ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

פרוטוקול זה מאפשר בידוד ותרבות יעילים של תאי RPE של העכבר. תרבויות RPE עכבר ראשוני בריא הם מודלים בעלי ערך כדי להבין את המנגנונים של מחלות עיניים הבסיסית. תרבויות RPE קונפלונטיות ובת קיימא להשיג בתוך שלושה ימים ניתן לגדל במשך שבועות.

פרוטוקול זה שימש בהצלחה להבנת המנגנונים שבבסיס ניוון מקולרי הקשור לגיל צעיר, שהוא הגורם המוביל לעיוורון בקרב קשישים במדינות מפותחות. חשוב לדמיין את שלבי הניתוח. הפרטים הם קריטיים להצלחת הפרוטוקול, למשל, כיצד להתמודד עם גלגלי העיניים כך הסקלרה לא אגרוף, איפה בדיוק חתכים צריך להתבצע, וכיצד להטמיע את כוסות העין ב trypsin, כך שהם יישארו פתוחים.

התחל בהכנת כל הריאגנטים הדרושים לפרוטוקול. לאחר מכן, התחל לנקות את גלגל העין על-ידי הסרה קפדנית של כל רקמת החיבור, הדם והשרירים, באמצעות מלקחיים ומספריים זוויתיים של Dumont, מבלי לבצע חתכים בסקלרה. מעבירים את גלגל העין למנה טרייה המכילה שלושה מיליליטר של חיץ HBSS נטול HEPES באופן קבוע כדי לשמור על העין רעננה ונקייה ולהימנע מזיהום כלשהו.

השתמש בעצב הראייה כמו ידית להחזיק את גלגל העין ולעשות חור במרכז הקרנית עם להב חד פחמן פלדה מספר 11. לעשות שלושה חתכים בקרנית דרך החור עם Dumont מספר חמש מספריים, להבטיח כי יש מספיק מקום כדי להסיר את העדשה. החזיקו את עצב הראייה והפעילו לחץ קל על האורה סראטה עם בסיס המספריים הזוויתיים, עד שהעדשה יוצאת לחלוטין.

שמור על אפיתל הקשתית שלם כדי למנוע את ניתוק הרשתית העצבית ו- RPE במהלך הדגירה. הנח את העין במאגר HBSS נטול HEPES. דגירה את העיניים ללא עדשות בתמיסת hyaluronidase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות ב 5% פחמן דו חמצני aerated חממה לנתק את הרשתית העצבית מן RPE.

מניחים כל עין בבאר חדשה עם 1.5 מיליליטר של חיץ HBSS HEPES קר לכל באר ולהדגיר אותו על קרח במשך 30 דקות. לאחר הכביסה, מניחים כל עין לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר עם חיץ HBSS HEPES טרי. חותכים את הקרנית דרך החתכים המקוריים עם מספריים ונאס שמונה סנטימטרים עד אורה serrata הוא הגיע, ולאחר מכן לחתוך מתחת אורה סראטה כדי להסיר את אפיתל הקשתית וקרנית.

החזק את אורה serrata עם פינצטה מעוגלת באמצעות מלקחיים מיקרו זוויתי, למשוך את הרשתית העצבית, לוודא כי שכבת RPE לא נחתך. לאחר מכן, לחתוך את ההחזקה הפנימית לעצב הראייה. חותכים את עצב הראייה ומעבירים כל עין לצלחת שונה של 12 באר המכילה 1.5 מיליליטר של טריפסין-EDTA טרי לבאר.

ודא כי כוסות העין להישאר פתוח שקוע לחלוטין טריפסין. דגירה כוסות העין ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות באינקובטור 5% פחמן דו חמצני. לאסוף כל עין יחד עם כל יריעות RPE מנותק במהלך הדגירה טריפסין ולהעביר אותם לתוך צלחת 12 גם המכיל 1.5 מיליליטר של פתרון FBS לכל באר.

אם גליונות RPE נשארים בתמיסת הנסיון, השתמש במיקרופיפט כדי להעביר אותם לבאר עם פתרון FBS. החזק כל עין על ידי עצב הראייה ולנער אותו עם הפנים כלפי מטה לתוך צלחת 12 גם המכיל 1.5 מיליליטר של 20%FBS במאגר HBSS HEPES עד ניתוק מלא של גיליונות RPE מושגת. לאסוף את כל יריעות RPE ואשכולות RPE עם micropipette, הימנעות כל חתיכות לבנות של סקלרה או choroid, אשר יכול לזהם את התרבויות, ומניחים אותם בצינור 15 מיליליטר.

משוך שתי עיניים מאותו עכבר בצינור אחד. לאחר מכן, צנטריפוגה תערובת RPE ב 340 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. בעדינות resuspend גלולת RPE בתערובת מיליליטר אחד של 0.25%trypsin-EDTA ו הדגירה אותו במשך דקה אחת באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לפזר את יריעות RPE לתאים בודדים.

ואז בעדינות פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים, הימנעות היווצרות בועה. מוסיפים תשעה מיליליטר של מדיום RPE שהוכן טרי כדי לדלל ולהשבית את טריפסין וצנטריפוגה התערובת ב 340 x g במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant בזהירות resuspend גלולת התא ב 150 מיקרוליטרים של מדיום RPE עם 5%FBS.

לאחר מכן, להסיר PBS מהתא התחתון של תוספת קרום מצופה למין שהוכן בעבר ולהוסיף 700 מיקרוליטרים של RPE בינוני אליו. הסר את הלאמינין מהתא העליון של תוסף הממברנה ולהפיץ את ההשעיה תא RPE טיפה חכם אחיד למרכז התא. מניחים את הממברנה להחדיר באין מפריע באינקובטור 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות.

לאחר מכן בדוק את תוסף הממברנה מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שרוב תאי ה- RPE מחוברים לתוסף ושהכנס הוא לפחות 50%אל תשנה את המדיה במהלך 72 השעות הראשונות. תאי RPE מבודדים באמצעות פרוטוקול זה הראו את הגודל הטיפוסי של RPE, מורפולוגיה ופיגמנטציה. מונולייר RPE מקוטב מאוד עם שני גרעינים הצטרפו צמתים הדוקים, יחד עם נוכחות של microvilli apical ו infoldings הבסיס, נצפתה לאחר שבוע.

קיטוב של מונולייר RPE אושר על ידי ערכי TER, עם ממוצע גבוה מ 200 אוהם סנטימטר בריבוע, אשר נשאר יציב לאורך זמן. ב מבחני phagocytosis שבוצעו על FITC שכותרתו בקר קופה, בליעה ועיכול של קופה נצפתה, המציין היווצרות של monolayer confluent פונקציונלי של תאי RPE. תרבויות בנות קיימא דורשות זמן ניתוח קצר, אשר מושגת עם ניסיון.

תאי RPE מסוימים עשויים להישאר מחוברים לרשתית העצבית, אך אם מספר גיליונות RPE יישארו מחוברים, הפרוטוקול לא יצליח. hyaluronidase טרי יש להשתמש בכל פעם כדי למנוע בעיה זו. אלה תרביות תא RPE עכבר ראשי פונקציונלי הם כלי רב ערך כדי ללמוד את הפתוביולוגיה של RPE במחלות עיניים רבות.

לדוגמה, פרוטוקול זה אפשר ללמוד את הפתוביולוגיה של RPE במודל עכבר של ניוון מקולרי.