Name: מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: למדו פרוטוקול למיצוי כרומטין אמין מרקמת כבד קפואה לניתוח משקעים חיסוניים. השיטה מאפשרת חקירת שינויים אפיגנטיים ורגולציה תיעתוקית במחקר ביולוגי מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) על ידי מענק למאורה דנדרי (SFB 841 A5) ועל ידי מדינת המבורג עם תוכנית המחקר (LFF-FV44: EPILOG).
ברצוננו להודות לד"ר טאסילו וולץ, איבון לאדיג'ס ואניקה וולמרי על העזרה הטכנית ועל הקריאה הביקורתית של כתב היד. ד"ר תומאס גינתר ופרופ' אדם גרונדהוף על מתן הצעות מועילות מאוד וערכות הפריימר לניתוח ChIP-qPCR.

<ol><li>Waddington, C. H., Pantelouris, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+nuclei+in+newt%27s+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transplantation of nuclei in newt's eggs.</a> Nature. 172 (4388), 1050-1051 (1953).</li>
<li>Silmon de Monerri, N. C., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+hijack+the+epigenome%3A+A+new+twist+on+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogens hijack the epigenome: A new twist on host-pathogen interactions.</a> American Journal of Pathology. 184 (4), 897-911 (2014).</li>
<li>Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots%3A+chromatin+control+of+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Snapshots: chromatin control of viral infection.</a> Virology. 435 (1), 141-156 (2013).</li>
<li>Tropberger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+histone+modifications+in+episomal+HBV+cccDNA+uncovers+an+unusual+chromatin+organization+amenable+to+epigenetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of histone modifications in episomal HBV cccDNA uncovers an unusual chromatin organization amenable to epigenetic manipulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 5715-5724 (2015).</li>
<li>Sproul, D., Gilbert, N., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+structure+in+regulating+the+expression+of+clustered+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin structure in regulating the expression of clustered genes.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (10), 775-781 (2005).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+and+chromatin+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone and chromatin cross-talk.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 172-183 (2003).</li>
<li>Ling, X., Harkness, T. A., Schultz, M. C., Fisher-Adams, G., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+histone+H3+and+H4+amino+termini+are+important+for+nucleosome+assembly+in+vivo+and+in+vitro%3A+redundant+and+position-independent+functions+in+assembly+but+not+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Yeast histone H3 and H4 amino termini are important for nucleosome assembly in vivo and in vitro: redundant and position-independent functions in assembly but not in gene regulation.</a> Genes & Development. 10 (6), 686-699 (1996).</li>
<li>Zhang, L., Eugeni, E. E., Parthun, M. R., Freitas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+histone+post-translational+modifications+by+peptide+mass+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Identification of novel histone post-translational modifications by peptide mass fingerprinting.</a> Chromosoma. 112 (2), 77-86 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431 (7010), 873-878 (2004).</li>
<li>Hassa, P. O., Haenni, S. S., Elser, M., Hottiger, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ADP-ribosylation+reactions+in+mammalian+cells%3A+where+are+we+today+and+where+are+we+going%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 789-829 (2006).</li>
<li>Dey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 279-299 (2012).</li>
<li>Hager, G. L., McNally, J. G., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription dynamics.</a> Molecular Cell. 35 (6), 741-753 (2009).</li>
<li>Nagy, Z., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+GCN5%2FPCAF-containing+complexes+function+as+co-activators+and+are+involved+in+transcription+factor+and+global+histone+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation.</a> Oncogene. 26 (37), 5341-5357 (2007).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Gunther, T., Theiss, J. M., Fischer, N., Grundhoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+viral+and+host+chromatin+by+ChIP-PCR+or+ChIP-Seq+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Investigation of viral and host chromatin by ChIP-PCR or ChIP-Seq analysis.</a> Current Protocols in Microbiology. 40, 11-21 (2016).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 419(2015).</li>
<li>Haim, Y., Tarnovscki, T., Bashari, D., Rudich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+protocol+for+use+in+whole+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for use in whole human adipose tissue.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (9), 1172-1177 (2013).</li>
<li>Castellano-Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+improvements+for+the+processing+of+small+frozen+pieces+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation improvements for the processing of small frozen pieces of adipose tissue.</a> PLoS One. 13 (2), 0192314(2018).</li>
<li>Savic, D., Gertz, J., Jain, P., Cooper, G. M., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+genome-wide+transcription+factor+binding+sites+in+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Mapping genome-wide transcription factor binding sites in frozen tissues.</a> Epigenetics Chromatin. 6 (1), 30(2013).</li>
<li>Perna, A., Alberi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TF-ChIP+method+for+tissue-specific+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TF-ChIP method for tissue-specific gene targets.</a> Frontiers Cell Neuroscience. 13, 95(2019).</li>
<li>Allweiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+primary+human+hepatocytes+and+prevention+of+hepatitis+B+virus+reinfection+efficiently+deplete+nuclear+cccDNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Proliferation of primary human hepatocytes and prevention of hepatitis B virus reinfection efficiently deplete nuclear cccDNA in vivo.</a> Gut. 67 (3), 542-552 (2018).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Perna, A., Alberi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TF-ChIP+Method+for+Tissue-Specific+Gene+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TF-ChIP Method for Tissue-Specific Gene Targets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 95(2019).</li>
<li>Liang, N., Fan, R., Goni, S., Treuter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Frozen+Liver+Tissues+for+Integrated+Omics+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Frozen Liver Tissues for Integrated Omics Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1951, 167-178 (2019).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+network+analysis+of+human+serum+albuminome+by+integrated+use+of+quick+crosslinking+and+two-step+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomic and network analysis of human serum albuminome by integrated use of quick crosslinking and two-step precipitation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9856(2017).</li>
<li>Singh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ChIP-seq+method+facilitates+transcription+factor+profiling+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Optimized ChIP-seq method facilitates transcription factor profiling in human tumors.</a> Life Science Alliance. 2 (1), 201800115(2019).</li>
<li>Aoki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-functional+cross-linking+reagents+efficiently+capture+protein-DNA+complexes+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos.</a> Fly. 8 (1), 43-51 (2014).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+in+vitro+and+in+vivo+models+for+the+study+of+human+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection.</a> Journal of Hepatology. 64, 1 Suppl 17-31 (2016).</li>
<li>Krishna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the liver.</a> Clinics in Liver Disease. 2, Suppl 1 4-7 (2013).</li>
<li>Tannapfel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+diagnosis+of+non-alcoholic+and+alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Histopathological diagnosis of non-alcoholic and alcoholic fatty liver disease.</a> Virchows Archiv. 458 (5), 511-523 (2011).</li>
<li>Schuppan, D., Afdhal, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Liver cirrhosis.</a> Lancet. 371 (9615), 838-851 (2008).</li>
<li>Allweiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+shutdown+of+HBV+transcripts+promotes+reappearance+of+the+SMC5%2F6+complex+and+silencing+of+the+viral+genome+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Therapeutic shutdown of HBV transcripts promotes reappearance of the SMC5/6 complex and silencing of the viral genome in vivo.</a> Gut. , 322571(2021).</li>
<li>Gerna, G., Kabanova, A., Lilleri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+cell+tropism+and+host+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus cell tropism and host cell receptors.</a> Vaccines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Echavarria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviruses+in+immunocompromised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Adenoviruses in immunocompromised hosts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Frohlich, J., Grundhoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+in+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+infection+and+associated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection and associated disease.</a> Seminars in Immunopathology. 42 (2), 143-157 (2020).</li>
<li>Nicoll, M. P., Proenca, J. T., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+herpes+simplex+virus+latency%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of herpes simplex virus latency.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 684-705 (2012).</li>
<li>Thorley-Lawson, D. A., Hawkins, J. B., Tracy, S. I., Shapiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+Epstein-Barr+virus+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of Epstein-Barr virus persistent infection.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 227-232 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכנת כרומטין מרקמה קפואה מהירה נותרה אתגר בגלל מספר השלבים שיש לייעל על מנת להשיג תוצאות ניתנות לשחזור ואמינות. רוב הפרוטוקולים שכבר פורסמו 16,23 דורשים טחינת רקמות לפני הדיסוציאציה הידנית (douncing). ניסינו להימנע ככל האפשר מצעדים שעלולים לעורר פירוק חלבונים לפני קיבוע הדגימה. שלב הריסוק כבר נמצא בשימוש בתכשירי כבד קפואים24 והופך את הדיסוציאציה הידנית לקלה יותר וניתנת לשחזור (ראו איור 2a). עם שימוש במכתש שתוכנן במיוחד עבור צינורות 1.5 מ"ל (ראה פרוטוקולים), אובדן הדגימה במהלך תהליך הריסוק מצטמצם, ומאפשר לעבד כמויות קטנות של רקמה כגון דגימות ביופסיה של הכבד. באופן עקרוני ניתן להשתמש בהומוגניזציה ישירה של רקמות ללא כל שלבי שחיקה; עם זאת, הומוגניזציה של רקמות ללא כתישה קודמת יש שחזור גרוע יותר בניסיון שלנו ואת המראה של בעיות עבור יישומים במורד הזרם היה גבוה יותר (הנתונים לא מוצגים).
רוב הבעיות בהן נתקלים בהכנת כרומטין מרקמות נובעות מאופי הדגימות הללו ומחוסר היכולת לבדוק כראוי אם אשכולות התאים קטנים מספיק לקיבוע מבלי לאבד מאיכותם. יתר על כן, בדיקת כל aliquot בכל שלב יהיה זמן רב להגדיל את הסיכוי של פירוק חלבון.
קיבוע (שלב 3.9) הוא חלק בסיסי ומכריע בהכנת הכרומטין. בשל אופי הרקמה, שלב הקיבוע התעכב עד להומוגניזציה של הרקמה. לשלב קיבוע נדחה כזה יש יתרון לייצר השעיית תאים הומוגנית יותר. עם זאת, אנו מכירים בכך שבמקרה של מטרות רגישות במיוחד למניפולציה, ייתכן שיהיה צורך לבצע את הקיבוע ממש לפני שלב 3.6. זה יעזור להגן על חלבונים רגישים מאוד או PTM, אם כי זה עשוי להגדיל את גודל אשכולות התא, כי כאשר קבוע עלול לגרום לגזירה לא הומוגנית. הריכוז של תמיסת FA המשמשת בפרוטוקול הוא סטנדרטי, עם זאת, ניתן לשנות אותו כדי לנסות לשפר את הקיבוע הכולל. זמן הקיבוע שנבחר כאן משקף גם תנאים סטנדרטיים הנפוצים בתחום. במקרה של ריכוז גבוה יותר של תמיסת הקיבוע, זמן הקיבוע עשוי להיות מופחת, ואילו במקרה של כמות נמוכה יותר יש להגדיל אותו. על המפעיל לקחת בחשבון כי שינוי זמן הקיבוע עלול להוביל לקיבוע יתר של הדגימה או לתת מקום לפירוק חלבון. במקרה של שאיפה לזרז קומפלקסים גדולים (או חלק מהם) ו- TFs, יהיה זה יתרון לבצע קיבוע דו-שלבי באמצעות פתרון DSG ואחריו FA אחד25,26. DSG במקרה זה ייצב אינטראקציות חלבון-חלבון, בעוד פורמלדהיד פועל בעיקר על אינטראקציות DNA-חלבון ישירות27.
על המפעיל לקחת בחשבון את האפשרות ליישם ערכה מבוססת עמודות לטיהור DNA החל משלב 6.7 שהוא מהיר יותר ואינו משתמש בתרכובות רעילות. עם זאת, תמיד תהיה כמות מסוימת של דנ"א לא קשור שיאבד. מסיבה זו, אנו ממליצים להשתמש במיצוי פנול-כלורופורם קלאסי ואחריו משקעים EtOH. יתר על כן, לפני הפעלת ג'ל אגרוז (שלב 7.2) זה יכול להיות מועיל למדוד את ריכוז ה- DNA ולטעון את אותה כמות עבור כל באר כדי לקבל תמונה ברורה יותר.
מגבלה של פרוטוקול זה נובעת מהעובדה שחקרנו והשתמשנו בפרוטוקול זה רק באמצעות דגימות כבד שמקורן בעכברים כימריים אנושיים-כבדים28. כשלעצמו הכבד מורכב מרקמת אפיתל וחיבור29. במקרה של מחלה, רקמה פיברוטית ורקמת שומן עשויים להיות נוכחים30,31 יצירת אתגרים נוספים במהלך הפרעה ברקמות. עם זאת, אנו מכירים בכך שלא ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו על רקמת עצם, שריר ושומן ללא אופטימיזציה של שלבי הדיסוציאציה והסוניקציה. יש לציין כי כל רקמה דורשת אופטימיזציה כלשהי בשל היעדר פרוטוקול המתאים לכולם כמו לדגימות תרבית תאים15. אנו מאמינים, עם זאת, כי עם אופטימיזציה מועטה או ללא אופטימיזציה כלל, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בהצלחה על רקמות אחרות החולקות דמיון עם הכבד בהרכב, כמו ריאות, מעי, קיבה, לבלב או רקמות כליות.
הפרוטוקול שלנו שימש בהצלחה גם לניתוח TFs ושינויים בהיסטון על אפיזום DNA סגור קוולנטית HBV (cccDNA)32. זה פותח את ההזדמנות ליישם גישה כזו עבור גנומים נגיפיים אחרים המשפיעים על הכבד, כגון Cytomegalovirus33 אנושי (hCMV) ו Adenoviruses34 אנושי (HAdV). זה לא נכלל כי ניתן יהיה לנתח וירוסים אחרים DNA להקים זיהום מתמשך ברקמות אחרות כמו Kaposi Sarcoma הרפס וירוס35 (KHSV), הרפס סימפלקס וירוס 36 (HSV1/2) וירוסים פוליומה, וירוס אפשטיין-בר37 (EBV).

מאז גילויו, הבקרה האפיגנטית בתאי יונקים זכתה להכרה הולכת וגוברת1, בהתחשב בכך שהבנת מנגנונים כאלה תספק תובנות מפתח לא רק בביולוגיה של התא, אלא גם בביולוגיה של מחלות וגידולים. יתר על כן, גורמים זיהומיים עשויים גם לגרום לשינויים אפיגנטיים של המארח2 בעוד שמנגנון התא המארח עשוי להשפיע גם על הכרומטין של פתוגנים, כגון נגיפי DNA מתמשכים 3,4. נראה כי משחק גומלין זה בין מארח לפתוגן ממלא תפקיד בהתמדה בזיהום. 2
באמצעות קשר הפיך עם דנ"א, חלבוני היסטון יוצרים קומפלקס הנקרא נוקלאוזום. נוקלאוזומים מגיעים בתורו לרמה גבוהה יותר של ארגון המכונה כרומטין. ידוע כי עיצוב מחדש של כרומטין מווסת באופן הדוק ביטוי גנים, מעניק או מונע גישה לגורמי שעתוק (TFs)5. גורמים אלה יכולים להפעיל או לחסום את גיוס ה-RNA פולימראז II (PolII) למקדמי גנים, ולהשפיע על סינתזת mRNA מתבניתהדנ"א 6. חלבוני היסטון מכילים זנבות7, משני צדי קפל ההיסטון, אשר יכולים להיות כפופים לשינויים שלאחר התרגום (PTM), המאפשרים ויסות הדוק של שעתוק הגן על ידי שינויים מבניים בכרומטין. רוב ה-PTMs של ההיסטון ממוקמים בזנב N-terminus, כאשר אצטילציה ומתילציה הן ה-PTM הנחקרות ביותר, אם כי דווח גם על זרחן8, יוביקוויטינציה9 וריבוסילציה10 . אפיון ומחקר של חלבונים כאלה הוא חיוני כדי לקבל תובנה עמוקה על בקרת גנים.
כיום, יש קומץ שיטות וכלים מבוססים היטב לחקר אינטראקציות ישירות בין דנ"א לחלבון: בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA), בדיקת שמרים היברידית אחת (Y1H) וטביעת רגל DNA11. עם זאת, שיטות אלה מתמקדות כשלעצמן באינטראקציות DNA-חלבון בודדות ואינן ישימות למחקרים ברחבי הגנום. מגבלה נוספת של טכניקות אלה היא היעדר קשר של היסטון עם מקטעי הדנ"א שנחקרו. לפיכך, גישות כאלה אינן אמורות לשקף את המורכבות של מנגנון השעתוק in vivo והן אינן לוקחות בחשבון שינויים מבניים חשובים12 או אנזימים/קו-פקטורים נדרשים אחרים13 שיכולים להשפיע (לקדם או לעכב) את קשירת החלבונים לדנ"א.
הרעיון שקיבוע תאים באמצעות חומרים כמו פורמלדהיד (FA) יכול לספק תמונת מצב in vivo של אינטראקציות חלבון-דנ"א, יצר את הבסיס לפיתוח מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)14. זה, יחד עם הזמינות של טכנולוגיית PCR כמותי (qPCR) ושל נוגדנים ספציפיים מאוד, איפשר את הפיתוח של בדיקות ChIP-qPCR. לאחר מכן, הופעתן של טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS), שעלותן הופכת למשתלמת יותר, ויתרה על התאמת ניסויי ChIP עם גישות NGS (ChIP-seq), ובכך סיפקה לחוקרים כלים רבי עוצמה חדשים המאפשרים לחקור את ויסות הכרומטין. בבדיקות אלה, תאים מבודדים או בתרבית מקובעים עם דיסוצינימידיל גלוטרט (DSG) ו / או FA, גרעינים מבודדים, הכרומטין מקוטע ואז מואץ על ידי נוגדן העניין. לאחר מכן, DNA מטוהר ומנותח על ידי גישות PCR או NGS. בניגוד ל-EMSA, Y1H וטביעת רגל של DNA, למבחני ChIP יש את היכולת לספק תמונת מצב גלובלית של אינטראקציה חלבון-דנ"א בתוך התא. זה מציע גמישות ומאפשר ניתוח של מספר מוקדים בתוך אותו מדגם. עם זאת, בשל אופי הבדיקה, ChIP עשוי, בסופו של דבר, לזהות לא רק אינטראקציות ישירות, אלא גם אינטראקציות עקיפות, ולא להציע את הדיוק של השיטות הנ"ל, כאשר מעוניינים אינטראקציות ישירות חלבון-DNA.
פרוטוקולי הכנת כרומטין מחומר תרבית תאים מבוססים היטב15 וניתנים לשחזור רב, ומאפשרים למשתמש להשיג כרומטין המתאים הן לגישות qPCR והן לגישות NGS תוך 1-2 ימי עבודה. עם זאת, השגת כרומטין באיכות גבוהה מרקמות שלמות עדיין מהווה אתגר בגלל הצורך לנתק את התאים בתוך הרקמה תוך השגת קיבוע וגזירה אופטימליים של הכרומטין. בנוסף, ההרכב והמורפולוגיה של סוגי רקמות שונים משתנים, ולכן דורשים התאמה של פרוטוקולים קיימים16,17. השימוש ברקמה שמורה בהקפאה מציע אתגרים נוספים בהשוואה לדגימות טריות. זאת בשל הקושי להשיג השעיה של תא בודד ללא אובדן חומר נרחב. זה מוביל לגזירה לא נכונה, המעכבת יישומים במורד הזרם. עם זאת, גישה לדגימות רקמה קפואה במקום למקבילה הטרייה לא רק מגדילה את גמישות העבודה, אלא גם עשויה לייצג את האפשרות היחידה עבור חוקרים העובדים עם דגימות שמקורן במחקרי אורך או השוואה. פורסמו קומץ פרוטוקולים להכנת כרומטין לרקמות קפואות. אלה מבוססים בעיקר על הפשרת דגימות ואחריה טחינה, דיסוציאציה ידנית / מבוססת מכונה או שלבי כתישת חנקן נוזלי18,19,20.
כאן אנו מתארים שיטת הכנת כרומטיןאופטימלית 15 עבור דגימות כבד קפואות לא קבועות, המשלבת כתישת רקמות בחנקן נוזלי עם הומוגניזציה מזיקה, כדי להשיג גזירת כרומטין הניתנת לשחזור המתאימה לגישות X-ChIP שמטרתן לנתח גנום נגיפי ומארח כאחד.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנן מזרק סטרילי m</td><td>Labsolute</td><td>7699822</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות Safeseal</td><td>Sarstedt</td><td>7,27,06,400</td><td></td></tr><tr><td>6x צבע טעינה כתום</td><td>Thermofisher</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>מקוררת</tr><tr><td>ספסל Bioruptor NGS</td><td>להב דיאגנוד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>או אזמל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>Carl Roth</td><td>HN04</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td> <td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>רוש</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>מעכב דאצטילאז</td><td>Active Motif</td><td>37494</td><td></td></tr><tr><td>סט מטחנת רקמות Dounce</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>DWK885300-0001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 500 mM תמיסה</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>EtBr</td><td>Carl Roth</td><td>2218</td><td>ריכוז 10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>CHEMSOLUTE</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td> <td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>קארל רוט</td><td>0079</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>רוש</td><td>10901393001</td><td>ריכוז: 20 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>בלוק</td><td></td><td></td><td></td>חימום</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich ( Merck)</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840000</td><td></td></tr><tr><td>מיני טיט מקורר חנקן נוזלי</td><td>Bel-Art</td><td>H37260-0100</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד ללא MeOH 16%</td> <td>Thermofisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Thermofisher</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc&nbsp; SC-מעכב פרוטאז</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל לנעילת פאזה - כבד</td><td>QuantaBio</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול 25:24:1</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>קארל רוט</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>ריכוז MPRK092 Lucigen</td><td></td><td>: 50 ומיקרו; g/&micro; L</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ריכוז MRNA092 לוסיגן</td><td></td><td>: 5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>SDS תמיסה 10%</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3950</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי נטול מים</td><td>קארל רות'</td><td>A135</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי סטריליות</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,02,500</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Tris-HCl</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>טריטון-X100</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) היא טכניקה נפוצה להערכת רמות סימני היסטון ותפוסת גורמי שעתוק על כרומטין, מארח ו / או פתוגן. הכנת כרומטין מרקמות יוצרת אתגרים נוספים שיש להתגבר עליהם כדי להשיג פרוטוקולים ניתנים לשחזור ואמינים הדומים לאלה המשמשים לתרבית תאים. שיבוש וקיבוע רקמות הם צעדים קריטיים להשגת גזירה יעילה של כרומטין. דו-קיום של סוגי תאים וצבירים שונים עשוי גם לדרוש זמני גזירה שונים כדי להגיע לגודל מקטע אופטימלי ומעכב את יכולת השחזור של הגזירה. מטרת שיטה זו היא להשיג תכשירי כרומטין מארח אמינים וניתנים לשחזור מרקמה קפואה (כבד) המתאימים הן ליישומי ChIP-qPCR והן ליישומי ריצוף מהדור הבא (NGS). ראינו כי השילוב של כתישת רקמת חנקן נוזלית ואחריה הומוגניזציה מוביל ליכולת שחזור מוגברת בהשוואה להומוגניזציה בלבד, שכן הוא מספק תרחיף המורכב בעיקר מתאים בודדים מנותקים הניתנים לגזירה יעילה. יתר על כן, שלב הקיבוע צריך להתבצע תחת סיבוב מתון כדי לספק crosslinking הומוגני. החומר הקבוע מתאים אז לבידוד גרעינים מבוססי חיץ, כדי להפחית את הזיהום של חלבון ציטופלזמי ודנ"א פתוגן ורנ"א (כאשר ישים), תוך הימנעות משיפועי צנטריפוגות גוזלות זמן. הסוניקציה הבאה תשלים ליזה גרעינית ותגזור את הכרומטין, ותפיק טווח גדלים מסוים בהתאם לתנאי הגזירה שנבחרו. טווח הגדלים צריך ליפול בין 100 ל -300 nt עבור יישומי NGS, בעוד שהוא יכול להיות גבוה יותר (300-700 nt) עבור ניתוח ChIP-qPCR. התאמות פרוטוקול כאלה יכולות לשפר מאוד את ניתוח הכרומטין מדגימות רקמות קפואות.

הכנת כרומטין היא צעד מכריע בהשגת ChIP מוצלח. על מנת להכין כרומטין באיכות טובה מדגימות קפואות, עלינו להבטיח שיבוש רקמות יעיל לפני הקיבוע כדי למנוע נוכחות של גושי רקמות שעלולים לעכב גזירה יעילה. איור 1 מציג צינור מסוכם של הפרוטוקול. כתישה לבדה אינה מספיקה כדי לנתק לחלוטין את הרקמה, מאחר שהיא מייצרת צבירי תאים בגודל משתנה ומעט תאים בודדים (איור 1a). כאשר מקשרים את שלב הריסוק הראשון עם הומוגניזציה של Dounce, כמות גושי הרקמה מופחתת מאוד והנותרים קטנים יותר (איור 1b). לאחר שלבי הקיבוע והליזיס, מספר הגרעינים הבודדים הנראים לעין (איור 1c) גדל, בעוד המראה הכדורי האופייני אובד. לאחר סוניקציה במשך 28 מחזורים, הצביעה הגרעינית (Hoechst 33258/DAPI) לרוב אינה נראית עוד. זהו אכן סימן לגזירה מוצלחת (איור 1d). לאחר דה-קרוסלינקינג של אליקוט כרומטין והדמיה של הדנ"א על ג'ל אגרוז, ניתן לזהות גזירה מוצלחת על-ידי נוכחות של מקטעים בטווח של 100-300 bp. (איור 2a) כמות הדנ"א יכולה להשתנות בהתאם להרכב פיסת הרקמה שהוכנה. כרומטין כזה יכול לשמש בהצלחה עבור ChIP-qPCR. כפי שניתן לראות באיור 2b , הכרומטין יכול להיות מואץ בהצלחה באמצעות נוגדנים H3K4me3, H3K27ac (שינויים הקשורים לגנים פעילים) ו-H3K27me3 (שינוי הקשור לגנים מושתקים). אזורים מקדמי כרומוזום 1 מסגרת קריאה פתוחה 43 (C1orf43), פרוטאזום 20S תת-יחידה בטא 2 (PSMB2) וגליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (mGapdh) הביאו מועשרים באזורי H3K4me3 ו-H3K27ac בהשוואה לאזורי מקדם הומיאובוקס C13 (HOXC13), הומיאובוקס C12 (HOXC12) ואזורי מקדם גורם שעתוק מיאלין של עכבר 1 (mMyt1) (טבלה 1). הסיבה לכך היא ש-C1orf43, PSMB2 ו-mGapdh מתועתקים באופן קונסטיטוטיבי בכבד, בעוד HOXC13, HOXC12 ו-mMyt1 מושתקים. H3K27me3 מראה התנהגות הפוכה המאשרת את ההצלחה של מבחן ChIP. העובדה שהכבד של עכברים אלה הוא כימרה, אפשרה לנו לנתח הן את הכרומטין והן את הכרומטין האנושי. בנוסף, אותו כרומטין יכול לשמש בהצלחה לניסויי ChIP-seq. לאחר שלב הריצוף, הקריאות יושרו לאינדקס המורכב הן מגנום מורין והן מגנום אנושי כדי להפחית את כמות המקטעים הבלתי מיושרים. לאחר מכן, הקריאות הופרדו לפי מינים ונותחו עוד יותר עם EaSeq22 . עוצמת האות נמדדה לאחר מכן באתר התחלת השעתוק (TSS) של כל גן והתוצאה מויינה לעוצמת אות H3K4me3. איור 3a ואיור 3c מראים נוכחות ניכרת של H3K4me3 ו-H3K27ac ב-TSS עבור חלק ניכר מהגנים בכרומטין-עכבר ובכרומטין. בנוסף לכך, H3K27me3 נוגד קורלציה עם H3K4me3/H3K27ac. H3K27me3 נמצא לכל אורך הגן ולא רק ב-TSS, כמצופה מ-PTM זה. איור 3b ואיור3d מראים את צביר HOXC/HoxC הידוע בכך שהוא מועשר עבור H3K27me3 ואינו פעיל בשעתוק הן בכבד עכבר והן בכבד אנושי. הפרופיל של H3K4me3 ו- H3K27ac מראה שיאים עבור שני PTM אלה בעוד שעוצמת האות של H3K27me3 נוטה להיות נמוכה יותר ומפוזרת יותר.
בשל המורכבות של הכנת הכרומטין, קיבוע יתר עלול לקרות, ליזה או זמן סוניקציה עשויים להיות לא אופטימליים, גושי תאים גדולים עשויים להימשך, או טיפול לקוי של הדגימה יכול להיות לקוי. כל אלה הם אירועים המשפיעים על איכות ההכנה. במקרים מסוימים, העשרה של שברי כרומטין בגודל הנכון עדיין תהיה נוכחת או תועבר לגודל גבוה יותר. במקרים אחרים, ייתכן אובדן חומר עקב ליזה מוקדמת או גזירה לא מוצלחת. איור 4 מראה כמה דוגמאות לתוצאות שליליות ותת-אופטימליות כאלה. נתיבים 3 ו-4 מראים העשרה של גודל השבר בין 200 bp ל-800 bp. עם זאת, ברור כי גודל השבר נע בין 100 bp ל &gt;10,000 bp. בנתיבים 5 ו-6 קיימת העשרה בטווח של 100-250 bp עם אובדן ברור של חומר במהלך ההכנה. זה יכול להסביר מדוע הסוניקציה יצרה רסיסים קטנים יותר. נתיב 7 מראה הכנה מעט לא אופטימלית עם הגדלת טווח השברים, ואילו נתיב 8 מראה אובדן כמעט מוחלט של חומר. זה יכול להיגרם על ידי ליזה גרעינית מוקדמת או דיסוציאציה לא מספקת של רקמות עם אובדן כתוצאה מכך לאחר שלב 5.5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול הכנת הכרומטין. התמונות צולמו לאחר כתישת רקמות (a), הומוגניזציה ידנית נוספת (b), לאחר ליזה גרעינית (c) ולאחר סוניזציה (לפני צנטריפוגה) (d). צביעה גרעינית בוצעה עם Hoechst 33258/DAPI. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig02.jpg"> איור 2: גזירת כרומטין מייצגת, ואיכותה מוערכת על-ידי ChIP-qPCR . ג'ל אגרוז 1% עם דגימות כרומטין מקוטעות בהתאם לפרוטוקולים מתכשירי כרומטין שונים. בקרה של כרומטין לא גזוז מתווספת כדי להבטיח שלא תהיה התפרקות כרומטין/דנ"א לפני כן (א). כרומטין גרוס נבדק לאיכות ביצוע בדיקת ChIP-qPCR. נוגדנים H3K4me3, H3K27ac ו- H3K27me3 שימשו כדי לזרז את הכרומטין הטרי. (ב ) ניתוח qPCR בוצע על מקדמים פעילים אנושיים (C1orf43 ו-PSMB2), מורין (Gapdh) ומקדמים לא פעילים אנושיים (HOXC13, HOXC12), מורין (Myt1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig03.jpg"> איור 3: ניתוח ChIP-seq מייצג. הקריאות יושרו לאינדקס שנוצר עם גנום אנושי ועכבר (hg19 ו-mm10). לאחר היישור הופרדו קריאות אנושיות וקריאות מורין ונותחו עוד יותר. מפת חום של גנים אנושיים שבהם האות כומת ב-TSS והראה בסדר יורד את עוצמת H3K4me3 (a). דוגמה לצביר גנים אנושי של גנים מדוכאים (אשכול HOX) המוקף בגנים פעילים (b). מפת חום של גנים מורינים שבהם האות כומת ב-TSS והוצג בסדר יורד עבור עוצמת H3K4me3 (c). דוגמה לצביר גנים מורין של גנים מדוכאים (אשכול Hox) המוקף בגנים פעילים (d). כל הנתונים המוצגים נורמלו על ידי EaSeq למיליון קריאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62179/62179fig04.jpg"> איור 4: תכשירי כרומטין לא אופטימליים וכושלים. 1% ג'ל אגרוז עם דגימות כרומטין מקוטעות בהתאם לפרוטוקול. האיור מכיל כרומטין לא גזוז המשמש כבקרה (נתיב 2), גזירה לא אופטימלית (נתיב 3-4), גזירה אופטימלית עם אובדן חומר ברור (נתיב 5-6), גזירה תת-אופטימלית (נתיב 7) ואובדן חומר נרחב (נתיב 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62179/62179fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם פריימר</td>
			<td></td>
			<td>רצף</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">מקדם C1orf43</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>AGTGGGTGGAGAATGCAGAC</td>
		</tr><tr><td>הפוך</td>
			<td>GAGATTACCCCACCCCATTC</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">מקדם PSMB2</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>CTTATTCAACCCCCGACAAA</td>
		</tr><tr><td>הפוך</td>
			<td>GATGAAGGACGGTGAGAGGA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">מקדם דיסטלי HOXC13</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>GAGCCCGAGATTCACTCAAC</td>
		</tr><tr><td>הפוך</td>
			<td>TTATGCCCAGTTTTGGTTTA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">מקדם דיסטלי HOXC12</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>AAAGCTTCCCACTGCAAAGA</td>
		</tr><tr><td>הפוך</td>
			<td>AAATCTGGGGGCGAACTACT</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">מקדם mGAPDH</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>GGTCCAAAGAGAGGAGAGAG</td>
		</tr><tr><td>הפוך</td>
			<td>GCCCTGCTTATCCAGTCCTA</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">מקדם mMYT</td>
			<td>קדימה</td>
			<td>CAGCCCAATTCTAGCCACAT</td>
		</tr><tr><td>הפוך</td>
			<td>CCAAAGCAGGGGAGTAGGAG</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רשימת פריימרים qPCR עבור גנים פעילים ולא פעילים המשמשים לבדיקות ChIP-qPCR.

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

פרוטוקול זה מביא למיצוי כרומטין אמין וניתן לשחזור מדגימות כבד קפואות לצורך ניסויים במשקעים חיסוניים של כרומטין. כדי להתחיל, מניחים את הצינור המכיל את הרקמה הקפואה במכתש, ולתת לו לשבת שם במשך חמש דקות. לאחר מכן יש להפעיל לחץ על הדגימה באמצעות פסטל מקורר מראש עד שלא יהיו יותר פירורים מוצקים.הסר את הצינור המכיל את הדגימה מהטיט. מוסיפים 950 מיקרוליטר של PBS קר כקרח עם המעכבים הנדרשים, ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות עד שהדגימה מושהית לחלוטין. מיד להעביר את השעיה רקמות הומוגנייזר, ולהחיל 20 עד 30 שבץ עם Pestle A כדי להשיג השעיה עדינה יותר.הימנעו מהזזת המזיק אל מחוץ לשלב הנוזלי כדי למנוע הקצפה. מעבירים את ההומוגנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר שצונן בעבר על קרח. ואז צנטריפוגה את הצינור במשך חמש דקות ב 1, 300 G וארבע מעלות צלזיוס.בזהירות להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה לחלוטין ב 950 מיקרוליטר של PBS בטמפרטורת החדר על ידי pipetting עדין. לאחר מכן להוסיף 63.6 מיקרוליטר של פורמלדהיד 16% ללא מתנול כדי לקבל ריכוז סופי של 1%סובב מיד את הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, מוסיפים 113 מיקרוליטר של גליצין מולארי 1.25 בטמפרטורת החדר כדי לקבל ריכוז סופי של 125 מילימולרי, ומסובבים את הצינור במשך חמש דקות נוספות.ואז צנטריפוגה את הדגימה ב 1, 300 G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנטנט, ולהשהות מחדש את הגלולה בזהירות על ידי החדרת 950 מיקרוליטר של PBS קר כקרח עם המעכבים הדרושים. צנטריפוגו את הדגימה שוב והשהו מחדש את הגלולה כפי שהודגם קודם לכן.חזור על שלב הצנטריפוגה פעם נוספת ומיד המשך להליך בידוד הכרומטין. מוסיפים 950 מיקרוליטר של Buffer A עם המעכבים הדרושים לגלולה ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג עד שהגלולה מושהית לחלוטין. לאחר מכן סובב את הצינור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר סיבוב, צנטריפוגה את הדגימה ב 2, 000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות להסיר את supernatant. מוסיפים 950 מיקרוליטר של Buffer B עם המעכבים הנדרשים לגלולה ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג עד שהגלולה מושהית לחלוטין. לאחר מכן סובב את הצינור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הסיבוב, צנטריפוגו שוב את הדגימה. הסר את supernatant. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר Buffer C עם המעכבים הדרושים לגלולה פיפטה במרץ.מערבלים את הדגימה למשך 15 עד 30 שניות. לאחר מכן סובב את הצינור לזמן קצר כדי לאסוף את הטיפות על המכסה. לאחר ניקוי דגימת הכרומטין, יש להוסיף 30 מיקרוליטר של תמיסת טריטון X-100 10% ומערבולת למשך חמש עד 10 שניות.צנטריפוגה הדגימה ב 16, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור נקי של 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. מעבירים 10 עד 25 מיקרוליטר של כרומטין גזוז לצינור חדש, ומוסיפים חיץ C כדי להגיע לנפח סופי של 200 מיקרוליטר.Aliquot והלם להקפיא את שאר הכרומטין במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. מוסיפים שמונה מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי מולארי ודגרים לפחות שש שעות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק החימום תוך כדי רעידה ב -1, 000 סל"ד. האריכו את הדגירה למשך הלילה במידת האפשר.לאחר מתן הדגימות להתקרר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, להוסיף שני מיקרוליטר של RNase A ולדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב 1, 000 סל"ד. הסר את הדגימות מבלוק החימום והוסף שבעה מיקרוליטרים של 300 מילימולר סידן כלורי ושני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K.לדגור על הדגימות בבלוק החימום ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תוך כדי טלטול ב 1, 000 סל"ד. בינתיים, להכין צינור הפרדה פאזי אחד עבור כל דגימה על ידי צנטריפוגה אותם עד 16, 000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הסרת הצינורות מבלוק החימום ולתת להם להתאזן בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות, מעבירים 400 מיקרוליטר מהדגימה לצינור הפרדת הפאזה הצנטריפוגי הקודם. לאחר מכן, להוסיף 400 מיקרוליטר של פנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול פתרון, מערבולת במשך חמש שניות. צנטריפוגה הצינור ב 16, 000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של כלורופורם ומערבולת במשך חמש שניות. צנטריפוגו את הצינור למשך חמש דקות נוספות והעבירו 400 מיקרוליטר מהשלב העליון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 24 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי ו-0.75 מיקרוליטר גליקוגן. לאחר מכן מערבלים בקצרה את הצינור.הוסף 1, 055 מיקרוליטר של 100% אתנול. לאחר מכן מערבלים ביסודיות ודגרים על הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה או במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב 16, 000 G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות להסיר את supernatant מבלי לנקוע את הכדור.הוסיפו 500 מיקרוליטר אתנול קר 70% והטו את הצינור בעדינות כדי להבטיח שהגלולה נשטפת. צנטריפוגה הצינור ב 16, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים בזהירות את כל הסופרנאטנט ונותנים לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר.לחלופין, יש לדגור על הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לייבוש מהיר יותר. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת Tris-EDTA והניחו את הצינור על בלוק החימום למשך חמש עד 10 דקות תחת רעידות ב-300 סל"ד. לאחר מכן לנתח את ה- DNA על ג'ל agarose 1%.לאחר הצלבת קישור של כרומטין והדמיה של ה- DNA על ג'ל אגרוז, ניתן לזהות גזירה מוצלחת על ידי נוכחות של שברים בטווח של 100 עד 300 זוגות בסיס. הכרומטין הואץ בהצלחה עם טרימתילציה H3K4, אצטילציה H3K27 ונוגדנים לטרימתילציה H3 K27 ונותח עוד יותר על ידי qPCR. כרומוזום אחד מסגרת קריאה פתוחה 43, פרוטאזום 20S תת-יחידה בטא שתיים, ואזורי מקדם גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז המשועתקים באופן פעיל בכבד הראו העשרה לטרימתילציה H3K4 ואצטילציה H3K27.לשם השוואה, הומיאובוקס C13, הומיאובוקס C12 וגורם שעתוק המיאלין בעכבר אחד מקדמים אזורים מושתקים בכבד לא הועשרו כמצופה. טרימתילציה H3 K27 מראה התנהגות הפוכה, ובכך מאשרת את ההצלחה של המשקעים החיסוניים של הכרומטין או בדיקת ChIP. הכרומטין היה נתון בהצלחה ChIP-Seq.לאחר הריצוף, הקנים יושרו לאינדקס שהוכן מראש והופרדו לפי מינים. טרימתילציה H3K4 ושקיעת אצטילציה H3K27 באתרי התחלה של שעתוק גנים אנטגוניזם עם שקיעת טרימתילציה H3K27 כצפוי. צביר Hox C ידוע בכך שאינו פעיל הן בכבד עכברי והן בכבד אנושי.הפרופיל של טרימתילציה H3K4 ואצטילציה H3K27 מראה שיאים עבור שני שינויים אלה שלאחר התרגום מחוץ לצביר, בעוד שעוצמת האות של טרימתילציה H3K27 נוטה לעלות בתוך אשכול הגנים. מיצוי כרומטין מדגימות רקמה קפואה הוא בעל שונות פנימית גבוהה, תלוי מאוד בעדינות תרחיף התא ובטמפרטורה במהלך קישור צולב. הבטחת תנאי מעבדה קבועים מסייעת בשמירה על יכולת השחזור של טווח גודל המקטעים.

chromatin-extraction-from-frozen-chimeric-liver-tissue-for-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

למדו פרוטוקול למיצוי כרומטין אמין מרקמת כבד קפואה לניתוח משקעים חיסוניים. השיטה מאפשרת חקירת שינויים אפיגנטיים ורגולציה תיעתוקית במחקר ביולוגי מולקולרי.

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

גלה סרטונים נוספים