Name: משלוח של Cas9/ sgRNA ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס (Nanoblades) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד כיצד להכין ולהשתמש ב-Nanoblades למשלוח זמני ויעיל של מערכי Cas9/sgRNA לעריכת גנום בתאים מונצחים וראשוניים. שיטה זו מציעה חלופה נגישה לוקטורים ויראליים קלאסיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) של אוניברסיטת ליון, במסגרת התוכנית Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) המופעלת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ33306) ועל ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-StG-LS6-805500 ל- E.P.R.) במסגרת תוכניות המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי.

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome-editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).</li>
<li>Mangeot, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+primary+cells+and+in+vivo+using+viral-derived+Nanoblades+loaded+with+Cas9-sgRNA+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins.</a> Nature Communications. 10 (1), 45(2019).</li>
<li>Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+by+lentiviral+protein+transduction+of+zinc-finger+and+TAL-effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases.</a> eLife. 3, 01911(2014).</li>
<li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).</li>
<li>Gee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nanovesicles+for+packaging+of+CRISPR-Cas9+protein+and+sgRNA+to+induce+therapeutic+exon+skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping.</a> Nature Communications. 11, 1334(2020).</li>
<li>Indikova, I., Indik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing+with+unconcentrated+lentivectors+carrying+Vpr.Prot.Cas9+protein+produced+from+RRE-containing+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts.</a> Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).</li>
<li>Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+Cas9%2FsgRNA+ribonucleoprotein+%28RNP%29+by+lentiviral+capsid-based+bionanoparticles+for+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47 (17), 99(2019).</li>
<li>Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+release+of+HIV-1+precursor+Pr55gag+virus-like+particles+from+recombinant+baculovirus-infected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells.</a> Cell. 59 (1), 103-112 (1989).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual.+Third+edition%22">Molecular cloning a laboratory manual. Third edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875(2015).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+create+state-of-the-art+genetic+model+systems%3A+strategies+for+optimal+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR%2FCas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).</li>
<li>Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+production+of+transgenic+mice%3A+a+simple+and+highly+efficient+method+for+direct+study+of+founders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57609(2018).</li>
<li>Montagna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-enveloped+vesicles+for+traceless+delivery+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).</li>
<li>Marnef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin%2FHUSH-+and+LINC-dependent+pathway+controls+ribosomal+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).</li>
</ol>

פיליפ א. מנגוט ואמיליאנו פ. ריצ'י נקראים כממציאים על פטנט הנוגע לטכנולוגיית Nanoblades (מועמדים לפטנטים: המכון הלאומי דה לה סנטה et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; מספר יישום: WO 2017/068077 Al; מצב פטנט: פורסם, 27 באפריל 2017; כל ההיבטים של כתב היד מכוסים על ידי בקשת הפטנט. המחברים הנותרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Nanoblades לאפשר משלוח מהיר ותלוי במינון של קומפלקס Cas9/ sgRNA RNP בשורות התא ותאים ראשיים. בניגוד לטרנספקטיה קלאסית וקטורים ויראליים אחרים, אך בדומה לאלקטרופורציה של חלבונים, לננובלאדים יש את היתרון של משלוח ארעי של Cas9/sgRNA RNP באופן נטול טרנסג'ן. Nanoblades מציעים פלטפורמה רב-תכליתית, פשוטה וזולה ביותר לאספקת חלבונים שניתן להתאים בקלות ובמהירות למשפחה ההולכת ומתרחבת של גרסאות CRISPR. Nanoblades ניתן לייצר בקו התא HEK293T או נגזרותיו. קווי תאים HEK293T המשמשים כאן פותחו כדי למקסם את ייצור החלקיקים הרטרו-ויראלי והרטי-ויראלי (ראו טבלת החומרים). עם זאת, למרות מקורות אחרים של תאי HEK293T עשויים להיות מתאימים, משתמשים חייבים לבדוק ולהשוות תאי HEK293T ממקורות שונים כמו הבדלים עיקריים בייצור חלקיקים נצפו בהתאם למקור התא HEK293T. תאים צריכים גם להיבדק לזיהום Mycoplasma לעתים קרובות ועבר כל שלושה ימים (קלאסי 1/8 דילול) כדי למנוע עומס יתר, אשר יש השפעה שלילית על ייצור חלקיקים.
תאים לא צריכים להיות מתוחזקים במשך מעל 20 קטעים. DMEM בתוספת גלוקוז, פניצילין/סטרפטומיצין, גלוטמין, ו-10% סרום בקר עוברי מפורק שימש לתרבות תאים. כמו מקור סרום עשוי להשפיע על איכות ההכנה Nanoblade, אצוות שונות של סרום צריך להיבדק לפני ייצור בקנה מידה גדול. Nanoblades יכול להיות מיוצר ביעילות במדיה אחרת כגון RPMI או שינויים ללא סרום של מדיום חיוני מינימלי שיכול להחליף DMEM ביום שלאחר טרנספקטיבה. כפי שצוין להלן, למרות החלפה בינונית לאחר transfection עם כמה ריאגנטים DNA-transfection הוא אופציונלי, זה עשוי להיות מועיל לשנות את המדיום שבו VLPs משוחררים, במיוחד כדי להגביל את עקבות סרום בהכנת החלקיקים. עם זאת, טיפוח תאים במדיום חיוני מינימלי בסרום מופחת ביום שלפני הטרנספוזיציה עדיין לא נוסה.
כאמור, Nanoblades מיוצרים על overexpression של תערובת של פלסמידים בתאי היצרן. נראה כי ביטוי היתר נדרש לייצור אופטימלי. ואכן, מעבדה זו פיתחה קו תאים מפיק שבו המבנה המבטא Gag-Pol התייצב על ידי בחירת אנטיביוטיקה; עם זאת, מערכת זו נכשלה לייצר כמויות משמעותיות של Nanoblades. תצפית דומה נעשתה כאשר מבנה קידוד sgRNA שולב ביציבות בגנום של תאי היצרן. כפי שתואר עבור מערכות ייצור חלקיקים אחרות, קו תאים יציב המבטא לפחות כמה מבנים המעורבים בייצור Nanoblades עשוי להיות שימושי; עם זאת, זה בהחלט ידרוש עיבוד של כמויות גדולות של supernatant וטכניקה מתאימה כדי לטהר חלקיקים. הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליך המועדף לייצור Nanoblades המנצל ריאגנטים טרנספקטים ספציפיים (ראה טבלת החומרים).
למרות ריאגנטים transfection מיצרני אחרים נבדקו גם בהצלחה, הרוב המכריע של תוצאות קבוצה זו עם Nanoblades בצע את ההליך המתואר בזאת. טרנספקטיה בעלות נמוכה ניתן להשיג באמצעות ריאגנטים סידן פוספט ולהניב יעילות ייצור טובה; עם זאת, שיטה זו בהחלט דורשת החלפת מדיום transfection ביום שלאחר transfection ועלול להשאיר שאריות סידן פוספט בהכנת חלקיקים משקעים. עולה בקנה אחד עם הצורך של רמות ביטוי גבוהות עבור רכיבי Nanoblade בתוך תאים מפיקים היא התצפית כי כמות sgRNAs הקשורים חלבון Cas9 יכול להיות גורם מגביל לעריכת גנום יעילה. כדי לשפר את טעינת sgRNA, שתי גישות טכניות פותחו לאחרונה על ידי קבוצות עצמאיות באמצעות וקטורים אספקת חלבון דומה Nanoblades. אלה מסתמכים על השימוש בביטוי ציטופלסמי תלוי פולימראז T7 של sgRNA6 או באמצעות תוספת של אות אנקפזיציה רטרו-ויראלי לרצף sgRNA כדי לתווך כריכה לפוליפרוטאין Gag6. גישות אלה אכן יכול לשפר את טעינת sgRNA בתוך Nanoblades למרות שהם לא נבדקו עדיין.
טרנסדוקציה של תאי יעד היא צעד קריטי בהליך. ברוב קווי התאים המונצחים, לתמרה עם Nanoblades יש השפעה ציטופתית מועטה, אם בכלל. עם זאת, בתאים ראשוניים, רעילות יכולה להיות בעיה. לפיכך, יש למטב את ההמרה עבור כל סוג תא. באופן ספציפי, זמן החשיפה Nanoblades הוא גורם חשוב לשנות בעת אופטימיזציה של פרוטוקול transduction. עבור תאים רגישים כגון נוירונים ראשוניים או תאי מח עצם, 4-6 שעות של דגירה עם Nanoblades לפני החלפת המדיום מאפשר משלוח יעיל של חלבון Cas9 תוך מזעור רעילות התא. יתר על כן, אדג'ובנטים כגון פולימרים קטיוניים, בין היתר, יכולים לשפר באופן משמעותי את היעילות של transduction בתאים מסוימים (ראה את טבלת החומרים). חשוב לציין כי Nanoblades הם VLPs והוא יכול לגרום לתגובה אימונוגנית. זה יכול להיות מגבלה אם עובדים עם סוגים מסוימים של תאים ראשוניים, כגון מקרופאגים או תאים דנדריטיים, שבהם דגירה עם Nanoblades יכול לגרום לשינויים חשובים בביטוי הגנים ואת פנוטיפ של התאים. אם מקרופאגים ותאים דנדריטיים נגזרים ממבשרי תאי גזע hematopoietic (כגון תאי מח עצם עכבר), עדיף להעביר תאים עם Nanoblades לפני שהם מובחנים לחלוטין כדי למנוע גרימת תגובה תאית נגד Nanoblades. אחרת, אלקטרופורציה של חלבון Cas9 יכולה לייצג חלופה מעשית בעת עבודה עם תאים חיסוניים מובחנים.
Nanoblades ניתן להשתמש vivo כדי להמרת זיגוטים עכבר או עוברים כדי ליצור בעלי חיים מהונדסים. בדומה לווקטורים רטרו-ויראליים קלאסיים או lentiviral, הם יכולים גם להיות מוזרקים ישירות לתוך רקמות מבעלי חיים בוגרים. עם זאת, Nanoblades (בדומה לווקטורים רטרו-ויראליים ו lentiviral) יכול להיות מושבת על ידי התגובה החיסונית של החיה המארחת; לפיכך, המינון שיש להזריק צריך להיות ממוטב עבור כל יישום. תגובה חיסונית זו יכולה גם להגביל את ההתפלגות של VLPs פונקציונליים לרקמות קרוב לאתר ההזרקה. לבסוף, שלא כמו וקטורים lentiviral, Nanoblades הם ללא transgene ולספק את Cas9 במסגרת זמן מוגבלת. לכן, הם לא יכולים לשמש לביצוע הקרנות פונקציונליות ברחבי הגנום הדורשות רצף תפוקה גבוהה של sgRNAs על בחירת תאים. Nanoblades שימושיים כאשר נדרשת עריכת גנום מהירה, תלוית מינון וטרנסג'ן20. יתר על כן, בדומה אלקטרופורציה חלבון, Nanoblades להוביל פחות השפעות מחוץ למטרה מאשר ביטוי ממושך של Cas9 / sgRNA באמצעות טרנספקטיה DNA או וקטורים ויראליים קלאסיים3. פיתוח עתידי של Nanoblades מתמקד בשילוב וריאנטים Cas9 עבור יישומים טכנולוגיים שונים כגון עריכת בסיס ומיקוד RNA.

בהשוואה לנוקלאזים ניתנים לתכנות אחרים, מערכת CRISPR-Cas פישטה באופן דרמטי ודמוקרטיזציה של ההליך של פילוח גנום ספציפי לרצף ומחשוף בתאים אאוקריוטים. באמצעות הביטוי הפשוט של sgRNA, משתמשים יכולים לתכנת את חלבון Cas9 (או גרסאות ממוטבות) עבור כמעט כל לוקוס תאי1. בתרחיש זה, משלוח של חלבון Cas9 ו sgRNA הופך את המגבלה העיקרית בעת ביצוע mutagenesis מכוון לאתר. בתאים מונצחים, ניתן לבטא בקלות את ה- sgRNA ואת חלבון Cas מפלסמידים שעברו טרנספוזידים כדי להשיג מיקוד גנום יעיל ברוב התאים. עם זאת, ביטוי מכונן של קומפלקס Cas9/sgRNA יכול להגביר את הפעילות מחוץ למטרה של חלבון Cas9 ולהציג שינויים לא רצויים ב- loci2 לא ספציפי. בתאים ראשוניים, טרנספקטיבה DNA יכול להיות קשה מבחינה טכנית להשיג ולהוביל ביטוי לקוי או אחוז קטן של תאים transfected. חלופות לטרנספקטיה קלאסית של דנ"א כוללות שימוש בווקטורים ויראליים המספקים קידוד טרנסג'ן עבור Cas9 ו- sgRNA או אלקטרופורציה של חלבון Cas9 רקומביננטי בשילוב עם sgRNA סינתטי. עם זאת, גישות אלה יכולות להוביל לשילוב טרנסג'ן בתוך הגנום המארח של התא (כמו במקרה של וקטורים קלאסיים של ביטוי רטרו-ויראלי ולנטי-ויראלי), הגבלה על ידי גורמים תאיים, ולהוביל לביטוי מכונן של חלבון Cas9 ו- sgRNA.
אלקטרופורציה של קומפלקס Cas9/sgRNA RNP יכולה להתגבר על רוב הבעיות הללו ולהוביל לאספקה יעילה וחולפת בתאים הראשיים וב- vivo, כמו גם לאפשר תגובה תלוית מינון. עם זאת, זה בדרך כלל מסתמך על ציוד יקר ריאגנטים והוא גם קשה לשדרג אם מספר רב של תאים צריך להיות מטופלים. כחלופה לטכניקות הנ"ל, מחברים אלה פיתחו את "Nanoblades" - וקטור אספקה רטרו-ויראלי עבור חלבון Cas9 ו- sgRNA3 הדומה מבחינה רעיונית למערכות אחרות להעברת חלבונים קפסידים שמקורן בנגיף4,5,6,7,8. Nanoblades לנצל את היכולת הטבעית של פוליפרוטאין Gag מן retroviruses לייצר, כאשר לידי ביטוי לבד בתאים בתרבית, VLPs המשוחררים במדיום חוץ תאי9. על ידי היתוך חלבון Cas9 לקצה מסוף C של נגיף לוקמיה מורין (MLV) פוליפרוטאין Gag וביטוי משותף של sgRNA וגליקופרוטינים של מעטפה ויראלית, חלבון Cas9 יכול להיות אנקפסולציה בתוך VLPs שוחררו או Nanoblades. עם הטיהור, Nanoblades ניתן לדגור עם תאי היעד או מוזרק ויוו כדי לתווך מסירה מהירה, חולפת, ותלויה במינון של Cas9 / sgRNA RNP קומפלקס3.
Nanoblades ניתן לתכנת עם sgRNAs מרובים לעריכה בו זמנית ב loci שונים או עם וריאנטים Cas9 לבצע יישומים אחרים כגון הפעלה תמלול ספציפית ליעד או דיכוי3. בניגוד לאלקטרופורציה של חלבונים, המסתמכת על ביטוי רקומביננטי, ניתן לשכפל בקלות גרסאות Cas המתוארות לאחרונה מהספרות לווקטור ביטוי היתוך Gag, מה שהופך אותו לפלטפורמה רב-תכליתית. Nanoblades יכול להיות מורכב עוד יותר או טעון עם אוליגודודאוקסינוקלאוטידים חד גדילים כפולים (ssODNs) כדי לבצע תיקון מונחה הומולוגיה3. ייצור Nanoblade הוא יחסית פשוט וזול. יתר על כן, Nanoblades ניתן לאחסן ב 4 °C (4 °F) במשך ימים רבים או ב -80 °C (80 °F) לאחסון לטווח ארוך. בדרך כלל, Nanoblades מתווכים יעיל, עריכת גנום ללא טרנסג'ן בתאים התרבותיים המונצחים והראשוניים ביותר. עם זאת, תאים ראשוניים מסוימים עשויים להיות רגישים לנוכחות של חלקיקים ויראליים, וכתוצאה מכך תמותה מוגברת. תאים של המערכת החיסונית המולדת יכולים גם להגיב לנוכחות של Nanoblades (בגלל מוצאם הנגיפי) ולהיות מופעלים. במקרים אלה, פרוטוקול transduction צריך להיות ממוטב כדי להגביל את זמן החשיפה Nanoblades ולמזער השפעות לא ספציפיות. Nanoblades מייצגים חלופה מעשית וקלה ליישום לשיטות משלוח CRISPR זמינות אחרות.

<table><tbody><tr><td>13.2 מ"ל, צינורות פוליפרופילן דק דופן, 14 x 89 מ"מ - 50Pk</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>331372</td><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה לטיהור ננו-להבים</td></tr><tr><td>ממברנות אמרשם פרוטראן פרימיום ווסטרן ספיגה, ניטרוצלולוז</td><td>Merck</td><td>GE10600004</td><td>ממברנת ניטרוצלולוזה לכימות רמות Cas9 בתוך ננו-להבים מטוהרים</td></tr><tr><td>BIC-Gag-CAS9</td><td>Addgene</td><td>119942</td><td>מקודד היתוך GAG (F-MLV)-CAS9(sp). מאפשר ייצור של חלקיקים דמויי וירוס GAG-CAS9 מתאי יצרן בשילוב עם gRNA(ים) מבוטא יתר על המידה ומעטפות מתאימות</td></tr><tr><td>BICstim-Gag-dCAS9-VPR</td><td>Addgene</td><td>120922</td><td>מקודד היתוך GAG-dCAS9-VPR להפעלת שעתוק ממוקדת</td></tr><tr><td>BLADE</td><td>Addgene</td><td>134912</td><td>עמוד שדרה ריק לשיבוט רצף sgRNA לשימוש במערכת Nanoblades</td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>New England Biolabs</td><td>R0739S</td><td>אנזים הגבלה לעיכול וקטורים של BLADE ו-SUPERBLADES לשיבוט sgRNA</td></tr><tr><td>Cas9 (7A9-3A3) עכבר mAb (מצומד HRP) #97982</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>97982S</td><td>נוגדן Anti-Cas9 לכימות Cas9 על ידי כתמי נקודות</td></tr><tr><td>Cas9 Nuclease, S. pyogenes</td><td>New England Biolabs</td><td>M0386T</td><td>חלבון Cas9 רקומביננטי שישמש כהתייחסות לכימות מוחלט של כמות Cas9 הטעונה בתוך Nanoblades</td></tr><tr><td>תמיסת אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל ב-H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>לצביעה של ג'ל אגרוז והדמיית DNA</td></tr><tr><td>Fisherbrand Wave Motion Shakers</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-028</td><td>טבלת תסיסה להשעיית ננו-להבים על ג'ל צנטריפוגהמנתח</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>http://www.gelanalyzer.com; כימות עוצמת הלהקה לאחר העיכול</td></tr><tr><td>Gesicle Producer 293T</td><td>Takara</td><td>632617</td><td>קו תאים לייצור ננובליידים</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41966052</td><td>מדיום תרבית תאים ליצרן Gesicle תאי 293T</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA פולימראז</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>Taq פולימראז להגברה של DNA גנומי לפני בדיקות אנדונוקלאז T7</td></tr><tr><td>ערכת ריאגנט טרנספקציה של JetPRIME עבור DNA ו- DNA/ siRNA</td><td>Polyplus</td><td>POL114-15</td><td>מגיב טרנספקציה לייצור ננובלייד בתאי יצרן ג'סיקל 293T</td></tr><tr><td>Millex-AA, 0.80 ומיקרו; m, מסנן מזרק</td><td>Millipore</td><td>SLAA033SS</td><td>מסנן מזרק להסרת פסולת סלולרית לפני ריכוז Nanoblades</td></tr><tr><td>Millex-GS, 0.22 &micro; m, מסנן מזרק</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td>מסנן מזרק לעיקור תמיסת כרית הסוכרוז</td></tr><tr><td>Millex-HP, 0.45 &micro; m, polyethersulfone, מסנן מזרק</td><td>Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td>מסנן מזרק להסרת פסולת סלולרית לפני ריכוז Nanoblades</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל DNA של Monarch ערכת מיצוי ג'ל</td><td>DNA של ניו אינגלנד Biolabs</td><td>T1020L</td><td>לטיהור שבר הפלסמיד pBLADES או pSUPERBLADES בעת העיכול עם BsmBI</td></tr><tr><td>NEB יציב מוכשר E. coli (יעילות גבוהה)</td> <td>New England Biolabs</td><td>C3040I</td><td>חיידקים מוכשרים לטרנספורמציה והגברה של פלסמיד</td></tr><tr><td>ערכת NucleoBond Xtra Midi ל-DNA פלסמיד בדרגת טרנספקציה</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.50</td><td>ערכת הכנה מקסימלית לטיהור DNA פלסמיד מחיידקים מתורבתים</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי gDNA נוקלאוספין</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td>מיצוי DNA גנומי מתאים מותמרים</td></tr><tr><td>NucleoSpin פלסמיד, ערכת מיני ל-DNA</td> <td>פלסמידMacherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>ערכת מיני-הכנה לטיהור DNA פלסמיד מחיידקים מתורבתים</td></tr><tr><td>רקמת NucleoSpin, ערכה מיני ל-DNA מתאים ורקמות</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>ערכת מיצוי DNA גנומי</td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>A94471</td><td>אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>pBaEVRless</td><td>Els Verhoeyen (Inserm U1111)</td><td>יש לשלוח בקשות אישיות אל: els.verhoyen@ens-lyon.fr</td><td>Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein המתואר ב- Girard-Gagnepain, A. et al. LVs פסאודוטיפיים של מעטפת בבון עולים על VSV-G-LVs להעברת גנים ל- HSCs מגורים מוקדמים ומנוחה. דם 124, 1221&ndash; 1231 (2014)</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>מגדיר את נגיף הלוקמיה העכברי gag וגנים pol</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>חלבון מעטפת לייצור חלקיקים רטרו-ויראלים ו-MuLV</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>14200091</td><td>10X PBS לדילול במיליפור מים</td></tr><tr><td>מגיב</td> <td>טרנספקציה פוליברןMillipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>פולימר קטיוני המשפר את היעילות של התמרה רטרו-ויראלית בתאי יונקים ספציפיים. זה יכול גם לאפשר כניסה תלויה ויראלית של Oligodeoxynucleotide (ODN) לתיקון מכוון הומולוגיה</td></tr><tr><td>סוכרוז, לביולוגיה מולקולרית, &ge; 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-5KG</td><td>סוכרוז להכנת כרית לטיהור ננו-להבים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>SUPERBLADE5</td><td>Addgene</td><td>134913</td><td>עמוד שדרה ריק לשיבוט רצף sgRNA לשימוש במערכת ננו-להבים (מותאם ליעילות מוגברת של עריכת גנום באמצעות Chen B et al., 2013)</td></tr> <tr><td>SuperSignal West Dura מצע משך מורחב</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34076</td><td>מצע HRP כימומינסנציה משופר (ECL) לכתמי Cas9 נקודות</td></tr><tr><td>SW 41 Ti רוטור דלי מתנדנד</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>331362</td><td>רוטור לאולטרה-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>חלופה לאתידיום ברומיד לצביעה של ג'ל אגרוז והדמיה של DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202S</td><td>DNA ligase כדי לקשר את וקטורי ה-BLADE או SUPERBLADES עם אוליגוס ה-DNA הדופלקס המתאים לאזור המשתנה של sgRNA</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302S</td><td>T7 Endonuclease I מזהה ומבקע DNA שאינו תואם לחלוטין. מאפשר לנטר את היקף עריכת הגנום בלוקוס</td></tr> ספציפי <tr><td>המכיל טריטון מאגר ליזה</td><td>Promega</td><td>E291A</td><td>Lysis כדי לשבש את Nanoblades ולאפשר כימות Cas9</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>להכנת TBST</td></tr></tbody></table>

משלוח של cas9/ sgrna ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("nanoblades")

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

מערכת החזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)-Cas המקובצת באופן קבוע בין-מרחבית הפכה את עריכת הגנום לדמוקרטית בתאים אאוקריוטים והובילה לפיתוח יישומים חדשניים רבים. עם זאת, אספקת חלבון Cas9 ו- RNA חד-מדריך יחיד (sgRNA) לתאי היעד יכולה להיות אתגר מבחינה טכנית. וקטורים ויראליים קלאסיים, כגון אלה הנגזרים מ- lentiviruses (LVs) או וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs), מאפשרים אספקה יעילה של קידוד טרנסג'נים עבור חלבון Cas9 וה- sgRNA הקשור אליו בתאים ראשוניים רבים וב- vivo. עם זאת, וקטורים אלה יכולים לסבול מחסרונות כגון שילוב של הטרנסג'ן בגנום תא היעד, קיבולת מטען מוגבלת, וביטוי ארוך טווח של חלבון Cas9 ומדריך RNA בתאי היעד.
כדי להתגבר על חלק מהבעיות הללו, פותח וקטור אספקה המבוסס על נגיף לוקמיה מורין (MLV) כדי לארוז את חלבון Cas9 ואת RNA המדריך הקשורים אליו בהיעדר כל טרנסג'ן קידוד. על ידי היתוך חלבון Cas9 לטרמינל C של החלבון המבני Gag מ- MLV, נוצרו חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) עמוסים בחלבון Cas9 וב- sgRNA (הנקראים "Nanoblades") . Nanoblades ניתן לאסוף ממדיום התרבות של תאים מפיקים, מטוהר, מכמת, ומשמש כדי transduce תאי היעד ולספק את קומפלקס Cas9 / sgRNA הפעיל. ננו-בלידים מספקים את מטען הריבונוקלאופרוטאין (RNP) שלהם באופן ארעי ומהיר במגוון רחב של תאים ראשוניים ומונצחים וניתן לתכנת אותם עבור יישומים אחרים, כגון הפעלה שעתוק חולפת של גנים ממוקדים, באמצעות חלבוני Cas9 מותאמים. Nanoblades מסוגלים בעריכת גנום vivo בכבד של עכברים בוגרים מוזרקים בביציות כדי ליצור בעלי חיים מהונדסים. לבסוף, הם יכולים להיות מורכבים עם DNA תורם עבור "ללא טרנספקטיה" תיקון הומולוגי מונחה. הכנת Nanoblade היא פשוטה, בעלות נמוכה יחסית, והוא יכול להתבצע בקלות בכל מעבדה לביולוגיה של התא.

הפרוטוקול להכנת Nanoblade הוא פשוט למדי ודורש ציוד מעבדה פשוט מלבד גישה למכסה המנוע תרבית רקמות, חממת CO2 , וצנטריפוגת דלי מתנדנדת או אולטרה-צנטריפוגה. עם זאת, צעדים מסוימים דורשים תשומת לב מיוחדת כגון המקור והטיפול בתאי היצרן, כמו גם תנאי transduction. כפי שניתן לראות באיור 1A, חשוב לזרוע תאים כך שהם יחולקו בצורה הומוגנית בצלחת ויגיעו למפגש של כ-70%-80% ביום ההעברה (הימנעו מגושים של תאים). עשרים וארבע שעות לאחר ההעברה (איור 1B, C), תאי היצרן ייצרו סינסיטיה המובילה לתאים בגודל גדול יותר עם גרעינים מרובים. ארבעים שעות לאחר ההעברה (איור 1D), רוב התאים בצלחת ייצרו סינסיטיה ויתחילו להתנתק מהצלחת.
זה נורמלי לחלוטין והוא נגרם על ידי הביטוי של גליקופרוטאין המעטפה, אשר גורם היתוך בין תאים שכנים. עם ריכוז על ידי צנטריפוגה (או אפילו ישר מן supernatant של תאים מפיקים), כמות Cas9 טעון בתוך Nanoblades ניתן לכמת באופן מוחלט על ידי כתם נקודות על קרום ניטרוצלולוז באמצעות Cas9 רקומביננטי כהפניה (איור 2). שלב זה חשוב כדי לקבוע את הכמות הנכונה של Nanoblades לשימוש עבור transduction של תאי היעד. בעת ביצוע בדיקת כתמי הנקודות, חשוב לקחת בחשבון רק את הקריאות הנכללות בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית. עם זאת, ללא תלות בכמות ה-Cas9 הקיימת בננובלאדס, חיוני לבדוק את היעילות של עריכת הגנום ישירות בתאי היעד באמצעות בדיקת אנדונוקלאז T7 (איור 3) או ריצוף סנגר.
כפי שמוצג באיור 3, היעילות של Nanoblades יכולה להיות שונה מאצווה לאצווה למרות שהיא בדרך כלל מתואמת לכמות Cas9. בדוגמה המוצגת באיור 3, האצווה מנתיב 1 מובילה ליעילות עריכה כוללת של 20%, בעוד האצווה מנתיב 3 מובילה ליעילות של 60%. במקרה זה, ניתן להגדיל את הנפח של Nanoblades המשמש מאצווה 1 כדי להשיג יעילות עריכה דומה לזו מאצווה 3. איור 4 מציג את יעילות העריכה המרבית המתקבלת באמצעות Nanoblades בסוגים שונים של תאים ראשיים. חשוב לציין כי היעילות עשויה להשתנות בהתאם לרצף של sgRNA בשימוש ונגישות היעד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig01.jpg"> איור 1: מורפולוגיה של תאים מפיקים במהלך ייצור Nanoblade. (A) תאי HEK293T במפגש של 70-80% 24 שעות לאחר הציפוי. (B ו - C) מורפולוגיה של תאים HEK293T 24 שעות לאחר טרנספקטה. (D) HEK293T מורפולוגיה של תאים 40 שעות לאחר ההעברה. סרגלי קנה מידה = 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig02.jpg"> איור 2: כימות טעינת Cas9 בתוך Nanoblades לפי כתם נקודות. (A) רקומביננטי Cas9 או 100x מרוכז (על ידי אולטרה-מרכזיות) דגימות Nanoblade (#1, #2 ו- #3) מדוללות פי 2 ברצף ומזוהות על קרום ניטרוצלולוז לפני הדגירה עם נוגדנים משולבים נגד Cas9 HRP. האות מתגלה על ידי chemiluminescence משופרת. (B) אות Chemiluminescence נרכש ומכמת עבור דילול Cas9 רקומביננטי ועוצמת האות שנועד כנגד הכמות הידועה של Cas9 שזוהתה על קרום הניטרוצלולוז. עקומת רגרסיה מחושבת עבור הדילולים הנמצאים בטווח הליניארי (ראו צלבים כחולים), למעט כל הריכוזים הנמצאים מחוץ לטווח הליניארי (ראו צלבים אדומים). (C) ריכוז Cas9 (nM) בכל הכנה Nanoblade היה אקסטרפולציה באמצעות המשוואה מן הרגרסיה הליניארית המתקבלת ב(B). לשם כך, חשוב להשתמש רק באות המכומת מדילול Nanoblade הנופלים בטווח הליניארי של עקומת הרגרסיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig03.jpg"> איור 3: ניטור יעילות העריכה בעת ההעתקה. (A) בדיקת אנדונוקלאז T7 המודדת את יעילות המחשוף בתאים שטופלו בננו-בלייד. תאים שהועברו עם Nanoblades מיקוד הגן EMX1 נותחו על ידי בדיקת אנדונוקלאז T7. נתיב 1: אצוות הכנה Nanoblade #1 (20% יעילות מחשוף); נתיב 2: תאי בקרה; נתיב 3: אצוות הכנה Nanoblade #2 (60% יעילות מחשוף). (ב) הקשה על רצף תגיות הדגל במסגרת הקריאה הפתוחה של DDX3 . Nanoblades מרוכז מתוכנת עם sgRNA מיקוד לוקוס DDX3 הופקו שיבוטים HEK293T שונים (#1, #2) ומורכבים עם מינונים הולכים וגדלים של תבנית Flag-DDX3 ssODN ואת המתחמים המתקבלים המשמשים לתעבורה של תאי היעד HEK293T. עם ההמרה, תאים גדלו במשך שלושה ימים לפני איסוף אותם כדי לחלץ DNA גנומי וחלבונים הכוללים. חלבוני דגל-DDX3 היו immunoprecipitated באמצעות חרוזי אגרוזים נגד דגל ואחריו ניתוח כתם מערבי של חלבונים התאוששו באמצעות נוגדן נגד דגל (פאנל עליון). החדרה מכוונת אתר של תג הדגל בלוקוס Ddx3 נבדקה גם על ידי PCR באמצעות או פריימרים המאגפים את אתר הכניסה (פאנל אמצעי), או באמצעות פריימר קדמי המזהה את רצף תג הדגל ופריימר הפוך ספציפי ל- Ddx3 locus במורד הזרם של אתר הכנסת הדגל (החלונית התחתונה). קיצורים: EMX1 = ריק ספירקלס הומיאובוקס 1; DDX3 = RNA helicase 3; PCR = תגובת שרשרת פולימראז; ODN = אוליגודודאוקסינוקלאוטיד; ssODN = ODN סינג-גדיל; sgRNA = RNA מדריך יחיד; IP = immunoprecipitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig04.jpg"> איור 4: יעילות העריכה שהושגה בסוגי תאים ראשיים שונים באמצעות Nanoblades. קיצורים: PBL = לימפוציט דם היקפי; IL = אינטרלוקין; CD = אשכול של בידול; iPSC = תאי גזע פלוריפוטנטים מושרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פיתחנו פרוטוקול פשוט וזול לטעון Cas9 / מדריך יחיד RNA RNA (sgRNA) rbonucleoprotein מתחמים בתוך חלקיקים דמויי וירוס. חלקיקים אלה, הנקראים "Nanoblades", מאפשרים העברה יעילה של קומפלקס Cas9/sgRNA בתאים מונצחים וראשוניים, כמו גם ב- vivo.

משלוח של Cas9/ sgRNA ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("Nanoblades")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

Nanoblades אפשר משלוח מהיר, יעיל ותלוי במינון של Cas9 ומדריך RNA קומפלקס, הן בתאים מונצחים והן בתאים ראשוניים, ובהיעדר אנטי טרנסג'ן. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי nanoblades הם קלים וזולים יחסית להכין. הם יכולים לספק את ה-Cas9 ולהנחות את קומפלקס ה-RNA באופן תלוי מינון וחולף, ובכך להגביל אפקטים מחוץ למטרה, תוך מתן אפשרות לעריכת גנום יעילה.פרוטוקול ההכנה עבור nanoblades הוא פשוט מאוד. עם זאת, איכות התאים המפיקים, כמו גם מקורם וזריעתם לפני הטרנספקטציה, חיוניים על מנת להשיג תשואות גבוהות של חלקיקים דמויי וירוס. מדגים את ההליך יהיה לורה Guiguettaz, מהנדס מהמעבדה שלי.ביום הראשון, זרע 3.5 עד 4 מיליון HEK 293T תאים ב 10 מיליליטר של DMEM שונה סטרפטומיצין פניצילין בצלחת תרבית תאים 10 ס"מ. לאחר 24 שעות, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%, החלף את המדיום ב- DMEM טרי והשתמש בפיפטה P-1000 כדי להוסיף פתרון ריאגנט טרנספקטיה באופן טיפה חכם. התחל לקצור nanoblades ביום הרביעי על ידי איסוף סופרנאטנט בינוני תרבות עם פיפטה 10 מיליליטר.זה נורמלי כי צבע המדיום התרבותי הופך לצהוב בשלב זה. צנטריפוגה supernatant שנאסף ב 500 G במשך חמש דקות כדי להסיר פסולת הסלולר, ולשחזר תשעה מיליליטר של supernatant מבלי להפריע גלולה התא. גלולה nanoblades ב ultracentrifuge ב 209, 490 G במשך 75 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, לאט לשאוף את המדיום מחדש את הכדור הלבן עם 100 מיקרוליטרים של PBS קר. לכסות את הצינור עם parafilm ודגור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. לאחר מכן, resuspend את הכדור שוב על ידי צנרת למעלה ולמטה.הכן פתרון סוכרוז של 10% ב- PBS וסנן אותו באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. מניחים 2.5 מיליליטר של 10% סוכרוז לתוך צינור אולטרה-מרכזי. הטה את הצינור והוסף לאט את תשעת המיליליטרים של מדגם המכיל VLP עם פיפטה במהירות נמוכה תוך העלאת הצינור בהדרגה למצב אנכי.מניחים צינורות בדליים רוטור, ולאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 209, 490 G במשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הסיר את supernatant בזהירות והניח את הצינור הפוך על נייר טישו כדי להסיר את כל הנוזל שנותר. למטרות דידקטיות והדמיה טובה יותר של הכדור הנגיפי, nanoblades טעון עם חלבון פלואורסצנטי mCherry ניתן להכין.לאחר דקה אחת, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS. מניחים את הצינור עם כיסוי parafilm במחזיק צינור על שולחן עצבנות במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ו resuspend את הכדור על ידי צנרת למעלה ולמטה. הכן את מאגר הדילול על-ידי הוספת אמצעי אחסון אחד של מאגר תמוגה המכיל חומר פעילי שטח לא יוני בארבעה כרכים של PBS.לדלל שני מיקרוליטרים של nanoblades מרוכז ב 50 מיקרוליטרים של מאגר דילול ומערבולת לזמן קצר. העבר 25 מיקרוליטרים של התערובת לתוך צינור חדש המכיל 25 מיקרוליטרים של מאגר דילול ולחזור על ההליך יש שישה צינורות של דילול nanoblade. הפוך את השליטה הסטנדרטית על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של נוקלאז Cas9 רקומביננטי ל-50 מיקרוליטרים של מאגר דילול, מערבולת אותו בקצרה וביצוע שמונה דילולים סדרתיים.ספוט 2.5 מיקרוליטרים של כל דילול VLP, ו 2.5 מיקרוליטרים של כל תקן על קרום ניטרוצלולוז בזהירות עם פיפטה רב ערוצית. לאחר החלקיקים נספגים, לחסום את הממברנה עם TBST בתוספת 5% חלב יבש ללא שומן במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את TBST ולדגור את הממברנה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן פרוקסידאז חזרת Cas9.לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST ולדמיין את האות באמצעות ערכת מצע chemiluminescent משופרת. עבור transduction של תאי היעד עם nanoblades, להחליף את מדיום תרבית התא עם 500 מיקרוליטרים של המדיום המכיל nanoblades מטוהרים. לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה בתאים, החלף את המדיום לכמות הרגילה של מדיום טרי.בפרוטוקול, תאים נזרעו להפצה הומוגנית עם 70 עד 80% מפגש ביום הטרנספקטיון, מה שיצר סינסיטיה המובילה לתאים גדולים יותר עם גרעינים מרובים לאחר 24 שעות. 40 שעות לאחר ההעברה, רוב התאים יצרו סינסיטיה והחלו להתנתק מהצלחת. כמות Cas9 נטען בתוך nanoblades היה כימות באמצעות כתם נקודה על קרום ניטרוצלולוז, אשר הציג chemiluminescence משופרת בהשוואה Cas9 רקומביננט הייחוס.עקומת כיול שורטטה עבור אות chemiluminescence מכמת עבור דילול Cas9 רקומביננטי כנגד הכמות הידועה של Cas9. לאחר מכן, ריכוז חלבון Cas9 בכל הכנה nanoblade היה ממופה, חושף ריכוזים שונים של Cas9 מאצווה לאצווה. בדיקת אנדונוקלאז T7 הוכיחה כי היעילות של nanoblades יכול להיות שונה מאצווה לאצווה.לדוגמה, אצווה אחת נצפתה כבעלת יעילות עריכה כוללת של 20%, בעוד האצווה האחרת הציגה יעילות של 60%. חלבוני דגל-DDX3 היו אימונו-מזורזים באמצעות חרוזי אגרוזים נגד דגל, ואחריו ניתוח כתם מערבי של חלבונים התאוששו באמצעות נוגדן נגד דגל. החדרה מכוונת אתר של תג הדגל בלוקוס DDX3 נבדקה גם על ידי PCR באמצעות או פריימרים לאגף את אתר הכניסה, או פריימרים קדימה והפוך ספציפיים לוקוס DDX3 במורד הזרם של אתר החדרת הדגל.חשוב למקם את התאים במפגש נכון, ולקבל התפלגות אחידה של התאים. עם צנטריפוגה ננו-בלייד, חשוב גם לחדש את הכדור ולקבל מדגם הומוגני של חלקיקים ויראליים מרוכזים. Nanoblades אפשרו למדענים לחקור את המנגנון של תיקון שבירת DNA כפול גדילים על ידי אספקת Cas9 ולהנחות את קומפלקס RNA לוקי גנומי ספציפי באופן מהיר ומתואם.הם גם אפשרו להשבית RNAs ארוך שאינו מקודד בתאים העיקריים של המערכת החיסונית המולדת על מנת ללמוד את תפקידם.

delivery-cas9sgrna-ribonucleoprotein-complex-immortalized-primary

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

סרטון זה מדגים טכניקה להעברה מבוססת ננו-להבים של קומפלקס Cas9-sgRNA ribonucleoprotein בתוך תאי מטרה לצורך עריכת גנום. ננו-להבים הם חלקיקים דמויי וירוס חסרי יכולת להתרבות ולהדביק תאים שכנים, ולכן הם שימושיים מאוד להובלה מהירה ותלויה במינון של ביו-חומרים וננו-חומרים.

משלוח מבוסס ננו-להבים של מטען חומצות גרעין: טכניקה להעברת קומפלקס Cas9-sgRNA לתאי מטרה באמצעות חלקיקים דמויי וירוסים

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

אנו מתארים את האסטרטגיה הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) בתור כלי רכב להעברת CRISPR/Cas9 לתאים. עם היכולת לתווך ג'ין מהיר וחזק עריכה בתאים, IDLVs להציג דרך בטוחה יותר, פלטפורמה וקטור יעיל באותה מידה המסירה הגן לעומת integrase-המוסמכת וקטורים.

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

טכניקות ביטוי מסורתיים מבוססי cDNA יש של תחולה מוגבלת עבור ביטוי של RNAs noncoding זמן עקב שלהם טפסים splice מרובים עם פונקציונליות פוטנציאליים. ביקורת זו דוחות באמצעות טכנולוגיית CRISPR את overexpress וריאציות splice מרובים של RNA זמן noncoding פרוטוקול.

Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

למד כיצד להכין ולהשתמש ב-Nanoblades למשלוח זמני ויעיל של מערכי Cas9/sgRNA לעריכת גנום בתאים מונצחים וראשוניים. שיטה זו מציעה חלופה נגישה לוקטורים ויראליים קלאסיים.

משלוח של Cas9/ sgRNA ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("Nanoblades")

גלה סרטונים נוספים