בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

שיטה זו מאפשרת לך לגדל חיידקים בסביבה המפעילה פיזיולוגיה של תאים דומים ומורפולוגיה של ביופילם לזה שאתה רואה בדלקות ריאות סיסטיק פיברוזיס. הריאות הן מוצרי פסולת בתעשיית הבשר, ולכן אין חששות אתיים. המודל מציע פלטפורמה לחקות זיהום אנושי ללא צורך במודל חיה.

טכניקה זו נותנת לחוקרים דרך חדשה לסנן תרופות מועמדות לפוטנציאל להיכנס ולהרוס את הביופילמים היוצרים בריאות סיסטיק פיברוזיס. עם פיתוח נוסף ואימות, אנו מאמינים כי מודל EVPR יכול להיות שימוש פוטנציאלי עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה מיוחדות ואינדיבידואליות. להשיג ריאות מיד לאחר השחיטה ולהעביר אותם למעבדה בקופסה קרירה ביתית.

לעבוד על משטח מעוקר ומתחת ללהבה. מניחים את הריאות על קרש חיתוך פלסטיק נקי מכוסה רדיד אלומיניום autoclaved, ולבדוק כי הסמפונות להישאר שלם. הריאות אינן מתאימות לשימוש אם נגרם נזק בבית המטבחיים או במהלך ההובלה.

מחממים סכין משטח מתחת ללהבה ונוגעים בקצרה בסכין לאזור הריאה המקיף את הסמפונות כדי לעקר את פני השטח של הרקמה. חותכים את רקמת פני השטח המקיפה את הסמפונות באמצעות סכין גילוח רכוב סטרילי, מה שהופך חתכים במקביל הסמפונות כדי למנוע נזק. לאחר ברונכיול נחשף, להפוך חתך חתך דרך הסמפונות בנקודה הגבוהה ביותר גלוי.

באמצעות מלקחיים סטריליים, להחזיק קלות את הקצה החופשי של הסמפונות ולחתוך את כל הרקמות לא רצויות שנותרו באמצעות סכין גילוח רכוב סטרילי. בצע חתך חתך סופי על פני הסמפונות לפני כל הסתעפות גלוי להסיר את הסמפונות מן הריאות. מניחים את הסמפונות בשטיפת DMEM RPMI 1640 הראשונה.

השאירו אותו בכביסה וקצרו חלקים נוספים של ברונכיולה מאותה ריאה כדי להניב מקטעי רקמות מספיקים לניסוי המתוכנן. מניחים את כל החלקים ברונכיולר נוספים מאותה ריאה לתוך לשטוף ולהשאיר אותם לשטוף לפחות שתי דקות. מוציאים את הסמפונות מהכביסה הראשונה, ומניחים את הדגימות בצלחת פטרי סטרילית.

להחזיק קלות כל ברונכיולה עם מלקחיים סטריליים, מקפיד לא לפגוע ברקמה. הסר כמה שיותר רקמות רכות שנותרו, וחתך את הרקמה לרצועות ברוחב חמישה מילימטרים באמצעות מספריים סטריליים. מניחים את כל רצועות רקמת הסימפונות לתוך הכביסה השנייה DMEM RPMI 1640.

השאירו אותם בכביסה במשך שתי דקות לפחות, ולאחר מכן להסיר את רצועות הרקמה מן הכביסה השנייה באמצעות מלקחיים סטריליים ומניחים אותם בצלחת פטרי נקייה, סטרילית. הסר את כל הרקמות הרכות הנותרות המחוברות לסימפונות, וחתך את הרצועות לריבועים באמצעות מספריים סטריליות. מוסיפים את ה-DMEM RPMI 1640 השלישי לשטוף לתוך צלחת פטרי ומערבבים קלות את חתיכות הרקמה בכביסה על ידי מערבולת המנה.

יוצקים את הכביסה השלישית מתוך צלחת פטרי מבלי להסיר את חתיכות הרקמה. לאחר מכן מוסיפים את שטיפת SCFM הסופית, ומבטיחים שכל חתיכות הרקמה מכוסות. לעקר את הרקמה ב SCFM תחת אור UV במשך חמש דקות.

השתמש מלקחיים סטריליים להעביר כל חתיכת רקמת ברונכיולר מעוקר לתוך בארות בודדות של צלחת 24-well המכיל רפידות SCFM agarose. כדי להדביק כל פיסת רקמה בזן החיידקי הרצוי, גע במושבה הגדלה על צלחת אגר עם קצה מחט 29-מד המחוברת למזרק אינסולין סטרילי של 0.5 מיליליטר, ואז גע במושבה על פיסת הרקמה, דקר בעדינות את פני השטח. עבור פקדים שאינם מושפעים, בעדינות לדקור את פני השטח של חתיכת הרקמה עם קצה המחט, ולאחר מכן להשתמש פיפטה להוסיף 500 microliters של SCFM לכל באר.

לעקר קרום איטום נושם עבור כל צלחת 24-well תחת אור אולטרה סגול במשך 10 דקות. מוציאים את המכסה מהצלחת של 24 מעלות ומחליפים אותו בקרום הנשימה, ואז דגירים את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. הגדר ערכות משכפלות של חתיכות ריאה משתי ריאות עצמאיות לפחות, באמצעות ערכה אחת לשליטה שלילית, וקבוצה אחת לכל ריכוז של אנטיביוטיקה להיבדק.

לאחר 48 שעות של דגירה, לבדוק חזותית את חתיכות רקמה לא מודבקת לצמיחה של חיידקים אנדוגניים, אשר יגרום המדיום סביב חלקים אלה להיות עכור. אם נצפתה צמיחה האופיינית למין המחקר שנבחר, הפעל מחדש את הניסוי עם ריאות טריות. אם מקטעי הרקמה שאינם מושפעים מראים צמיחה חיידקית ללא או מידה מינימלית, הכינו צלחת שטיפה אחת של 24 באר וצלחת טיפול אחת של 24 באר.

כל באר של צלחת הטיפול צריך להכיל 500 microliters של SCFM טרי ללא אנטיביוטיקה, או עם אנטיביוטיקה של עניין. הסר כל פיסת רקמה נגועה מלוח הדגירה עם מלקחיים מעוקרים להבה. מערבבים אותו בקצרה בבאר טרייה של צלחת הכביסה כדי להסיר תאים חיידקיים שאינם קשורים לביופילם ולהעביר אותו לבאר המתאימה של צלחת הטיפול.

לאטום את צלחת הטיפול עם קרום נושם טרי, ולאחר מכן להדגיר אותו ב 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך 18 עד 24 שעות. השתמש מלקחיים מעוקרים להבה כדי להסיר כל חתיכת ריאות מצלחת 24-well, ולשים אותו בצינור הומוגניזציה סטרילי שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של PBS וגרם אחד של חרוזי מתכת. חרוז ניצח במשך 40 שניות בארבעה מטרים לשנייה.

לדלל באופן סדרתי את הריאה הומוגנית באמצעות PBS, צלחת אותו על אגר LB כדי לקבוע את המושבה להרכיב יחידות בודדים, לא מטופל, ואנטיביוטיקה מטופלים חתיכות רקמה. כאשר גדל בריאה חזיר לשעבר vivo או EVPL, biofilms של P.aeruginosa ו S.aureus להפגין סובלנות מוגברת לאנטיביוטיקה לעומת רגישות סטנדרטית, MIC מרק שאושרו בתעשייה ושיחות דיסק באמצעות מדיה סטנדרטית. ההשפעות השונות של אנטיביוטיקה שונים על ביופילם מבוסס EVPL ניתנות להבחנה.

לדוגמה, הרג P.aeruginosa מושגת EVPL עם 4 עד 16X MIC ציפרופלוקסאצין, אבל לא עם 4 עד 8X MIC כלוראמפניקול. אוכלוסיות S.aureus כי הם רגישים linezolid במח"ש הדיסק מסוגלים לשרוד ריכוזי סרום היעד ומעלה ב EVPL. אפילו מבחני חוץ-גופיים ממוטבים אינם יכולים לחזות במדויק את הרגישות של P.aeruginosa לקוליסטין ב- EVPL.

כמות האנטיביוטיקה הנדרשת כדי להשיג שלושה יומן 10 הרג של חיידקים שגודלו EVPL הוא לעתים קרובות גבוה באופן משמעותי מאשר MIC או MBEC מחושב מבחנים במבחנה רגיל. בנוסף להבדלים בין סוכנים אנטי-מיקרוביאליים, מודל זה יכול להדגיש שינויים ברגישות בשלבי צמיחה שונים של חיידקים ובמרווחי מינון אנטיביוטיקה שונים. הסובלנות הגוברת של ביופילמים P.aeruginosa כדי meropenem כפי שהם בוגרים מוצג כאן.

הישרדות S.aureus נמדדה ב 4 ו 24 שעות לאחר החשיפה flucloxacillin, מה שמאפשר לבחון הבדלים בהפחתת ספירת תאים חיידקיים לאורך זמן ובין מבודדים. וריאציות בעומס חיידקי לעתים קרובות להגדיל עם זמני תרבות מורחבת. ניתן לראות זאת בשליטה לא מטופלת לאחר פיתוח ביופילם של 48 שעות וחשיפה נוספת של 24 שעות לחשבון על מרווח מנון אנטיביוטי.

זה חיוני כדי לשמור על טכניקה סטרילית מעולה לאורך הניתוח, ולכן אנו ממליצים לעשות את הניתוח במעבדה או באזור של המעבדה שלך, כי אתה אף פעם לא משתמש לעבודה מיקרוביולוגית. לאחרונה השתמשנו במודל כדי לחקור את כניסתו של קוליסטין לתוך biofilm, ואת המודל יש פוטנציאל טוב לשימוש במחקר כדי לשפר את אספקת תרופות לתוך biofilms.