הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן
6 בנובמבר 2021
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בהתקן מהיר לייצור רשת הן לייצור רשת מהירה והן לערבוב מהיר והקפאה כדי לבצע ניסויים שנפתרו בזמן.
שלום, וברוכים הבאים לסרטון הזה של ג'וב. אנחנו רוצים להציג בפניכם את ההתקנה שיש לנו כאן ליצירת רשת מהירה, מחקר שנפתר בזמן שאנחנו מפתחים בלידס. שימו לב שזו לא מערכת סטנדרטית, אבל אנחנו מקווים שאם תיתן לכם תיאור מפורט של כל הדברים והפרמטרים שאנחנו עושים, תוכלו לפתח מערכות דומות במעבדות שלכם.
תיאור מפורט של המכשיר ניתן בפרוטוקול ריצ'מונד. כאן, אנחנו הולכים לתת מדריך צעד אחר צעד להכנת רשת מהירה EM נפתר זמן. מניסיוננו, ריכוז החלבון צריך להיות שני מיליגרם למיליליטר ומעלה. הפרוטוקול דורש נפח מינימלי של כ-50 מיקרוליטרים.
הפעל את ההתקן. לאחר מכן הפעל את מחשב הבקרה והפעל את תוכנת הבקרה. אתחל את כל משאבות המזרק על-ידי לחיצה על לחצן האתחול בכל משאבת מזרק.
הפעל את ספק הכוח של פוטנציומטר, הגדר אותו לתשעה וולט והפעל את תוכנת בקרת האוסצילוסקופ. גז חנקן בלחץ נדרש כדי ליצור את התרסיס. פתח את גליל החנקן והגדר את הלחץ ל-2 ברים.
ודא שכל שסתומי משאבת המזרק נמצאים במצב עומס. כדי לעשות זאת, לעבור את כל השסתומים לוותר בתוכנת הבקרה ולאחר מכן בחזרה לטעון. הגדר את כל המזרקים לאפס.
יש להסיר בשלב זה את כל בועות האוויר הקיימות במערכת. כדי לעשות זאת ייתכן שיהיה צורך לפתוח את המזרקים, להסיר בועות באופן ידני, והמזרקים רכובים שוב כאשר אינם מכילים בועות נוספות. מערכת הטיפול בנוזלים מאוחסנת בדרך כלל במים.
לפני טעינת המדגם, המערכת היא מכויל עם חוצץ. זה נעשה על ידי שטיפת הצינורות עם עודף של חוצץ. מניחים צינור המכיל לפחות 200 מיקרוליטרים של חוצץ על מזרק אחד.
החלק העליון של הצינור חייב להיות פירסינג כדי לחבר אותו. שאפו כמות מתאימה של חוצץ, בין 50 למאה מיקרוליטרים עם מזרק אחד באמצעות תוכנת הבקרה. תחליף שסתום אחד לוותר.
מחלקים את כל הנוזל במזרק אחד. החזר שסתום אחד למיקום העומס, ולחץ על כפתור האתחול על מזרק אחד כדי להכין את המערכת למחזור לשטוף הבא. צעדים אלה חוזרים בדרך כלל שלוש פעמים כדי להבטיח כביסה יסודית של הצינורות.
לאחר מכן, זרבובית הריסוס ממוקמת. הנח רשת EM בזרוע הצלילה. מקם את הרשת מול זרבובית הריסוס.
החל מאגר באמצעות תוכנת הבקרה. אם זרבובית ורשת מיושרים, נוזל צריך להצטבר לאחר ריסוס במשך תקופה ממושכת של זמן. במידת הצורך, להתאים את מיקום הזרבובית ולאחר מכן לבדוק שוב איפה הנוזל מצטבר על הרשת.
לאחר מכן, להתאים את המיקום של האתאן. קצה פינצטה צריך להגיע בערך למרכז האתאן. בצע הרצת בדיקה כדי לוודא שכל ההגדרות נכונות.
סגור את תא הלחות. ודא שהנתיב של הבוכנה פנוי. שאף את נפח המאגר הנדרש לריצה בודדת למזרק אחד.
תחליף שסתום אחד לוותר. התחל את ההפעלה על-ידי הקשה על הפעל בתוכנת הבקרה. בדוק כי משאבת מזרק אחד נע, שתי שניות במקרה זה, והרשת צוללת לאחר עיכוב מתאים, 1.5 שניות כאן.
כאשר הריצה מסתיימת, הגדר את הלחץ על זרוע הבוכנה לערך הרצוי. לחץ על OK'in תוכנת הבקרה כדי לשחרר את הלחץ מזרוע הצלילה. עכשיו האתאן קרירה ומלאה באתאן נוזלי.
תזרים את הרשתות לפני השימוש. פריקה זוהרת טיפוסית היא 90 שניות ב-10 מיליאמפר באוויר של 0.1 מיליבר. לאחר מכן, הצינורות מכוילים עם דגימה.
אם נפח הדגימה הזמין נמוך, ייתכן שהצינורות ישוללו עם נפח מת אחד בלבד. דגימת שאיפה. בדרך כלל הנפח המת הוא סביב 30 מיקרוליטרים.
תחליף שסתום אחד לוותר. מחלקים את הדגימה דרך צינורות וזרבובית. לאחר מכן שאף את כמות המדגם הנדרשת להפעלה אחת.
תחליף שסתום אחד לוותר. בדוק שהלחות היחסית הגיעה לערך הרצוי. בדרך כלל אנו מכינים רשתות ב- 60% ומעלה.
זה יכול לקחת כמה דקות. מניחים את פינצטה מחזיקים רשת זוהרת בזרוע צוללת. מקם את שקופית הפוטנציומטר במצב ההתחלה, מוכן למדידת מהירות.
הגדר את הגורם המפעיל למדידת המהירות בתוכנת האוסצילוסקופ. מניחים את האתאן הנוזלית, וקרוב לתא הלחות. ודא שהנתיב של הבוכנה פנוי.
התחל את ההפעלה בתוכנת הבקרה. בסיום הריצה, לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי לשחרר לחץ מזרוע הצלילה. פתחו את תא הלחות, שחררו את הקשר בין זרוע צוללת לפינצטה.
התקדם בזרוע הצוללת תוך שמירה על הרשת באתאן נוזלי. לאחר מכן להעביר את הרשתות לחנקן נוזלי לאחסון. שמור את מדידת האוסצילוסקופ.
אפס באופן ידני את המיקום של המחוון והבולסן של potentiometer. חזור על הפרוטוקול כדי להכין רשתות שכפול. ניסויים שנפתרו בזמן נעשים באופן דומה.
ריכוזי מלאי גבוהים יותר נדרשים לניסויים שנפתרו בזמן בגלל דילול בשלב הערבוב. לניסוי שנפתר בזמן, השתמש בכל שלושת המזרקים. הצינורות מחוברים למשאבות המזרק ולזרבובית הריסוס.
זרבובית הריסוס המיקרופלואידית המשמשת כאן מכילה גם אלמנט ערבוב. שים לב כי צינורות ארוכים יותר ייתן נפח מת גדול יותר וצעדי שיווי משקל כביסה דורשים יותר חוצץ ודגימה. ישילב את כל המזרקים עם חוצץ ודגימה בנפרד.
בדרך כלל, מזרק אחד משמש לדגימה A ומזרקים שתיים ושלוש משמשים לדגימה B'לאחר הצינורות הוא שיווי משקל, לטעון מדגם A לתוך מזרק אחד לדגום B לתוך מזרקים שתיים ושלוש. לאחר מכן, לעבור שסתומים אחד עד שלושה לוותר. התחל את ההפעלה בתוכנת הבקרה.
שים לב שנדרש קובץ Script אחר של הפעלה עבור ניסוי שנפתר בזמן. עיכובים שונים בזמן ניתן להשיג בשתי דרכים. על ידי התאמת מהירות הבוכנה, ניתן לשנות את עיכוב הזמן מערבוב להקפאה.
מהירות צלילה מהירה יותר תוביל לעיכוב זמן קצר יותר. לחלופין, מרחק האתאן ספריי משתנה על ידי התאמת המיקום האנכי של זרבובית ספריי. הגדלת המרחק תגרום לעיכוב זמן ארוך יותר.
במיקרוסקופ האלקטרונים בהגדלה נמוכה, רשת טיפוסית נראית כך. אזורים של קרח דק, כאמור, מתאימים לרכישת נתונים. בהגדלות גבוהות יותר, חלקיקים צריכים להיות גלויים בבירור.
עם דגימת בדיקה כגון אפופריצין, ערכת נתונים קטנה יחסית מרשת אחת מספיקה לשחזור ברזולוציה של שלוש עד ארבע אנגסטרום. עבור ניסויים שנפתרו בזמן, אנו אוספים ערכות נתונים מנקודות זמן או רשתות שונות. זה שימושי כדי לשלב את הנתונים עבור סיווג 3D ולאחר מכן לעקוב אחר חלקיקים בחזרה לנקודות הזמן שלהם.
בדרך זו הנתונים יכולים לספק מידע מבני ומידע על קינטיקה התגובה. לסיכום, אנו מקווים שנהניתם מהסרטון. אנו מקווים כי עם התיאורים המפורטים בעיתון JoVE יחד עם הווידאו, תוכל לערוך ניסויים משלך באמצעות ייצור רשת מהירה, אשר הוכח כדי להקל על חלק מהבעיות ממוטציה או כדי לעזור עם אינטראקציות בממשק מי האוויר, כל מה שאתה צריך כדי לנהל מחקרים פתורים בזמן שלך כדי לנסות ללכוד כמה מאותם מצבים שאינם שיווי משקל.
אז, רשת שמחה עושה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לשימוש במכשיר יצירת רשת מהירה, שנועד להכנת רשת מהירה וניסויים מפורטים בזמן. הדגש הוא על מתן מדריך שלב אחר שלב כדי להקל על הקמת מערכות דומות במעבדות שונות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה מבנית
רקע
- יצירת רשת מהירה היא חיונית למחקרים מפורטים בזמן.
- הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקול ריצ'מונד.
- ריכוז החלבון הוא קריטי להצלחת הניסויים.
- נדרש נפח מינימלי של 50 מיקרוליטר עבור הפרוטוקול.
מטרת המחקר
- לפתח מערכת ליצירת רשת מהירה לניסויים מפורטים בזמן.
- לספק מדריך מקיף לחוקרים כדי לשכפל את ההתקנה.
- לשפר את היעילות של הכנת הרשת במחקרים מבניים.
שיטות ששימשו
- שימוש במכשיר יצירת רשת מהירה.
- פרוטוקול שלב אחר שלב להכנת הרשת.
- טכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים מפורטות בזמן (EM).
- אופטימיזציה של ריכוז החלבון ונפח הדגימה.
תוצאות עיקריות
- יישום מוצלח של מכשיר יצירת הרשת המהירה.
- דמותה יעילות בהכנת רשת למחקרים מפורטים בזמן.
- סיפק תובנות לגבי ריכוזי חלבון אופטימליים.
- הקל על הפיתוח של מערכות דומות במעבדות אחרות.
מסקנות
- מכשיר יצירת הרשת המהירה יעיל לניסויים מפורטים בזמן.
- פרוטוקולים מפורטים יכולים לסייע לחוקרים במאמצים דומים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על מתודולוגיה זו לניתוח מבני משופר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid grid preparation for cryo-EM enables the capture of transient molecular states, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. By reducing the time from sample mixing to freezing to as little as 10 ms, this approach supports high-resolution structural analysis of short-lived intermediates, informing target validation and lead identification. The protocol's reproducibility and adaptability position it as a scalable capability for enterprise discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of dynamic protein conformations and reaction intermediates.
- Supports mechanistic de-risking by revealing transient structural states relevant to function.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cryo-EM grids suitable for high-throughput structural screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for comparative analysis across conditions.
- Enables rapid assessment of compound-induced structural changes in proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-resolution data on functional states.
- Enables integration of structural insights into preclinical model selection and biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This rapid grid preparation protocol fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening-based workflows in structural biology.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing by capturing non-equilibrium states for mechanistic clarity.
- Screening: Provides standardized, reproducible grids for downstream cryo-EM analysis and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of structural changes and reaction kinetics across time points.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by linking structural intermediates to functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable protocol for diverse protein systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing high-resolution, time-resolved structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and sample handling.
- Needs access to microfluidic dispensing, precise timing controls, and cryogenic infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid quality and data comparability.
- Adaptable to various protein systems but may require optimization for sample concentration and ice thickness.
- Increased ice thickness at higher speeds may limit data quality for some applications.
