הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

וידאו מתודולוגי זה מציג את השלבים המכריעים של חיסונים ופרוטוקולים אימונו-פרופציפיטציה כרומטין המשמשים באופן קבוע כדי לחקור תהליך תאי הקשור נזק ל- DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA. טכניקה זו מספקת כלים רבי עוצמה לחוקרים לזהות חלבונים חדשניים הקשורים ללוק הגנומי הפגוע, כמו גם את השינויים שלאחר התרגום הדרושים לרגולציה מכווננת במהלך תיקון ה- DNA. מאז טכניקות אלה ניתן ליישם לחקר תהליכים תאיים שונים, יש להם רלוונטיות פוטנציאלית אם microirradiation לייזר או DNA מבוסס גרעין מזיקים מערכות גרימת משמשים.

לאחרונה פותחו מספר כלים רבי עוצמה כדי לגרום לנזק דנ"א ספציפי לאתר שניתן להשתמש בו כדי להרחיב את הבנתנו את תיקון הדנ"א. יישום גישות ביוכימיות וגנטיות, כלים אלה חיוניים בחשיפת אירועים תאיים הקשורים לגיוס והרכבה של מתחמי תיקון DNA באתר של נזק לדנ"א. יתר על כן, טכניקות אלה מאפשרות לחקור תהליכים אלה ברזולוציית תא בודד באמצעות תאים קבועים וחיים כאחד.

שמור על תאי U2OS בשכבות מונו-שכבתיות במדיום תרבית DMEM בתוספת סרום עגל 10%, גלוטמין 2 מילימולר, ואת הפתרון אנטי-אנטי-ממיקוטי 1%. לגדל תאים בסביבת 5%פחמן דו חמצני לח ב 37 מעלות עד 80% מפגש מושגת, חידוש בינוני כל יומיים עד שלושה ימים. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS.

נתק תאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הפסק את הפעילות של טריפסין על-ידי הוספת מדיית תרבית לתאים, הניבה השעיית תאים. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים.

צלחת 20, 000 תאים למיליליטר לבאר על צלחת 24-well עם כיסוי עגול סטרילי 12 מ"מ בכל באר. לדגור על תאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות בסביבה לחה 5%פחמן דו חמצני כדי לאפשר התקשרות על פתקי הכיסוי. לטפל בתאים עם 10 ננוגרם למיליליטר neocarzinostatin או להשתמש בשיטה המתאימה כדי לגרום הפסקות גדיל כפול באמצעות מערכות מבוססות אנדונוקלוז.

דגירה תאים במשך שעה עד שמונה שעות ב 37 מעלות בסביבה לחה 5% פחמן דו חמצני כדי לעקוב אחר הקינטיקה של תיקון ה- DNA. תקן תאים עם פתרון PBS פורמלדהיד 4% למשך 20 דקות ב-25 מעלות. הסר את פתרון התיקון ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד.

הסר את ה-PBS והוסף 0.2% טריטון X מומס ב-PBS. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.

חסום איגוד לא ספציפי עם 5%BSA מדולל ב- BSA-PBST ודגר את הדגימות למשך 20 דקות לפחות. הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשי מדולל בפתרון 1%BSA-PBST. מניחים כל כיסוי להחליק הפוך על parafilm או 10 טיפת microliter של הנוגדן מדולל.

לדגור את הדגימות בתא לחות במשך שעה וחצי בארבע מעלות. מניחים את כיסוי מחליק בחזרה להיות בצד לתוך צלחת 24-well ואת לשטוף שלוש פעמים עם PBS. הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן משני מדולל ב- 1%BSA-PBST.

מניחים כל כיסוי להחליק הפוך על parafilm מעל 10 טיפת microliter של הנוגדן מדולל. לדגור את הדגימות בתא לחות בארבע מעלות במשך שעה. מניחים את פתקי הכיסוי בחזרה להיות להגדיר לתוך צלחת 24-well ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.

לפני הסרת פתרון הכביסה האחרון PBS, להוציא בעדינות את כיסוי החלקות עם חצי פינצטה ומחט, ולאחר מכן לשים אותם הפוך על שקופיות זכוכית עם טיפות של בינוני הרכבה. אימונופרציפיטציה של כרומטין היא טכניקה נפוצה לזיהוי דפוסי כריכה של חלבונים לדנ"א. כדי לחשוף את התפוסה של חלבון תיקון רצון סביב DSB, נוגדן מסוים משמש immunoprecipitate חלבון עניין מן הכנת הכרומטין יחד עם אזור ה- DNA שאליו הוא קשור.

יתר על כן, ChIP הוחל בדרך כלל כדי למפות את נוכחותו של שינוי פוסט-תרגום ספציפי בשימוש על ידי DSBs בלוקוס גנומי נתון. כ -20 מיליון תאים למיליליטר צריכים להיות בתרבית בצלחת 15 ס"מ עבור כל מדגם. הסר את המדיום התרבות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח.

תקן את התאים עם פתרון פורמלדהיד-PBS 1%. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית ונסערים בעדינות במשך 20 דקות. להפסיק קיבעון עם גליצין כדי להגיע לריכוז סופי של 125 מילימולר ודגרה על שייקר אורביטר עם עצבנות עדינה במשך חמש דקות ב 25 מעלות.

מניחים את הצלחת על קרח לשטוף פעמיים עם PBS קר כקרח. לגרד את התאים PBS קר כקרח ולהעביר אותם לתוך צינורות חרוטיים 15 מיליליטר. צנטריפוגות התאים ב 5, 000 סל"ד במשך חמש דקות בארבע מעלות.

בזהירות לשאוף supernatant ו resuspend הכדור ב2 מיליליטר חיץ תמיסת תא ודגרה על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-5,000 סל"ד לחמש דקות ב-4 מעלות. בזהירות להשליך את supernatant ולרסן מחדש את הכדור ב 500 ל 1, 500 חוצץ תמיס גרעיני microliter ודגרה על קרח במשך 30 עד 60 דקות.

מעבירים את הלסאט לצינור חרוט פוליסטירן המתאים לסוניקציה. Sonicate ליסאט כדי לגטות את ה- DNA לגודל שבר ממוצע של 300 עד 1000 זוגות בסיס. הכינו את Dynabeads לשלבי הניקוי וההפחתה.

לשטוף חרוזים פעמיים במשך 10 דקות בארבע מעלות עם חוצץ RIPA. Resuspend Dynabeads באותו נפח של מאגר RIPA כפי שהוציאת מפתרון המלאי המקורי בשלבים 3.1. ניקוי מראש של 25 עד 30 מיקרוגרם כרומטין של כל דגימה עם ארבעה דינבדים מיקרוליטרים באמצעות סיבוב למשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות.

לזרז את Dynabeads עם מגנט ולהעביר את supernatant לצינור אפנדורף חדש. מוסיפים את כמות הנוגדן המתאימה לכל דגימת כרומטין ומסתובבים בן לילה בארבע מעלות. למחרת, להוסיף 40 microliter של Dynabeads שטף לכל מדגם ולדגירה אותם לילה מסתובב בארבע מעלות.

לשטוף פעם אחת עם 300 microliter חוצץ מלח נמוך במשך 10 דקות עם סיבוב בארבע מעלות. לשטוף פעם אחת עם 300 microliter חוצץ מלח גבוה במשך 10 דקות עם סיבוב בארבע מעלות. לשטוף פעם אחת עם 300 חיץ ליתיום כלוריד microliter במשך 10 דקות עם סיבוב בארבע מעלות.

יש לשטוף פעמיים עם TE 300 מיקרוליטר למשך 10 דקות עם סיבוב לכביסה הראשונה בארבע מעלות ולשטיפה השנייה ב- 25 מעלות. מוסיפים 200 חוצץ אלוטיון מיקרוליטר לחרוזים ודגר אותם ב 65 מעלות בתרמו-שייקר במשך 15 דקות עם רעד מתמשך. מעבירים את הסופר-נט לצינור חדש ומחליקים שוב את החרוזים ב-200 מאגר אלוטיון מיקרוליטר.

מוסיפים 500 מיקרוגרם למיליליטר פרוטאינאז-K וחצי אחוז SDS ודגר את הדגימות ב-50 מעלות למשך שעתיים. בצע מיצוי כלורופורם והעבר את השלב המ מימי העליון לצינור אפנדורף חדש. הוסף שניים וחצי כרכים של אתנול מוחלט ו 0.1 נפח שלושה נתרן אצטט טוחן pH 5.2.

דגירה לפחות 20 דקות במינוס 80 מעלות. הסר את האתנול ואוויר יבש את הכדור. תשמיד מחדש את הכדור ב-50 מיקרוליטר TE. כדי ללמוד את ההתפלגות המיוחדת שלהם על DNA, אימונופרציפיטציה כרומטין צריך להיות מיושם.

תוצאות ניסוי טיפוסיות המתקבלות על ידי ChIP-qPCR מוצגות באיור זה, אשר מדגים את העשרה זמנית של גמא היסטון AX כתגובה לנזק DNA המושרה I-PpoI. בחלק השמאלי של התמונה, אות גמא היסטון AX שזוהה בזמן מוצג בצד ההפסקה, ואילו בחלק הימני, התפלגות גאמא histone AX מוצגת באזור גן הבקרה שבו הפסקות הדגימו לא הושרו. למרות שתיקון DNA הוא תחום מחקר חדש יחסית, הידע שלנו גדל במהירות בעזרת שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות כאחד.

עם זאת, טכניקות ביוכימיות, כגון כתם מערבי, אימונופרציפיטציה וספקטרומטריית מסה דורשות כמות גדולה של תאים. תהליכי תיקון המחקר מייצגים תמונת מצב של אוכלוסיית התאים הרצויה. השדה המיקרוסקופי עבר מהפכה בטכניקות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ ברזולוציית-על, המאפשר הדמיה של תהליכים תאיים הנגרמים מנזקי DNA ברמה הנוקלאוזמית, כמו גם להבטיח מיפוי מדויק של לוקליזציה של חלבונים.

מצד שני, אימונופרציפיטציה של כרומטין היא כלי רב עוצמה, במיוחד על ידי שילובו עם שיטות ריצוף כדי לדמיין את תבנית הכריכה שלו בכל הגנום של חלבונים הקשורים לתיקון DNA ושברים גדיל כפול באזורי כרומטין או הטרוצ'רומטין.