Name: הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למד שיטות IF ו-ChIP לחקר תגובת נזק DNA ותיקון תאי באמצעות תאי U2OS. פרוטוקולים אלה מאפשרים הדמיה וכימות של גיוס חלבוני תיקון ושינויים לאחר תרגום בלוקוסים פגועים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי המעניק ל- GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, מלגת המחקר של יאנוס בוליאי של האקדמיה ההונגרית למדעים BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, מלגת EMBO לטווח קצר 8513, וקרן טמפוס.

1. חיסונים של חלבונים ספציפיים
<ol><li>הכנת תרבית תאים והגדרה ניסיונית
	<ol>
<li>שמור על תאי U2OS בשכבות מונו-שכבתיות במדיום תרבית DMEM בתוספת סרום עגל עוברי 10%, גלוטמין 2 mM, ו 1% פתרון אנטי-אנטי-ממיקוטי. הערה: עבור אינדוקציה נזק DNA מבוסס אנדונוקלאז, להשתמש פחם מטופל או בינוני ללא סטרואידים כדי למנוע דליפה במערכת.</li>
		<li>לגדל תאים בסביבת 5% CO2 לח ב 37 °C (77 °F) עד 80% מפגש, חידוש בינוני כל 2-3 ימים.</li>
		<li>לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1x PBS. נתק תאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הפסק את פעילות טריפסין על-ידי הוספת מדיום תרבית לתאים, הניבה השעיית תאים.</li>
		<li>ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים. צלחת 2 x 104 תאים / מ"ל / גם על צלחת 24 טוב, עם כיסויים עגולים סטריליים 12 מ"מ בכל באר.</li>
		<li>דגירה תאים עבור 24 שעות ב 37 °C (5 °F) באטמוספירה לחה 5% CO2 כדי לאפשר התקשרות על כיסויים.</li>
		<li>לטפל בתאים עם 10 ננוגרם / מ"ל של neocarzinostatin (NCS) על ידי ישירות pipetting הסוכן מזיק למדיום תרבית. לדגור על התאים עם המדיום המכיל NCS במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם 1x PBS ולהוסיף טרי, תוספת מדיום לתאים. אחרת, השתמש בסוכן מתאים (כלומר, 4-OHT) כדי לגרום ל- DSBs באמצעות מערכות מבוססות אנדונוקלאז מבלי לרענן את ה-22הבינוני . הערה: לחלופין, השתמש בהקרנה כדי לגרום נזק לדנ"א, החל מ 30 דקות עד 8 שעות של זמן ההחלמה באמצעות שטף נויטרונים בין 2-20 Gy23.</li>
		<li>תאי דגירה עבור 1-8 שעות ב 37 °C באטמוספירה לחות 5% CO2 כדי לעקוב אחר הקינטיקה של תיקון DNA.</li>
	</ol></li>
	<li>קיבוע תאים הערה: 300-500 μL של פתרונות / באר יש להשתמש בשלבים הבאים (שלבים 1.2-1.5) כדי לכסות את כל התאים כראוי. כל שלב דגירה ושטיפה (למעט דגירה נוגדן) צריך להתבצע על שייקר מסלולית עם עצבנות עדינה.<ol>
<li>לאחר אינדוקציה DSB ודגורה של תאים, להסיר את המדיום מן התאים המצורפים לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS.</li>
		<li>לתקן תאים עם 4% פורמלדהיד-PBS פתרון במשך 20 דקות ב 25 °C (70 °F).</li>
	</ol></li>
	<li>פרמזביליזציה של תאים
	<ol>
<li>הסר את פתרון התיקון לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.</li>
		<li>הסר את ה-PBS והוסף 0.2% טריטון X-100 מומס ב-PBS. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>חסימה של אתרי איגוד לא ספציפיים
	<ol>
<li>לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS 1x.</li>
		<li>חסום אתרי כריכה לא ספציפיים עם 5% BSA (אלבומין שבר V של סרום בקר) מדולל ב- PBST (1x PBS בתוספת 0.1% Tween-20), ודגר את הדגימות החלחלות למשך 20 דקות לפחות.</li>
	</ol></li>
	<li>כתמי אימונופלואורסצנטיות
	<ol>
<li>הוסף את הכמות הנכונה של נוגדן ראשוני (כלומר, אנטי γH2AX, אנטי-DNA-PKcs) מדולל בפתרון 1% BSA-PBST. מניחים כל כיסוי הפוך על סרט פרפין מעל טיפה של 10 μL של נוגדן נגד γH2AX מדולל. הערה: במקרה של חיסון משותף לדלל כראוי את שני הנוגדנים באותו פתרון 1% BSA-PBST.</li>
		<li>לדגור על הדגימות בתא לחות במשך 1.5 שעות ב 4 °C (70 °F). הערה: דגירה יכולה להתבצע גם בשעה 4 °C (70 °F) במהלך הלילה.</li>
		<li>מניחים את כיסויי הגב להיות בצד למעלה לתוך צלחת 24-well לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1x PBS.</li>
		<li>הוסף את הכמות הנכונה של נוגדן משני מדולל ב- 1% BSA-PBST. מניחים כל כיסוי הפוך על סרט פרפין מעל טיפה של 10 μL של הנוגדן מדולל.</li>
		<li>לדגור על הדגימות בתא לחות ב 4 °C (5 °F) במשך 1 שעות.</li>
		<li>מניחים את כיסויי הגב להיות בצד למעלה לתוך צלחת 24-well לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1x PBS.</li>
		<li>לפני הסרת פתרון הכביסה האחרון PBS, בעדינות להוציא את כיסויים באמצעות פינצטה ומחט ולאחר מכן למקם אותם הפוך על שקופיות זכוכית עם טיפות של בינוני הרכבה (בתוספת DAPI). הערה: הימנע היווצרות של בועות אוויר. כאשר המדיום הרכבה מתייבש, מומלץ לאטום את הקצוות של כיסויים עם לק כדי למנוע צטמקות של הדגימות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. אימונופרציפיטציה של כרומטין
<ol><li>איסוף תאים, קישור צולב, תמה לתאים ולגרעין ופיצול דנ"א
	<ol>
<li>תרבית כ 5 x 106 תאים / מ"ל בצלחת 150 מ"מ עבור כל מדגם.</li>
		<li>הסר את המדיום התרבותי לשטוף את התאים פעמיים עם קרח קר 1x PBS.</li>
		<li>תקן את התאים עם תמיסת פורמלדהיד-PBS של 1%, הנח את הלוחות על שייקר מסלולית והתסיס בעדינות במשך 20 דקות. הערה: פורמלדהיד הוא הפכפך; תמיד להכין פתרון עבודה טרי. במקרים מסוימים, הפתרון פורמלדהיד מכיל מתנול כדי לייצב אותו, אבל עדיף להשתמש בפתרון ללא מתנול כדי למנוע הפרעה עם תגובות במורד הזרם.</li>
		<li>עצרו את הקיבעון עם גליצין של 125 מ"מ ודגרו על שייקר מסלולית עם עצבנות עדינה למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>מניחים את הצלחות על קרח ושטפו פעמיים עם PBS קר כקרח.</li>
		<li>לגרד את התאים בקרח קר 1x PBS ולהעביר אותם לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגות התאים ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>שאפו בזהירות את supernatant ו resuspend הכדור ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה התא [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC (קוקטייל מעכב פרוטאז)] ודגרה על קרח במשך 10 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה השעיית התא ב 2,500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>בזהירות להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 500-1,500 μL של חוצץ תמוגה גרעינית (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.8% SDS, 1x PIC) ודגרה על קרח במשך 30-60 דקות. מעבירים את הלסאט לצינור חרוט פוליסטירן המתאים לסוניקציה. הערה: מכיוון שמאגר תמן גרעיני מכיל SDS, הוא יזרום על קרח, והפתרון יהפוך ללבן. הפתרון צריך להפוך שקוף בעקבות sonication.</li>
		<li>Sonicate ליסאט כדי לגנות DNA לגודל שבר ממוצע של 300-1,000 bp. הערה: יש להגדיר את מחזורי sonication המתאים ואת התנאים על פי סוג התא ואת ציוד sonication. שברים הקטנים מ-200 bp אינם מתאימים ל-ChIP, מכיוון שניתן לשבש את האינטראקציות בין הנוקלאוזום לדנ"א.</li>
	</ol></li>
	<li>היפוך של קישור צולב, קביעה של גדלי שבר sonicated
	<ol>
<li>להוציא 100 μL של המדגם sonicated כדי לאמת את גודל שבר של כרומטין sonicated. הכרומטין הנותר צריך להיות מאוחסן ב -80 °C (80 °F).</li>
		<li>הוסף 0.5 מ"ג / מ"ל RNase A לכל 100 μL של המדגם ולדגירה אותם ב 37 °C (7 °F) במשך 20 דקות כדי להפעיל את RNase.</li>
		<li>לדגור את הדגימות ב 65 °C (65 °F) לילה.</li>
		<li>למחרת, להוסיף 500 מיקרוגרם / מ"ל של Proteinase K ו 0.5% SDS, ולדגירה את הדגימות ב 50 °C (50 °F) במשך 3 שעות.</li>
		<li>הוסף 0.5 נפח של פנול 0.5 נפח כלורופורם-איזואמיל תערובת אלכוהול (24:1) לכל מדגם.</li>
		<li>מערבולת למשך דקה אחת.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.</li>
		<li>העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.</li>
		<li>הוסף תערובת אלכוהול כלורופורם-איזואמיל בנפח אחד (24:1) לכל דגימה.</li>
		<li>מערבולת למשך דקה אחת.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.</li>
		<li>העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.</li>
		<li>הוסף 2.5 כרכים של 96% אתנול ונפח 0.1 של 3 M Na-Acetate pH 5.2.</li>
		<li>דגירה במשך 20 דקות לפחות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>הסר את האתנול לשטוף את הכדור עם 400 μL של 70% אתנול.</li>
		<li>צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>הסר את האתנול ואוויר יבש את הכדור.</li>
		<li>resuspend הכדור ב 10 μL של TE.</li>
		<li>תריץ את הדגימות על ג'ל אגרוז 0.8%. גודל הכרומטין sonicated צריך להיות סביב 500 bp. הערה: השתמש במאגר טעינה ללא כחול ברומופנול מכיוון שגודל צבע זה הוא כ- 500 bp, מה שעלול להפריע לגילוי הנכון של שברי כרומטין. במקום זאת, מומלץ להשתמש במאגר טעינה בתוספת קסילן-ציאנול, שהוא כ 3,000 bp.</li>
		<li>אם גודל הכרומטין מקובל, לדלל את דגימות הכרומטין הקפואות בשלב 2.1. ב 3 כרכים של מאגר דילול (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 מ"מ EGTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) ולערבב את הדגימות באמצעות סיבוב במשך 10 דקות ב 4 °C (5 °F). הערה: שלב זה נחוץ כדי לדלל את SDS הנוכחי במאגר תמיסת גרעין כדי למנוע הפרעה עם תגובות במורד הזרם, כולל מדידת ריכוז הכרומטין.</li>
		<li>למדוד את ריכוז ה- DNA של דגימות הכרומטין ב 260/280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת חרוזים, לפני פינוי, ו immunoprecipitation
	<ol>
<li>הכן חרוזים (כבשים נגד ארנב או עכבר IgG) עבור שלבי ניקוי מראש immunoprecipitation. לשטוף חרוזים פעמיים במשך 10 דקות ב 4 °C עם חיץ RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl ו- 1X PIC).</li>
		<li>תגדיל מחדש את החרוזים באותו אמצעי אחסון של מאגר RIPA כמו בשלב 2.3.1.</li>
		<li>ברור מראש 25-30 מיקרוגרם כרומטין של כל מדגם עם 4 μL של החרוזים באמצעות סיבוב עבור 1-2 שעות ב 4 °C (70 °F). הערה: הוסף מאגר RIPA לכל דגימת כרומטין עד 500 μL של אמצעי אחסון סופי כדי לאפשר את הדגימות לערבב כראוי תחת סיבוב. אל תשכח להוציא כרומטין עבור NAC (ללא בקרת נוגדנים) ו- TIC (בקרת קלט כוללת) במקרה של כל ערכת דגימה. TICs דורשים נפח סופי של עד 200 μL בלבד.</li>
		<li>לזרז את החרוזים עם מגנט ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.</li>
		<li>הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן לכל דגימת כרומטין (למעט NAC ו- TIC) וסובב לילה ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>למחרת, להוסיף 40 μL של חרוזים שטופים לכל מדגם (למעט TIC) ולדגירה אותם לילה, מסתובב ב 4 °C (70 °F).</li>
	</ol></li>
	<li>כביסה
	<ol>
<li>לשטוף פעם אחת עם 300 μL של חוצץ מלח נמוך (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) במשך 10 דקות באמצעות סיבוב ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>לשטוף פעם אחת עם 300 μL של חוצץ מלח גבוה (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) במשך 10 דקות באמצעות סיבוב ב 4 °C (C).</li>
		<li>לשטוף פעם אחת עם 300 μL של חיץ LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) למשך 10 דקות באמצעות סיבוב ב 4 °C (55 °F).</li>
		<li>לשטוף פעמיים עם 300 μL של TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) במשך 10 דקות באמצעות סיבוב, עבור לשטוף הראשון ב 4 °C (5 °F), ואת לשטוף השני ב 25 °C (70 °F).</li>
	</ol></li>
	<li>אלוטיון
	<ol>
<li>הוסף 200 μL של מאגר elution (1% SDS ו 100 mM NaHCO3) לחרוזים ודגרה ב 65 °C (65 °C) בתרמו-שייקר במשך 15 דקות עם רועד מתמשך (כ. 400 סל"ד). העבר את supernatant לצינור חדש חרוזים elute שוב 200 μL של חוצץ Elution. שלב eluates (נפח סופי 400 μL).</li>
		<li>הוסף NaCl לריכוז סופי של 200 mM בכל מדגם. להשלים את דגימות TIC עם 200 μL של חוצץ Elution ולהוסיף NaCl גם כן. הערה: בשלב זה, יש לטפל ב- TIC באותם תנאים כמו הדגימות האחרות.</li>
		<li>לדגור על הדגימות ב 65 °C (ללא רועד) לפחות 6 שעות.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של אתנול קר 100% לכל דגימה, לסובב את הצינורות פעמיים לערבב, ולזרז DNA לילה ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>למחרת, צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 13,000 x g ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>להשליך את supernatant ולשטוף את הכדור עם 70% EtOH.</li>
		<li>צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>השליכו את הסופר-טבעי וייבשו את הכדורים.</li>
		<li>resuspend הכדורים ב 100 μL של TE ולהוסיף 0.5 מ"ג / מ"ל של RNase A לכל מדגם. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 20 דקות כדי להפעיל את RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>היפוך של קישור צולב
	<ol>
<li>הוסף 500 מיקרוגרם /mL של Proteinase K ו 0.5% SDS ולאחר מכן לדגור על הדגימות ב 50 °C (50 °F) במשך 2 שעות. הערה: אם ממשיכים ChIP-seq, להימנע מיצוי פנול-כלורופורם, כפי שהוא מעכב את תהליך NGS במורד הזרם. במקום זאת, מומלץ להשתמש בערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>הוסף 0.5 נפח של פנול ו 0.5 נפח של תערובת אלכוהול כלורופורם-איזומיל (24:1) לכל מדגם.</li>
		<li>מערבולת למשך דקה אחת.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.</li>
		<li>העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.</li>
		<li>הוסף נפח אחד של תערובת אלכוהול כלורופורם-איזומיל (24:1) לכל דגימה.</li>
		<li>מערבולת למשך דקה אחת.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.</li>
		<li>העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.</li>
	</ol></li>
	<li>הפקת דנ"א
	<ol>
<li>הוסף 2.5 כרכים של 96% אתנול ונפח 0.1 של 3 M Na-Acetate pH 5.2.</li>
		<li>דגירה במשך 20 דקות לפחות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>הסר את האתנול לשטוף את הכדור עם 400 μL של 70% אתנול.</li>
		<li>צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
		<li>הסר את האתנול ואוויר יבש את הכדור.</li>
		<li>resuspend הכדור ב 50 μL של TE.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation-Mediated+Fine-Tuning+of+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair.</a> Cancers (Basel). 12 (6), (2020).</li>
<li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+Post-Translational+Modifications+in+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.</a> Cells. 9 (6), (2020).</li>
<li>Stephens, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+cancer+genes+and+mutational+processes+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer.</a> Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).</li>
<li>Turnbull, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-gene+interactions+in+breast+cancer+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility.</a> Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).</li>
<li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+mismatch-repair+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).</li>
<li>Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+DNA+break+metabolism%3A+in+the+%27end%27%2C+it%27s+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing.</a> EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).</li>
<li>Lemaitre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+position+dictates+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear position dictates DNA repair pathway choice.</a> Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Lambert, S., Lopez, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+RAD51+double+strand+break+repair+using+non-lethal+dominant-negative+forms%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms.</a> EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p300-mediated+acetylation+of+histone+demethylase+JMJD1A+prevents+its+degradation+by+ubiquitin+ligase+STUB1+and+enhances+its+activity+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer.</a> Cancer Research. , (2020).</li>
<li>Kastan, M. B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle checkpoints and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).</li>
<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
<li>Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+or+Death+after+a+Break%3A+What+Determines+the+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Life or Death after a Break: What Determines the Choice.</a> Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WWP2+ubiquitylates+RNA+polymerase+II+for+DNA-PK-dependent+transcription+arrest+and+repair+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks.</a> Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).</li>
<li>Caron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+protects+genes+against+gammaH2AX+Induced+by+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks.</a> PLoS Genetics. 8 (1), 1002460(2012).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Paques, F., Duchateau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganucleases+and+DNA+double-strand+break-induced+recombination%3A+perspectives+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).</li>
<li>Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAPKcs-dependent+arrest+of+RNA+polymerase+II+transcription+in+the+presence+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).</li>
<li>Iacovoni, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+gammaH2AX+around+DNA+double+strand+breaks+in+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome.</a> EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).</li>
<li>Poinsignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Artemis+following+irradiation-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage.</a> European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).</li>
<li>Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+damage+induced+repair+focus+formation+via+super-resolution+dSTORM+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy.</a> Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).</li>
<li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).</li>
<li>Daniels, D. L., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intracellular+protein--DNA+complexes+using+HaloCHIP%2C+an+antibody-free+alternative+to+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation.</a> Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).</li>
</ol>

למרות שתיקון DNA הוא תחום מחקר חדש יחסית, הידע שלנו מתרחב במהירות בעזרת שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות שונות. שימור מידע גנטי חיוני לתאים שכן מוטציות המתרחשות בגנים המעורבים בתהליכי תיקון הן בין הגורמים המובילים לגידול ולכן מבעירה את השלבים העיקריים של מסלולי תיקון DNA היא חיונית.
טכניקות ביוכימיות (כלומר, כתם מערבי, אימונופרציפיטציה, ספקטרומטריית מסה וכו ') דורשות מספר רב של תאים ותהליכי התיקון הנחקרים מייצגים תמונת מצב של אוכלוסיית התאים הרצויה. ביצוע ניסויי ChIP הוא עבודה, בעייתי ושיקולים רב...

הגנום שלנו מאותגר כל הזמן על ידי סוכני DNA שונים המזיקים. תקיפות אלה יכולות לנבוע ממקורות סביבתיים, כגון אור UV או הקרנה, כמו גם ממקורות אנדוגניים, כגון תוצרי לוואי מטבוליים הנגרמים על ידי עקה חמצונית או שגיאותשכפול 1,2. נגעים אלה יכולים להשפיע על השלמות של גדיל DNA אחד או שניהם, ואם השגיאות שנוצרו להיות מתמשך, זה מוביל לעתים קרובות translocations וחוסר יציבות גנום, אשר עלול לגרום tumorigenesis3,4. כדי לשמור על שלמות הגנום, פותחו מערכות תיקון מרובות במהלך האבולוציה. על פי התכונות הכימיות והפיזיות של סוגים מסוימים של נזק DNA, מנגנוני תיקון מרובים ניתן להפעיל. אי-התאמות, אתרים אבסיים, הפסקות גדיל יחיד ו-8-אוקסוגאנין (8-אוקסוג'י) ניתנים להסרה על ידי תיקון אי התאמה או מסלול תיקון כריתת בסיס5,6. נגעים הנגרמים על ידי יצרנים פוטו הנגרמים על ידי UV ותוספים מגושם ניתן לתקן או על ידי תיקון נוקלאוטיד כריתה (NER) או DNA כפול גדיל לשבורתיקון תהליך(DSBR) 7,8. NER מורכב משני מסלולי משנה עיקריים: NER מצמיד תמלול (TC-NER) ו- NER גנומי גלובלי (GG-NER). לגבי שלב מחזור התא, בעקבות אינדוקציה של שבירת גדיל כפול DNA, ניתן להפעיל שני נתיבי משנה: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) ושילוב הומולוגי (HR)1,9. NHEJ, שהוא המסלול הדומיננטי בתאי מנוחה, ניתן להפעיל בכל שלבי מחזור התא, המייצג מסלול מהיר יותר אך נוטה לשגיאה10. מצד שני, HR הוא מסלול ללא שגיאות, שבו DSBs מתוקנים בהתבסס על חיפוש רצף-הומולוגיה של הכרומטידים האחות, ולכן הוא קיים בעיקר בשלבי מחזור תא S ו- G211. יתר על כן, הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ) הוא מנגנון תיקון DSB נוסף, נבדל מאלה הנ"ל, המבוסס על KU70/80- ו RAD51-עצמאי דרך של קשירה מחדש של רצפים מיקרוהומולוגיים שנקטפו בעבר לאגף את קצות ה- DNA השבורים. לכן, MMEJ נחשב נוטה שגיאה מוטגני מאוד12. במהלך תיקון DNA, DSBs יכול לגרום לתגובת נזק לדנ"א (DDR), אשר גורמת להפעלה של קינאזות נקודת ביקורת שעוצמות את מחזור התא במהלךתיקון 13,14,15. DDR מופעל כתגובה לגיוס והתפשטות נרחבת של שחקני מפתח יוזמים של תהליך התיקון סביב הנגעים, התורם להיווצרות של מיקוד תיקון. במפל איתות מוקדם זה, הכספומט (אטקסיה Telangiectasia Mutated) קינאז ממלא תפקיד מרכזי על ידי זירוז הזרחן של וריאנט הייסטון H2AX ב Ser139 (המכונה γH2AX) סביב הנגע16. אירוע מוקדם זה אחראי לגיוס גורמי תיקון נוספים ולייזום תהליכי תיקון במורד הזרם. למרות הפונקציה המדויקת של החלבונים המגויסים במוקד התיקון עדיין לא התאפיינה במלואה, היווצרות ודינמיקה של מוקדי תיקון נחקרו על ידי מספר מעבדות. סמנים אלה משמשים בהרחבה כדי לעקוב אחר קינטיקה תיקון, אבל התפקיד המדויק שלהם במהלך תהליך התיקון נשאר חמקמק. בשל החשיבות הרבה אך הבנה לקויה של תהליכים תאיים הקשורים לתיקון DNA, פותחו עד כה מספר שיטות כדי לגרום ולדמיין את ה- DDR.
הוקמו שיטות ומערכות שונות כדי לגרום לסוג הרצוי של נזק לדנ"א. לדוגמה, סוכנים מסוימים [כגון neocarzinostatin (NCS), phleomycin, bleomycin, γ-הקרנה, UV] יכולים לגרום למספרים גדולים של הפסקות DNA אקראיות בתנוחות גנומיות לא חזויות, בעוד שאחרים (אנדונוקלאז, כגון AsiSI, I-PpoI או I-SceI, כמו גם פס לייזר) יכולים לגרום לשברים DNA ב loci גנומי ידוע17,18,19,20,21. כאן, אנו מתמקדים בטכניקות מבוססות אנדונוקלאז המשמשות כיום לחקר ה- DDR בתאי יונקים ושמרים. מלבד הדגשת העקרונות של טכניקות אלה, אנו מדגישים הן את היתרונות והן את החסרונות שלהם.

<table><tbody><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100 פעמים;), מיוצב</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gamma H2A. X (פוספו S139) נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab26350</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום שבר V אלבומין</td><td>Biosera</td><td>PM-T1725</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt&trade; מאגר טעינה ציאן/צהוב</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10482035</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם 1.0 גרם/ליטר גלוקוז, ללא L-גלוטמין</td><td>לונזה</td><td>12-707F</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&trade; M-280 כבשים נגד עכבר IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ומסחר; M-280 כבשים אנטי-ארנב IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11204D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>טוחנת כימיקלים</td><td>02910-101-340</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (מוצא דרום אמריקה), תמיסת</td><td>Gibco</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד 37% ללא חומצה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>1.03999</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX &trade; תוסף תזונה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>ערכת IPure v2</td><td>Diagenode</td><td>C03010015</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול איזואמיל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>ו-DOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>אבקת PBS ללא Ca2+, Mg2+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L182-50-BC</td><td></td></tr><tr><td>פנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>פוליסורבט 20 (Tween 20)</td> <td>כימיקלים טוחנים</td><td>09400-203-190</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; תושבת זהב נגד דהייה עם DAPI</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>סט קוקטיילים מעכב פרוטאז I</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>P-S2056 DNAPKcs נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab18192</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>CH3COONa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris Acetate-EDTA buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91228</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Molar Chemicals</td><td>09370-006-340</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין מלבלב חזיר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה וכימות נזק dna ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

תאים נחשפים ללא הרף לחומרי DNA שונים הפוגעים בדנ"א, מה שמעורר תגובות תאיות שונות. יישום גישות ביוכימיות וגנטיות חיוני בחשיפת אירועים תאיים הקשורים לגיוס והרכבה של מתחמי תיקון DNA באתר של נזקי DNA. בשנים האחרונות פותחו מספר כלים רבי עוצמה כדי לגרום לנזק דנ"א ספציפי לאתר. יתר על כן, טכניקות שמיות חדשניות מאפשרות לנו ללמוד תהליכים אלה ברמת הרזולוציה של תא אחד באמצעות תאים קבועים וחיים כאחד. למרות שטכניקות אלה שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, בזאת אנו מציגים את הפרוטוקולים הנפוצים ביותר בתחום תיקון ה- DNA, חיסון פלואורסצנטי (IF) ו- Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), אשר בשילוב עם נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז מאפשר לדמיין ולכומת את התפוסה הגנומית של גורמי תיקון DNA בצורה מכוונת ומוסדרת, בהתאמה. טכניקות אלה מספקות כלים רבי עוצמה לחוקרים לזהות חלבונים חדשניים הקשורים ללוק הגנומי הפגוע, כמו גם את השינויים שלאחר התרגום הדרושים לוויסות הכוונון שלהם במהלך תיקון ה- DNA.

ניתן להשיג לימוד תהליכי תיקון המושרים על-ידי DSB בתאים באמצעות זיהום יציב או ארעי. עם זאת, יש לציין כי transfection יציב מבטיח אוכלוסיית תאים הומוגניים, אשר נותן תגובה תאית מאוחדת ולכן אמין יותר. במקרה של ארעיות, רק חלק קטן מאוכלוסיית התאים תופס ומתחזק את הפלסמיד, אשר מכניס גיוון לניסוי. הקמת מערכות תאים מבוססות אנדונוקלאז ER-I-PpoI או ER-AsiSI דורשת 50% מאוכלוסיית תאים משתלבים, אשר מועברת בצורה יעילה יותר עם פלסמידים המקודדים את האנדונקולאז. עבור transfection, ריאגנטים transfection זמין מסחרית או שיטות מבוססות זיהום ויר...

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

וידאו מתודולוגי זה מציג את השלבים המכריעים של חיסונים ופרוטוקולים אימונו-פרופציפיטציה כרומטין המשמשים באופן קבוע כדי לחקור תהליך תאי הקשור נזק ל- DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA. טכניקה זו מספקת כלים רבי עוצמה לחוקרים לזהות חלבונים חדשניים הקשורים ללוק הגנומי הפגוע, כמו גם את השינויים שלאחר התרגום הדרושים לרגולציה מכווננת במהלך תיקון ה- DNA. מאז טכניקות אלה ניתן ליישם לחקר תהליכים תאיים שונים, יש להם רלוונטיות פוטנציאלית אם microirradiation לייזר או DNA מבוסס גרעין מזיקים מערכות גרימת משמשים.לאחרונה פותחו מספר כלים רבי עוצמה כדי לגרום לנזק דנ"א ספציפי לאתר שניתן להשתמש בו כדי להרחיב את הבנתנו את תיקון הדנ"א. יישום גישות ביוכימיות וגנטיות, כלים אלה חיוניים בחשיפת אירועים תאיים הקשורים לגיוס והרכבה של מתחמי תיקון DNA באתר של נזק לדנ"א. יתר על כן, טכניקות אלה מאפשרות לחקור תהליכים אלה ברזולוציית תא בודד באמצעות תאים קבועים וחיים כאחד.שמור על תאי U2OS בשכבות מונו-שכבתיות במדיום תרבית DMEM בתוספת סרום עגל 10%, גלוטמין 2 מילימולר, ואת הפתרון אנטי-אנטי-ממיקוטי 1%. לגדל תאים בסביבת 5%פחמן דו חמצני לח ב 37 מעלות עד 80% מפגש מושגת, חידוש בינוני כל יומיים עד שלושה ימים. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS.נתק תאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הפסק את הפעילות של טריפסין על-ידי הוספת מדיית תרבית לתאים, הניבה השעיית תאים. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים.צלחת 20, 000 תאים למיליליטר לבאר על צלחת 24-well עם כיסוי עגול סטרילי 12 מ"מ בכל באר. לדגור על תאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות בסביבה לחה 5%פחמן דו חמצני כדי לאפשר התקשרות על פתקי הכיסוי. לטפל בתאים עם 10 ננוגרם למיליליטר neocarzinostatin או להשתמש בשיטה המתאימה כדי לגרום הפסקות גדיל כפול באמצעות מערכות מבוססות אנדונוקלוז.דגירה תאים במשך שעה עד שמונה שעות ב 37 מעלות בסביבה לחה 5% פחמן דו חמצני כדי לעקוב אחר הקינטיקה של תיקון ה- DNA. תקן תאים עם פתרון PBS פורמלדהיד 4% למשך 20 דקות ב-25 מעלות. הסר את פתרון התיקון ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד.הסר את ה-PBS והוסף 0.2% טריטון X מומס ב-PBS. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.חסום איגוד לא ספציפי עם 5%BSA מדולל ב- BSA-PBST ודגר את הדגימות למשך 20 דקות לפחות. הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשי מדולל בפתרון 1%BSA-PBST. מניחים כל כיסוי להחליק הפוך על parafilm או 10 טיפת microliter של הנוגדן מדולל.לדגור את הדגימות בתא לחות במשך שעה וחצי בארבע מעלות. מניחים את כיסוי מחליק בחזרה להיות בצד לתוך צלחת 24-well ואת לשטוף שלוש פעמים עם PBS. הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן משני מדולל ב- 1%BSA-PBST.מניחים כל כיסוי להחליק הפוך על parafilm מעל 10 טיפת microliter של הנוגדן מדולל. לדגור את הדגימות בתא לחות בארבע מעלות במשך שעה. מניחים את פתקי הכיסוי בחזרה להיות להגדיר לתוך צלחת 24-well ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.לפני הסרת פתרון הכביסה האחרון PBS, להוציא בעדינות את כיסוי החלקות עם חצי פינצטה ומחט, ולאחר מכן לשים אותם הפוך על שקופיות זכוכית עם טיפות של בינוני הרכבה. אימונופרציפיטציה של כרומטין היא טכניקה נפוצה לזיהוי דפוסי כריכה של חלבונים לדנ"א. כדי לחשוף את התפוסה של חלבון תיקון רצון סביב DSB, נוגדן מסוים משמש immunoprecipitate חלבון עניין מן הכנת הכרומטין יחד עם אזור ה- DNA שאליו הוא קשור.יתר על כן, ChIP הוחל בדרך כלל כדי למפות את נוכחותו של שינוי פוסט-תרגום ספציפי בשימוש על ידי DSBs בלוקוס גנומי נתון. כ -20 מיליון תאים למיליליטר צריכים להיות בתרבית בצלחת 15 ס"מ עבור כל מדגם. הסר את המדיום התרבות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח.תקן את התאים עם פתרון פורמלדהיד-PBS 1%. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית ונסערים בעדינות במשך 20 דקות. להפסיק קיבעון עם גליצין כדי להגיע לריכוז סופי של 125 מילימולר ודגרה על שייקר אורביטר עם עצבנות עדינה במשך חמש דקות ב 25 מעלות.מניחים את הצלחת על קרח לשטוף פעמיים עם PBS קר כקרח. לגרד את התאים PBS קר כקרח ולהעביר אותם לתוך צינורות חרוטיים 15 מיליליטר. צנטריפוגות התאים ב 5, 000 סל"ד במשך חמש דקות בארבע מעלות.בזהירות לשאוף supernatant ו resuspend הכדור ב2 מיליליטר חיץ תמיסת תא ודגרה על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-5,000 סל"ד לחמש דקות ב-4 מעלות. בזהירות להשליך את supernatant ולרסן מחדש את הכדור ב 500 ל 1, 500 חוצץ תמיס גרעיני microliter ודגרה על קרח במשך 30 עד 60 דקות.מעבירים את הלסאט לצינור חרוט פוליסטירן המתאים לסוניקציה. Sonicate ליסאט כדי לגטות את ה- DNA לגודל שבר ממוצע של 300 עד 1000 זוגות בסיס. הכינו את Dynabeads לשלבי הניקוי וההפחתה.לשטוף חרוזים פעמיים במשך 10 דקות בארבע מעלות עם חוצץ RIPA. Resuspend Dynabeads באותו נפח של מאגר RIPA כפי שהוציאת מפתרון המלאי המקורי בשלבים 3.1. ניקוי מראש של 25 עד 30 מיקרוגרם כרומטין של כל דגימה עם ארבעה דינבדים מיקרוליטרים באמצעות סיבוב למשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות.לזרז את Dynabeads עם מגנט ולהעביר את supernatant לצינור אפנדורף חדש. מוסיפים את כמות הנוגדן המתאימה לכל דגימת כרומטין ומסתובבים בן לילה בארבע מעלות. למחרת, להוסיף 40 microliter של Dynabeads שטף לכל מדגם ולדגירה אותם לילה מסתובב בארבע מעלות.לשטוף פעם אחת עם 300 microliter חוצץ מלח נמוך במשך 10 דקות עם סיבוב בארבע מעלות. לשטוף פעם אחת עם 300 microliter חוצץ מלח גבוה במשך 10 דקות עם סיבוב בארבע מעלות. לשטוף פעם אחת עם 300 חיץ ליתיום כלוריד microliter במשך 10 דקות עם סיבוב בארבע מעלות.יש לשטוף פעמיים עם TE 300 מיקרוליטר למשך 10 דקות עם סיבוב לכביסה הראשונה בארבע מעלות ולשטיפה השנייה ב- 25 מעלות. מוסיפים 200 חוצץ אלוטיון מיקרוליטר לחרוזים ודגר אותם ב 65 מעלות בתרמו-שייקר במשך 15 דקות עם רעד מתמשך. מעבירים את הסופר-נט לצינור חדש ומחליקים שוב את החרוזים ב-200 מאגר אלוטיון מיקרוליטר.מוסיפים 500 מיקרוגרם למיליליטר פרוטאינאז-K וחצי אחוז SDS ודגר את הדגימות ב-50 מעלות למשך שעתיים. בצע מיצוי כלורופורם והעבר את השלב המ מימי העליון לצינור אפנדורף חדש. הוסף שניים וחצי כרכים של אתנול מוחלט ו 0.1 נפח שלושה נתרן אצטט טוחן pH 5.2.דגירה לפחות 20 דקות במינוס 80 מעלות. הסר את האתנול ואוויר יבש את הכדור. תשמיד מחדש את הכדור ב-50 מיקרוליטר TE. כדי ללמוד את ההתפלגות המיוחדת שלהם על DNA, אימונופרציפיטציה כרומטין צריך להיות מיושם.תוצאות ניסוי טיפוסיות המתקבלות על ידי ChIP-qPCR מוצגות באיור זה, אשר מדגים את העשרה זמנית של גמא היסטון AX כתגובה לנזק DNA המושרה I-PpoI. בחלק השמאלי של התמונה, אות גמא היסטון AX שזוהה בזמן מוצג בצד ההפסקה, ואילו בחלק הימני, התפלגות גאמא histone AX מוצגת באזור גן הבקרה שבו הפסקות הדגימו לא הושרו. למרות שתיקון DNA הוא תחום מחקר חדש יחסית, הידע שלנו גדל במהירות בעזרת שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות כאחד.עם זאת, טכניקות ביוכימיות, כגון כתם מערבי, אימונופרציפיטציה וספקטרומטריית מסה דורשות כמות גדולה של תאים. תהליכי תיקון המחקר מייצגים תמונת מצב של אוכלוסיית התאים הרצויה. השדה המיקרוסקופי עבר מהפכה בטכניקות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ ברזולוציית-על, המאפשר הדמיה של תהליכים תאיים הנגרמים מנזקי DNA ברמה הנוקלאוזמית, כמו גם להבטיח מיפוי מדויק של לוקליזציה של חלבונים.מצד שני, אימונופרציפיטציה של כרומטין היא כלי רב עוצמה, במיוחד על ידי שילובו עם שיטות ריצוף כדי לדמיין את תבנית הכריכה שלו בכל הגנום של חלבונים הקשורים לתיקון DNA ושברים גדיל כפול באזורי כרומטין או הטרוצ'רומטין.

visualizing-quantifying-endonuclease-based-site-specific-dna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

המטרה של פרוטוקול זה נועד לכמת תיקון crosslinks DNA-חלבון מוגדר על פלסמיד ה-DNA. פלסמידים lesioned הם transfected לתוך שורות תאים בתרבית של הנמען, משקל נמוך-מולקולרי נקצרו תקנים שלאחר נקודות זמן מרובים. קינטיקה תיקון ה-DNA יש לכמת באמצעות הארכת תחל סטרנד ספציפיים ואחריו qPCR.

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

למד שיטות IF ו-ChIP לחקר תגובת נזק DNA ותיקון תאי באמצעות תאי U2OS. פרוטוקולים אלה מאפשרים הדמיה וכימות של גיוס חלבוני תיקון ושינויים לאחר תרגום בלוקוסים פגועים.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

גלה סרטונים נוספים