תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo יכולה לספק מידע בעל ערך כמותי ברמה התאית שיכול לשמש כעצמאי או בשילוב עם טכניקות הדמיה אחרות. תמונת חיישן במצב של הידרציה קפואה, הדרושה לצביעה או לחתך. בנוסף, זוהי טכניקה בתפוקה גבוהה, מכיוון שכל טומוגרמה נאספת תוך דקות ספורות בלבד.

קריו-טומוגרפיה רכה של קרני רנטגן מציעה פלטפורמה מושלמת למעקב אחר תהליך שיקום התאים בתאים נגועים או פגומים ברמת התא הבודד. טכניקה זו יכולה לדווח על היעילות של תרופות אנטי-ויראליות חדשות או על טיפול גנטי כדי להחזיר את הזיהום של פנוטיפים שעברו תיקון. כדי לטעון דגימות למיקרוסקופ קרני הרנטגן ההולכה, יש לקרר את תא ההעברה בחנקן נוזלי עד שיגיע לפחות מ-100 קלווין.

מלאו את תחנת העבודה בחנקן נוזלי נוסף והפעילו את תנור החימום של שפת תחנת העבודה. כאשר שפת תחנת העבודה מפסיקה לרתוח, הניחו את תיבת ה-cryo המכילה רשתות למיקומים המתאימים בתחנת העבודה בתנאי cryo וטענו את הרשתות על מחזיקי הדגימות שקודרו בעבר. העמיסו את המחזיקים על המעבורת והגנו עליהם עם הכיסויים.

טען את המעבורת לתא ההעברה בפחות מ-100 קלווין ושאב את התא לשואב ואקום נמוך. חברו את תא ההעברה למיקרוסקופ ועקבו אחר הליך הוואקום על המסך כדי לטעון את מעבורת תא ההעברה למיקרוסקופ. לאחר שהמעבורת נמצאת במיקרוסקופ עם הדגימות, השתמש בזרוע הרובוט של המיקרוסקופ כדי להעביר מחזיק דגימה אחד לשלב הדגימה.

להדמיית שדה בהיר של הרשת באמצעות מיקרוסקופ האור הנראה המקוון, בחר במצלמת מיקרוסקופ האור הנראה והפעל את מקור ה-LED של מיקרוסקופ האור הנראה להדמיית שדה בהיר. לחץ על תטא תנועה, בקרה, דגימה ודגימה כדי לסובב את הדגימה למינוס 60 מעלות כך שהיא תפנה למטרה של מיקרוסקופ האור הנראה, ובחר בקרת תנועה ומדגם ושנה דגימה X ודגימה Y כדי להעביר את הדגימה למיקומים הממורכזים הצפויים. בחר מיקרוסקופ, הגדרות רכישה, רכישה, מצבי רכישה, רציף, והתחל ולחץ על בקרת תנועה ודגימה כדי לבחור דגימה Z כדי לחדד את המיקוד עם צעדים קטנים יותר עד חמישה מיקרון עד שהתאים ו /או החורים של סרט התמיכה בפחמן יהיו בפוקוס.

לאחר מכן בחר מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, מצבי רכישה, פסיפס, והתחל ברכישת מפת פסיפס מלאה של הרשת במצב brightfield תוך שימוש בערכי ברירת המחדל של הפסיפס. להדמיית פסיפס במצב פלואורסצנטי, כבו את מקור ה-LED של מיקרוסקופ האור הנראה להדמיית שדה בהיר ובחרו את מקור תאורת ה-LED המתאים לאורך הגל הרצוי של העירור ואת המסנן האופטי המתאים באופן ידני בהתקנה. בחר מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, מצבי רכישה, רציף, והתחל ולחץ על בקרת תנועה ודגימה כדי לבחור דגימה Z כדי לחדד את ההתמקדות בתמונת הפלואורסצנציה.

לאחר מכן, לחץ על מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, מצבי רכישה, פסיפס והתחל לרכוש מפת פסיפס השומרת על הפרמטרים המיקום X ו- Y מפסיפס ברייטפילד. לאחר מכן, כבו את מקור תאורת ה-LED. לרכישת פסיפס רנטגן, החליפו את חריץ היציאה לחמישה מיקרון והשתמשו בחשיפה של שנייה אחת ב-MISTRAL.

בחר מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, הגדרות מצלמה ובינינג כדי להתאים את המיקוד באמצעות תרגום Z לדוגמה. בחר בקרת תנועה ודגימה כדי לבחור דגימה Z.החל בשלבים של חמישה מיקרון, מקד את המיקוד עד שלבים של 0.5 מיקרון עד שהתא או חורי רדיד הפחמן נמצאים במיקוד טוב. כדי לרכוש מפת פסיפס של ריבוע הרשת, לחץ על מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, מצב רכישה, פסיפס והתחלה.

לאחר רכישת המפה, לחץ על בקרת תנועה ודוגמה ושנה דגימה X ודגימה Y כדי להעביר את הדגימה למיקום שדה שטוח. הגדר את זמן החשיפה לשנייה אחת ב- MISTRAL. לאחר מכן, לנרמל את הפסיפס שנרכש על ידי תמונת השדה השטוח כדי לקבל את השידור ולשמור את הפסיפס המנורמל.

כדי ליישר את המדגם על ציר הסיבוב עם הסיבוב באפס מעלות, בחר בקרת תנועה ומדגם ושנה את המדגם X, דגימה Y ודגימה Z כדי להתמקד בתכונה של התא לשים על ציר הסיבוב. כדי לסובב את הדגימה למיקום תטא חיובי, בחר בקרת תנועה ומדגם ושנה את תטא הדגימה לתטא חיובי. השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו על התכונה של התא כדי לשים על ציר הסיבוב.

כדי לסובב את הדגימה למיקום תטא שלילי, בחר בקרת תנועה ומדגם ושנה את תטאת הדגימה לתטא שלילי. השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו על התכונה של התא כדי לשים על ציר הסיבוב. בעוד במיקום תטא חיובי או שלילי, השתמש בתרגום לדוגמה Z כדי להזיז את התכונה שנבחרה למיקום המרכז בין שתי השורות ולחזור על סיבוב הדגימה עד לקבלת מרחק מינימלי בין שורה לקו.

כאשר תטא הדגימה שווה לאפס, הזז את הדגימה X למרחק כפול הדרוש כדי להציב את התכונה שנבחרה במרכז שדה הראייה, והזז את לוחית האזור X כדי להחזיר את התכונה למרכז שדה הראייה. כדי למטב מחדש את מיקום לוחית האזור Z ביחס לציר הסיבוב החדש, בחר מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, מצבי רכישה וסדרת מוקד ולחץ על התחל כדי להקליט סדרת מוקד של לוחית אזור Z. לאחר מכן, לחץ על בקרת תנועה ולוחית אזור ובחר לוחית אזור Z כדי להזיז את לוחית האזור Z למיקום שבו המדגם נמצא במיקוד.

כדי לרכוש טומוגרמה, לחץ על בקרת תנועה ודוגמה ובחר Sample theta כדי להזיז את הזווית המרבית השלילית ל- plus 0.1. לחץ על מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, מצבי רכישה וטומוגרפיה כדי להגדיר את מספר התמונות כמספר הכולל של הזוויות, תוך התחשבות בתמונה בזווית אפס ובטווח הזוויתי, ולהגדיר את מספר התמונות. בחר התחלת זווית וסוף זווית, לחץ על מיקרוסקופ, רכישה, הגדרות רכישה, הגדרות מצלמה והגדר את זמן החשיפה.

לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישת סדרת הטיית הטומוגרפיה. הדגימה האידיאלית צריכה לכלול תאים בודדים במרכזה של רשת מרובעת המוטבעת בשכבה דקה של קרח ומוקפת בסמנים פידוקיאליים מוזהבים מפוזרים היטב. אברונים רבים ושונים, כגון מיטוכונדריה, רטיקולה אנדופלסמית, vacuoles, ואת הגרעין צריך להיות מסוגל להיות מסוגל להבחין בטומוגרמה המשוחזרת הסופית, הודות לשחזור כמותי של מקדמי הקליטה הליניאריים.

בתמונה זו ניתן לראות ריבוע עם צפיפות תאים גבוהה יותר. בדוגמה זו, הכתם היה פחות יעיל, מה שהוביל לשכבת קרח עבה יותר עם סדקים. אף על פי שניתן לזהות כמה מבנים גדולים יותר בהכנה זו, פרטים עדינים אבדו בתוך הרעש והמרקם הגרגרני בשל איכות ההשחתה הירודה של הקרח העבה.

יש לטפל באופן מינימלי בדגימה שהשתמרה בקריו, שכן רוב הממצאים מושרים כאשר הדגימות בשלב זה. בדרך כלל, פוטומיקרוסקופיה של אור נראה קריו-קורלטיבי, אתה משתמש בטומוגרפיה של מצע קריו לפני הקריו. בנוסף, מיקרוסקופיה ספקטרלית יכולה להיעשות ביסודות כימיים רלוונטיים.

פרוטוקול זה ממלא נישה על ידי פעולה במשטר דגימות ורזולוציה, שאינם נגישים בקלות על ידי כל טכניקת הדמיה ישירה אחרת, ומאפשרים מעט מיקרונים ורזולוציה של 30 ננומטר בחצי גובה הצליל.