length+in+ALT+cancer+cells+through+SUMOylation+of+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).</li>
<li>Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+a+PML+nuclear+subcompartment+occurs+through+multiple+pathways+and+induces+telomere+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation.</a> Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).</li>
<li>Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+PML-nuclear+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of PML-nuclear body formation.</a> Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).</li>
<li>Shima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+SUMO+modification+system+is+required+for+the+accumulation+of+RAD51+at+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).</li>
<li>Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+SUMOylation+in+telomere+maintenance+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction.</a> Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).</li>
<li>Sarangi, P., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-mediated+regulation+of+DNA+damage+repair+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Banani, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+control+of+phase-separated+cellular+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Compositional control of phase-separated cellular bodies.</a> Cell. 166 (3), 651-663 (2016).</li>
<li>Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+telomeres+in+phase-separated+nuclear+condensates+engage+mitotic+DNA+synthesis+through+BLM+and+RAD52%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).</li>
<li>Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+SUMO-binding+motif+that+recognizes+SUMO-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).</li>
<li>Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+-+Optogenetic+control+of+mitosis+with+photocaged+chemical+dimerizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mitosis+and+Meiosis+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers.</a> Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+kinetochore+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of kinetochore function.</a> Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).</li>
<li>Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interchromosomal+homology+searches+drive+directional+ALT+telomere+movement+and+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis.</a> Cell. 159 (1), 108-121 (2014).</li>
<li>Dilley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+telomere+synthesis+underlies+alternative+telomere+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance.</a> Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).</li>
<li>Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+control+of+protein+localization+in+living+cells+using+a+photocaged-photocleavable+chemical+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optoDroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+nuclear+condensates+mechanically+sense+and+restructure+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome.</a> Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+tagging%3A+a+step-by-step+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה הדגים היווצרות ופירוק של עיבויים בטלומרים עם מערכת עמעום כימית. קינטיקה של הפרדת פאזה ואשכול טלומר המושרה על ידי טיפה-היתוך מנוטרים באמצעות הדמיה חיה. לוקליזציה מרוכזת והרכב נקבעים עם דג DNA וחלבון IF.
קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא לקבוע חלבון וריכוז עמעום. ההצלחה בגרימת הפרדת פאזה מקומית בלוקוס גנומי מסתמכת על העלייה בריכוז המקומי של השלב המפריד בין חלבון מעל הריכוז הקריטי להפרדת פאזה (איור 1B). הריכוז העולמי של השלב המפריד בין חלב...

חלבונים וחומצות גרעין רבים עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) ומרכיבים את עצמם לתוך עיבויים ביומולקולריים כדי לארגן ביוכימיה בתאים1,2. LLPS של חלבונים מחייב כרומטין מוביל להיווצרות של עיבויים הקשורים loci גנומי ספציפי והם מעורבים פונקציות כרומטין מקומיות שונות3. לדוגמה, LLPS של חלבון HP1 עומד בבסיס היווצרות של תחומים הטרוכרומטינים כדי לארגן את הגנום4,5, LLPS של גורמי שעתוק יוצר מרכזי שעתוק כדי לווסת את שעתוק6, LLPS של mRNAs המתהווה וחלבון מסרקים מרובי מיניים מייצר גופי לוקוס histone כדי לווסת את שעתוק ועיבוד של histone mRNAs7.  עם זאת, למרות דוגמאות רבות של עיבוי הקשורים כרומטין מתגלה, המנגנונים הבסיסיים של היווצרות עיבוי, רגולציה ותפקוד להישאר מובן היטב. בפרט, לא כל עיבוי הקשורים כרומטין נוצרים באמצעות LLPS והערכות זהירה של היווצרות עיבוי בתאים חיים עדיין נדרשים8,9. לדוגמה, חלבון HP1 בעכבר מוצג כבעל יכולת חלשה בלבד ליצור טיפות נוזליות בתאים חיים ומוקדי הטרוכרומטין מתנהגים כמו כדוריות פולימר שקרסו10. לכן, כלים כדי לגרום de novo עיבויים על כרומטין בתאים חיים רצויים, במיוחד אלה המאפשרים שימוש בהדמיה חיה וביקורת ביוכימית כדי לפקח על הקינטיקה של היווצרות עיבוי, התכונות הפיזיות והכימיות של העיבויים המתקבלים, ואת ההשלכות התאיות של היווצרות עיבוי.
פרוטוקול זה מדווח על מערכת עמעום כימית כדי לגרום לעיבוי חלבון בכרומטין11 (איור 1A). הדימרייזר מורכב משני ליגנדים מקושרים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים: טרימתופרים (TMP) וליגנד Halo ויכול לעמעם חלבונים המותכים לקולטני הקוגניט: Escherichia coli dihydrofolate reductase (eDHFR) ואנזים אלקילדהלוגנאז חיידקי (אנזים Halo), בהתאמה12. האינטראקציה בין האנזים Halo ligand ואנזים Halo היא קוולנטית, ומאפשרת אנזים Halo לשמש עוגן על ידי היתוך אותו לחלבון מחייב כרומטין כדי לגייס חלבון הפרדת פאזה הותך eDHFR לכרומטין. לאחר הגיוס הראשוני, ריכוז מקומי מוגבר של השלב המפריד חלבון עובר את הריכוז הקריטי הדרוש להפרדת פאזה ובכך מגרגר עיבוי בעוגן (איור 1B). על ידי היתוך חלבונים פלואורסצנטיים (למשל mCherry ו- eGFP) ל- eDHFR והילה, ניתן לדמיין התגרענות וצמיחה של עיבויים בזמן אמת עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. מכיוון שהאינטראקציה בין eDHFR ל- TMP אינה קוולנטית, ניתן להוסיף TMP ללא עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. לאחר מכן זה ישחרר את חלבון הפרדת הפאזה מהעוגן ולהמיס את העיבוי הקשור לכרומטין.
השתמשנו בכלי זה כדי לגרום להיווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית דה נובו (PML) בטלומרים בתאי סרטן שליליים טלומראז המשתמשים בהארכה חלופית של מסלול הטלומרים (ALT) לתחזוקת הטלומר13,14.  גופים גרעיניים PML הם תאים ללא ממברנה המעורבים בתהליכים גרעיניים רבים15,16 והם מקומיים באופן ייחודי טלומר ALT כדי ליצור APBs, עבור גופי PML הקשורים טלומר ALT17,18. אשכול טלומרים בתוך APBs, ככל הנראה כדי לספק תבניות תיקון עבור סינתזת DNA טלומר מונחה הומולוגיה ב ALT19. ואכן, סינתזת DNA טלומר זוהתה APBs ו APBs לשחק תפקידים חיוניים העשרת גורמי תיקון DNA בטלומרים20,21. עם זאת, המנגנונים שבביד הרכבת APB ואשכול הטלומר בתוך APBs לא היו ידועים. מאז חלבוני טלומר בתאי ALT משתנים באופן ייחודי על ידי מחליף קטן דמוי אוביקוויטין (SUMOs)22, רכיבי APB רבים מכילים אתרי סומוילציה 22,23,24,25 ו / או מוטיבים אינטראקציה SUMO (SIMs)26,27 ואינטראקציות SUMO-SIM כונן הפרדת שלב28, שיערנו כי סומוילציה על טלומרים מוביל להעשרה של SUMO / SIM המכיל חלבונים ו אינטראקציות SUMO-SIM בין חלבונים אלה מובילות להפרדת פאזה.  חלבון PML, שיש לו שלושה אתרי סומוילציה ואתר SIM אחד, ניתן לגייס טלומרים סומויליים כדי ליצור APBs והתמזגות של APBs נוזלי מוביל להתקבצות טלומרים. כדי לבחון השערה זו, השתמשנו במערכת הדממה הכימית כדי לחקות היווצרות APB הנגרמת על ידי סומוילציה על ידי גיוס SIM לטלומרים (איור 2A)11. GFP מותך Haloenzyme להדמיה ולחלבון טלומר מחייב TRF1 כדי לעגן את הדמיר לטלומרים. ה-SIM מותך ל-eDHFR ול-mCherry. קינטיקה של היווצרות עיבוי ו clustersion טיפה המושרה טלומר קיבוץ הם אחריו עם הדמיה תא חי.  הפרדת הפאזה הפוכה על-ידי הוספת TMP חינם עודף כדי להתחרות בכריכה של eDHFR. אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH) משמשים לקביעת הרכב עיבוי ואיגוד טלומרי. גיוס SIM מעשיר את SUMO בטלומרים והמרוכזים המושרים מכילים PML ולכן הם APBs. גיוס מוטציה SIM שאינה יכולה לקיים אינטראקציה עם SUMO אינה מעשירה את SUMO בטלומרים או גורמת להפרדת פאזה, מה שמצביע על כך שהכוח המניע הבסיסי ל עיבוי APB הוא אינטראקציית SUMO-SIM. מסכים עם תצפית זו, פוליסומו-פוליסים פולימרים שהתמזגו לגורם מחייב TRF2 RAP1 יכול גם לגרום להיווצרות APB29. בהשוואה למערכת ההיתוך polySUMO-polySIM שבה הפרדת פאזה מתרחשת כל עוד מיוצרים מספיק חלבונים, גישת הדמיזציה הכימית המוצגת כאן גורמת להפרדת פאזה על פי דרישה ובכך מציעה רזולוציה זמנית טובה יותר לניטור הקינטיקה של הפרדת פאזה ותהליך קיבוץ הטלומר. בנוסף, מערכת עמעום כימית זו מאפשרת גיוס חלבונים אחרים כדי להעריך את יכולתם בגרימת הפרדת פאזה ואשכולות טלומר. לדוגמה, חלבון מופרע המגויס לטלומרים יכול גם ליצור טיפות וטלומרים מקבצי מבלי לגרום להיווצרות APB, דבר המצביע על קיבוץ טלומר שאינו תלוי בכימיה של APB ונשען רק על נכס נוזלי APB11.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין, 0.1% EDTA ב-HBSS ללא סידן, מגנזיום ונתרן</td><td>ביקרבונט קורנינג</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td>הכן 1% ב-1x PBS</td></tr><tr><td>6 צלחת תרבית באר</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד mCherry</td><td>Abcam</td><td>Ab183628</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד PML</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc966</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד SUMO1 Abcam</td><td></td><td>Ab32058</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד SUMO2/3</td><td>שלד ציטו</td><td>Asm23</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם</td><td>רוש</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>צינור BTX מיקרו 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89511-258</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מעגלי מחליק</td><td>Thermo Scientific</td><td>3350</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>ניקון</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת EMCCD</td><td>iXon Life&nbsp;</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>4355221</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA</td><td>Gibco</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד,</td><td>MilliporeSigma</td><td>נטול יונים 46-101-00ML</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG (H+L), נוגדן משני רקומביננטי, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A28181</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG (H+L), נוגדן משני רקומביננטי, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>דיוק גבוה ישר מחודד מחודד אולטרה עדין פינצטה/מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>מודול מיזוג לייזר&nbsp;</td><td>ניקון</td><td>NIIMHF47180</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ L-15 בינוני</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת שרטוט דמויות, MATLAB</td><td></td> תיבת שקופיות מיקרוסקופ MathWorks <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>34487</td><td></td></tr><tr><td>לק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-949-071</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה, NIS-Elements&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיית סרום מופחתת</td><td>Gibco</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Z-Drive&nbsp;</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>91985</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט</td><td>VWR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ פינתיות קצוצות רגילות וחלביות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-D-ליזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>דיסק מסתובב</td><td>להתקנה</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מרובע מחליק</td><td>Thermo Scientific</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x פתרון</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TelC-Alexa488</td><td>PNA Bio</td><td>F1004</td><td></td></tr><tr><td>TMP</td><td>מסונתז על ידי מעבדת</td><td></td> Chenoweth <td>זמין לפי בקשה</td></tr><tr><td>TNH</td><td>מסונתז על ידי מעבדת</td><td></td> Chenoweth <td>זמין לפי בקשה</td></tr><tr><td>Tris Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>92-901-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 10% פתרון</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-846-350ML</td><td>הכן 0.5% בקו תאים 1x PBS</td></tr><tr><td>U2Os</td><td>ממעבדת E.V. Makayev (האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפור)</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade הרכבה</td><td>מעבדות וקטור</td> בינוני <td>NC9524612</td><td></td></tr></tbody></table>

חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

עיבויים הקשורים לכרומטין מעורבים בתהליכים גרעיניים רבים, אך המנגנונים הבסיסיים נותרים חמקמקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים בטלומרים. הדימרייזר הכימי מורכב משני ליגנדים מקושרים שיכולים להיקשר כל אחד לחלבון: ליגנד Halo ל-Halo-enzyme וטימופרים (TMP) ל-E. coli dihydrofolate reductase (eDHFR), בהתאמה. היתוך של אנזים Halo לחלבון טלומר מעגן דימריזרים לטלומרים באמצעות כריכת אנזים הילה ליגנד קוולנטית. כריכה של TMP ל- eDHFR מגייסת שלב מותך eDHFR המפריד חלבונים לטלומרים ודורשת היווצרות עיבוי. מכיוון שאינטראקציית TMP-eDHFR אינה קוולנטית, ניתן להפוך עיבוי באמצעות TMP חינם עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. דוגמה של גרימת היווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) בטלומרים וקביעת צמיחה עיבוי, פירוק, לוקליזציה והרכב מוצגת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לגרום עיבוי במקומות גנומיים אחרים על ידי היתוך Halo לחלבון שנקשר ישירות לכרומטין המקומי או dCas9 כי הוא ממוקד לוקוס גנומי עם RNA מדריך. על ידי הצעת הרזולוציה הזמנית הנדרשת להדמיה חיה של תא יחיד תוך שמירה על הפרדת פאזה באוכלוסיית תאים לבדיקות ביוכימיות, שיטה זו מתאימה לבדיקת היווצרות ותפקוד של עיבויים הקשורים לכרומטין.

תמונות מייצגות של לוקליזציה טלומרית של SUMO שזוהתה על ידי דגי DNA טלומר וחלבון SUMO IF מוצגות באיור 2. תאים עם גיוס SIM העשירו את SUMO1 ו- SUMO 2/3 בטלומרים בהשוואה לתאים עם גיוס מוטציות SIM. הדבר מצביע על כך שהעשרת SUMO הנגרמת על-ידי DIMERIZATION בתחום הטלומרים תלויה באינטראקציות SUMO-SIM.
סרט זמן מייצג של TRF1 ו- SIM לאחר דימרציה מוצג בסרטון 1. תמונות בארבע נקודות זמן מוצגות באיור 3A. ה-SIM גויס בהצלחה לטלומרים וגם ...

פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין.  היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

פרוטוקול זה מתאר את מערכת הדממה הכימית כדי לגרום לעיבוי חלבונים בטלומרים. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לגרום עיבויים על loci גנומי אחרים, והוא מתאים לבדיקת היווצרות ותפקוד של מעבים הקשורים כרומטין. שיטה זו מציעה רזולוציה זמנית הנדרשת להדמיית תאים חיים ושומרת על הפרדת פאזה באוכלוסיית התאים לבדיקות ביוכימיות.כדי להתחיל, להמיס dimerizers ב- DMSO ב 10 מילימולר ולאחסן אותם בצינורות microcentrifuge פלסטיק במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לדלל aliquot של 10 מילימולר דימרייזר בהדמיה בינונית לריכוז מלאי של 10 micromolar ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. כאשר מוכן לשימוש, לדלל dimerizers לריכוז עבודה סופי של 100 nanomolar במדיום צמיחה או מדיום הדמיה.זרע 10 עד התאים החמישיים במשקפי כיסוי עגולים בקוטר 12 מ"מ מצופים בפולי-D-ליסין בצלחת של שש בארות. לאחר מכן להעביר את התאים עם Halo-GFP-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDFR-SIM מוטציה plasmids ולחכות 24 עד 48 שעות לפני שתמשיך immunofluorescence. מוסיפים את 100 הדימרימרים הננומולרים מדוללים לתאים ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות.לאחר הדגירה, תקן את התאים בתמיסת PBS המכילה 4%פורמלדהיד ו- 0.1%טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל לתאים. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. כיסוי לשטוף מחליק פעמיים עם 50 microliters של TBS-Tx ופעם אחת עם 50 microliters של חוצץ דילול נוגדנים.לדגור כל פיסת כיסוי עם 50 microliters של אנטי PML ראשוני, אנטי SUMO-1, או נוגדן נגד SUMO-2 ו 3 בארבע מעלות צלזיוס בתא לח בן לילה. כיסוי לשטוף מחליק שלוש פעמים עם חוצץ דילול נוגדנים כדי להסיר נוגדן ראשי מאוגד, ולאחר מכן לדגור על התאים עם נוגדן משני במשך שעה אחת בקופסה כהה בטמפרטורת החדר. לאחר הכתם, לשטוף כיסוי מחליק שלוש פעמים עם TBS-Tx.סמן שקופיות תווית על-ידי הוספת שני מיקרוליטרים של מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI, ולאחר מכן הפוך את פתקי הכיסוי והנח אותם על טיפת DAPI. שאפו נוזל נוסף מקצה החלקה. לאטום את המגלשה עם לק, לאפשר לו להתייבש, ולשטוף את החלק העליון של כיסוי להחליק עם מים.מניחים את השקופיות במקפיא עד להדמיה. זרע 10 לתאים החמישיים על משקפי כיסוי עגולים 12 מ"מ מצופים פולי-D-ליסין בצלחת שש באר ולהעביר אותם עם Halo-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה plasmids. תקן את התאים עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף אותם ארבע פעמים עם PBS.עבור IF-FISH, להכתים את התאים עם נוגדנים ראשוניים ומשניים refix אותם עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף אותם ארבע פעמים עם PBS ולייבש את כיסוי החלקות בסדרת אתנול. לדגור על פתקי הכיסוי עם 488 טלומר C-PNA בדיקה בחמישה microliters של פתרון הכלאה ב 75 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן לדגור את כיסוי מחליק לילה בתא לח בטמפרטורת החדר. לשטוף את כיסוי מחליק שלוש פעמים עם חוצץ לשטוף במשך שתי דקות לכל לשטוף בטמפרטורת החדר ולהרכיב אותם עם מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI במדיה הרכבה להדמיה.להדמיה חיה, הר את החלקות הכיסוי בתאים מגנטיים על במה מחוממת בתא סביבתי, שמירה על התאים במיליליטר אחד של מדיום הדמיה ללא פנול אדום. הגדר את מנגנון המיקרוסקופ והבקרה הסביבתית כמתואר בכתב היד של הטקסט. אתר תאים עם אות GFP בהיר על הטלומרים ואות mCherry מפוזר בציטוסול.מצא כ-20 תאים, שינון כל מיקום עם מידע XYZ והגדר פרמטרים להדמיה של זמן-זמן. השתמש בריווח של 0.5 מיקרומטרים עבור סך של שמונה מיקרומטרים ב- Z ומרווח זמן של חמש דקות למשך שעתיים עד ארבע שעות הן עבור ערוצי GFP והן עבור ערוצי mCherry. השתמש ב-30% מ-594 ננומטר וב-50% מעוצמת הכוח של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 200 אלפיות השנייה ורווח מצלמה של 300.התחל הדמיה ולקחת לולאה חד פעמית כמו קדם עמעום. לאחר מכן השהו הדמיה, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מדיית הדמיה המכילה 15 מיקרוליטרים של דימרייזר 10 מיקרומולר לתא ההדמיה, דאגו לא לגעת בשלב, ולחדש את ההדמיה. כאשר אתה מוכן להפוך את הדממה, השהה הדמיה והוסף 0.5 מיליליטר של מדיית הדמיה המכילה שני מיקרוליטרים של TMP מלאי 100 מילימולר לתא ההדמיה.המשך הדמיה של התאים במשך שעה עד שעתיים. להדמיה קבועה, השתמש באותה הגדרת מיקרוסקופ כמו הדמיה חיה, אך ללא חימום הבמה. אתר סביב 30 עד 50 תאים עם האות האדום כדי לבחור עבור תאים transfected.לרכוש תמונות עם מרווח של 0.3 מיקרומטר עבור סך של שמונה מיקרומטר ב Z.Use 80% של 647 ננומטר, 80% של 561 ננומטר, ו 70% של עוצמת כוח 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 600 אלפיות השנייה ורווח מצלמה של 300. לוקליזציה טלומרית של SUMO זוהתה באמצעות דג DNA טלומר ואימונופלואורסצנטיות חלבון SUMO. תאים עם גיוס SIM מועשר SUMO-1 ו SUMO-2 ו-3 בהשוואה לתאים עם גיוס מוטציות SIM, מה שמצביע על כך שעמעום SIM גרם להעשרת SUMO בטלומרים תלוי באינטראקציות SUMO-SIM.סרט לשגות זמן של TRF-1 ו- SIM לאחר דימרציה מוצג כאן. SIM גויס בהצלחה לטלומרים, וגם מוקדי ה-SIM וה-TRF-1 הפכו גדולים ובהירים יותר, כצפוי להיווצרות טיפות נוזליות ולצמיחה. בנוסף, היתוך של מוקדי TRF-1 נצפתה, מה שהוביל להתקבצות טלומר, כפי שמוצג במספר הטלומר המופחת ועוצמת הטלומר המוגברת לאורך זמן.לעומת זאת, מוטציית SIM גויסה לטלומרים לאחר דימרציה, אך לא עורר היווצרות טיפה או קיבוץ טלומר, מה שמצביע על כך שהפרדת פאזה ואשכול טלומר מונעים על ידי אינטראקציות SUMO-SIM. היפוך הפרדת הפאזה ואשכול הטלומר נצפתה לאחר הוספת TMP חינם עודף. מספר הטלומר גדל ועוצמת הטלומר ירדה עם הזמן.תמונות מייצגות של APBs שזוהו על ידי דנ"א טלומר דגים וחלבון PML אם מוצגים כאן. תאים עם SIM מגויסים יש יותר APBs מאשר תאים עם מוטציה SIM מגויס, מה שמרמז על דימרציה המושרה עיבויים הם אכן APBs. בעת ביצוע פרוטוקול זה, אל תחשוף דימרימרים רגישים לאור לאור.עבודה בחדר חשוך עם מנורה הפולטת אור אדום ועוטפת תאים בנייר אלומיניום במהלך הדגירה. לאחר הליך זה, תיוג קרבה יכול לשמש ליצירת רשימה מקיפה של רכיבים ב- Condensate המושרה. הדמיה חיה יכולה לשמש כדי לעקוב אחר הדינמיקה של רכיבים ביסוב.שיטות אלה יכולות לסייע בקביעת התפקידים של בקרת קומפוזיציה עיבוי של שליטה.

chemical-dimerization-induced-protein-condensates-on-telomeres

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

סרטון וידאו זה מתאר שיטה להמחשת הרכבה של חלבון היתוך מעובה על מולקולות DNA באתרים ספציפיים באמצעות הדמיה של מולקולה יחידה. עיבויים אלה נוצרים כתוצאה מאינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, המאפשרות גיוס של RNA פולימראז II ושעתוק גנים משופר.

הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ"א.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

אנו מציגים פרוטוקול להכנת מעבים ביומולקולריים סינתטיים המורכבים מננו-כוכבים של DNA אמפיפילי החל מהאוליגונוקלאוטידים המרכיבים את הדנ"א שלהם. קונדנסטים מיוצרים מרכיב ננו-כוכב יחיד או משני רכיבים ומותאמים כדי לקיים שעתוק חוץ גופי של RNA מתבנית DNA משובצת.

עיבויים סינתטיים וארכיטקטורות דמויות תאים מננו-מבנים של DNA אמפיפילי

פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.

ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

הסרטון מלווה מתאר את השימוש של מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה, אשר מחיצות דגימות חלבון מורכב על בסיס משקל מולקולרי ומשחזרת את השברים בשלב נוזלי. הסרטון מתאר כיצד הטכנולוגיה עובדת, וכיצד נעשה בו שימוש, ומספק נתונים כתוצאה, עם ניתוח ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide של homogenate מופרדים בכבד בקר.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

חקור מערכת דימריזציה כימית ליצירת קונדנסטים של חלבונים על טלומרים בצורה הפיכה ומבוקרת בזמן. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של דינמיקת הקונדנסטים וחקר הרכבם הפונקציונלי.

חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים

גלה סרטונים נוספים