אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

אנדותל למעבר mesenchymal הוא תהליך תאי שבו תאי אנדותל לשנות מורפולוגיה מרוצפת שלהם לתוך פנוטיפ דמוי פיברובלסט. ואת ציטוקינים TGF-בטא, שינוי בטא גורם גדילה, הוא המניע העיקרי של המעבר הזה. ניתוח השינויים במורפולוגיה של התאים ורמות הביטוי של סמנים אנדותל ו mesenchymal מאפשר לנו להעריך את המופע של אנדותל למעבר mesenchymal.

נתונים חדשים מקשרים את האנדותל לתהליך המעבר mesenchymal למחלות שונות כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, פיברוזיס. והנתונים מצביעים על כך שההתערבות עשויה להיות לתועלת טיפולית. על ידי גירוי האנדותל לתהליך המעבר mesenchymal, המתרחשת במהלך עוברי והתפתחות איברים, אנו עשויים להיות מסוגלים לחדש רקמות mesenchymal נגזר כגון סחוס, עצם, ושרירים.

כדי לזהות את החלבון תאיים על ידי צביעת immunoflourescence, חדירות התא באמצעות 0.1%Triton X-100 יש צורך לאפשר את הנוגדנים לעבור דרך קרום התא. עם הדגמת וידאו זו, החוקרים יקבלו הבנה טובה של איך לחקור את התפקיד של ציטוקינים כגון TGF-בטא אנדותל למעבר mesenchymal. ראשית, זרע 1 x 10^5 שיקוף תאי MS1 אנדותל איון הלבלב ב DMEM בתוספת 10%FBS ו 100 יחידות למיליליטר של פניצילין ו סטרפטומיצין על צלחת תרבות מצופה 0.1% ג'לטין.

לאחר דגירה לילה באינקובטור תרבית התא, לשטוף את התאים עם PBS לפני הטיפול עם שני מיליליטר של 0.25%trypsin, 0.02% פתרון EDTA במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים החלו להתנתק, להרוות את התגובה עם חמישה מיליליטר של מדיום תרבות מלאה ולהעביר את ההשעיה התא וכתוצאה מכך צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. להחזיר את גלולה בארבעה מיליליטר של מדיום שלם טרי לספירה.

וזרע 1 X 10^3 תאים לסנטימטר מעוקב לתוך מיכל תרבות תא חדש. לאחר תרבות הלילה, לטפל בשתי בארות עם חמישה מעכבי קולטן מיקרומולאר TGF-בטא קינאז SB-431542 ושתי בארות עם בקרת ממס DMSO. ומניחים את התאים באינקובטור תרבית התא במשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, לטפל בשתי בארות עם בקרת רכב ושתי בארות עם TGF-בטא 2. לאחר שלושה ימים, השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבחון את מורפולוגיה התא של כל קבוצת טיפול בתאים תחת הדמיה brightfield. כדי להעריך שינויי סמן הקשורים ל- endMT על-ידי כתמי כשל חיסוני, נתק את התאים מתרבות תאים מתאימה של MS1, כפי שהוכח.

ולזרע את התאים ב 1.9 X 10^3 תאים ריכוז על 0.1% מצופה ג'לטין 12 מילימטר עגול כיסוי כוסות להציב בתוך בארות בודדות של צלחת 24-well. לאחר תרבות הלילה, לטפל בתאים עם מיליליטר ננוגרם אחד של TGF-בטא 2 במשך שלושה ימים. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם PBS ולתקן את התרבויות המטופלות עם 300 microliters של 4% פורמלדהיד לבאר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הקיבעון, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS לפני חדירת התאים עם 300 microliters של 0.1% טריטון X-100 ו PBS לכל באר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים PBS ולחסום את התאים עם 3%BSA ב PBS. לאחר 45 דקות בטמפרטורת החדר, סמן את התאים בנוגדנים ראשוניים PECAM-1 ו- SM22-alpha במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות ב- PBS.

לאחר הכביסה האחרונה, דגירה את התאים עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS לפני הרכבה התאים עם מדיום הרכבה בתוספת DAPI להחליק כיסוי. לאחר מכן לאטום את הקצוות של כיסוי להחליק עם לק ברור תמונה ביטוי סמן התא על ידי מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי באמצעות המסננים המתאימים על פי פרוטוקולי הדמיה סטנדרטיים. לאחר שלושה ימים של טיפול עם TGF-בטא 2, תאי MS1 אנדותל לאבד את המבנה שלהם מרוצף אבן כמו להבדיל לתוך תאים דמויי mesenchymal בצורת ציר.

זה TGF-בטא 2 התמיינות המושרה מדוכא כאשר התאים נחשפים מעכבי קינאז קולטן TGF-בטא SB-431542. הביטוי של חלבון אנדותל PECAM-1 הוא ירד בחוזקה לאחר TGF-בטא 2 גירוי בעוד גורם mesenchymal SM-22 אלפא הוא upregulated עמוק. בנוסף, חילזון הוא upregulated במידה ניכרת על ידי חשיפה TGF-beta 2 בעוד ביטוי שבלול אינו מושפע.

כפי שנצפה CRISPR-Cas9 עריכת גנים ניתן להשתמש כדי להקל על כניסתה של שני RNAs מדריך יחיד חילזון עצמאי לתוך Cas9-ביטוי MS1 תאים כדי לשבש את הביטוי חילזון. הנוקאאוט של חילזון מספיק כדי לעכב את מורפולוגיה תא דמוי פיברובלסט מונע על ידי TGF-בטא 2 בתאי MS1 וכדי לחסום את TGF-בטא 2 תיווך PECAM-1 ירידה SM-22 שיפור אלפא. ההערכה של שינויים במורפולוגיה של התא וביטוי של סמנים אנדותל ו mesenchymal על ידי immunofluorescence ניתן לאמת עוד יותר על ידי מדידת הביטוי של סמנים אלה על PCR כמותי בניתוח כתם מערבי.

טכניקה זו לגילוי אנדותל למעבר mesenchymal אפשרה לחוקרים לחקור משמעות זו המתעוררת כתהליך פיזיולוגי המתרחש במחלות מרובות.