משלוח של Cas9/ sgRNA ריבונוקלאופרוטאין קומפלקס בתאים מונצחים וראשוניים באמצעות חלקיקים דמויי וירוס ("Nanoblades")

Nanoblades אפשר משלוח מהיר, יעיל ותלוי במינון של Cas9 ומדריך RNA קומפלקס, הן בתאים מונצחים והן בתאים ראשוניים, ובהיעדר אנטי טרנסג'ן. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי nanoblades הם קלים וזולים יחסית להכין. הם יכולים לספק את ה-Cas9 ולהנחות את קומפלקס ה-RNA באופן תלוי מינון וחולף, ובכך להגביל אפקטים מחוץ למטרה, תוך מתן אפשרות לעריכת גנום יעילה.

פרוטוקול ההכנה עבור nanoblades הוא פשוט מאוד. עם זאת, איכות התאים המפיקים, כמו גם מקורם וזריעתם לפני הטרנספקטציה, חיוניים על מנת להשיג תשואות גבוהות של חלקיקים דמויי וירוס. מדגים את ההליך יהיה לורה Guiguettaz, מהנדס מהמעבדה שלי.

ביום הראשון, זרע 3.5 עד 4 מיליון HEK 293T תאים ב 10 מיליליטר של DMEM שונה סטרפטומיצין פניצילין בצלחת תרבית תאים 10 ס"מ. לאחר 24 שעות, כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%, החלף את המדיום ב- DMEM טרי והשתמש בפיפטה P-1000 כדי להוסיף פתרון ריאגנט טרנספקטיה באופן טיפה חכם. התחל לקצור nanoblades ביום הרביעי על ידי איסוף סופרנאטנט בינוני תרבות עם פיפטה 10 מיליליטר.

זה נורמלי כי צבע המדיום התרבותי הופך לצהוב בשלב זה. צנטריפוגה supernatant שנאסף ב 500 G במשך חמש דקות כדי להסיר פסולת הסלולר, ולשחזר תשעה מיליליטר של supernatant מבלי להפריע גלולה התא. גלולה nanoblades ב ultracentrifuge ב 209, 490 G במשך 75 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, לאט לשאוף את המדיום מחדש את הכדור הלבן עם 100 מיקרוליטרים של PBS קר. לכסות את הצינור עם parafilm ודגור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. לאחר מכן, resuspend את הכדור שוב על ידי צנרת למעלה ולמטה.

הכן פתרון סוכרוז של 10% ב- PBS וסנן אותו באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. מניחים 2.5 מיליליטר של 10% סוכרוז לתוך צינור אולטרה-מרכזי. הטה את הצינור והוסף לאט את תשעת המיליליטרים של מדגם המכיל VLP עם פיפטה במהירות נמוכה תוך העלאת הצינור בהדרגה למצב אנכי.

מניחים צינורות בדליים רוטור, ולאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 209, 490 G במשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הסיר את supernatant בזהירות והניח את הצינור הפוך על נייר טישו כדי להסיר את כל הנוזל שנותר. למטרות דידקטיות והדמיה טובה יותר של הכדור הנגיפי, nanoblades טעון עם חלבון פלואורסצנטי mCherry ניתן להכין.

לאחר דקה אחת, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS. מניחים את הצינור עם כיסוי parafilm במחזיק צינור על שולחן עצבנות במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ו resuspend את הכדור על ידי צנרת למעלה ולמטה. הכן את מאגר הדילול על-ידי הוספת אמצעי אחסון אחד של מאגר תמוגה המכיל חומר פעילי שטח לא יוני בארבעה כרכים של PBS.

לדלל שני מיקרוליטרים של nanoblades מרוכז ב 50 מיקרוליטרים של מאגר דילול ומערבולת לזמן קצר. העבר 25 מיקרוליטרים של התערובת לתוך צינור חדש המכיל 25 מיקרוליטרים של מאגר דילול ולחזור על ההליך יש שישה צינורות של דילול nanoblade. הפוך את השליטה הסטנדרטית על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של נוקלאז Cas9 רקומביננטי ל-50 מיקרוליטרים של מאגר דילול, מערבולת אותו בקצרה וביצוע שמונה דילולים סדרתיים.

ספוט 2.5 מיקרוליטרים של כל דילול VLP, ו 2.5 מיקרוליטרים של כל תקן על קרום ניטרוצלולוז בזהירות עם פיפטה רב ערוצית. לאחר החלקיקים נספגים, לחסום את הממברנה עם TBST בתוספת 5% חלב יבש ללא שומן במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את TBST ולדגור את הממברנה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן פרוקסידאז חזרת Cas9.

לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST ולדמיין את האות באמצעות ערכת מצע chemiluminescent משופרת. עבור transduction של תאי היעד עם nanoblades, להחליף את מדיום תרבית התא עם 500 מיקרוליטרים של המדיום המכיל nanoblades מטוהרים. לאחר ארבע עד שש שעות של דגירה בתאים, החלף את המדיום לכמות הרגילה של מדיום טרי.

בפרוטוקול, תאים נזרעו להפצה הומוגנית עם 70 עד 80% מפגש ביום הטרנספקטיון, מה שיצר סינסיטיה המובילה לתאים גדולים יותר עם גרעינים מרובים לאחר 24 שעות. 40 שעות לאחר ההעברה, רוב התאים יצרו סינסיטיה והחלו להתנתק מהצלחת. כמות Cas9 נטען בתוך nanoblades היה כימות באמצעות כתם נקודה על קרום ניטרוצלולוז, אשר הציג chemiluminescence משופרת בהשוואה Cas9 רקומביננט הייחוס.

עקומת כיול שורטטה עבור אות chemiluminescence מכמת עבור דילול Cas9 רקומביננטי כנגד הכמות הידועה של Cas9. לאחר מכן, ריכוז חלבון Cas9 בכל הכנה nanoblade היה ממופה, חושף ריכוזים שונים של Cas9 מאצווה לאצווה. בדיקת אנדונוקלאז T7 הוכיחה כי היעילות של nanoblades יכול להיות שונה מאצווה לאצווה.

לדוגמה, אצווה אחת נצפתה כבעלת יעילות עריכה כוללת של 20%, בעוד האצווה האחרת הציגה יעילות של 60%. חלבוני דגל-DDX3 היו אימונו-מזורזים באמצעות חרוזי אגרוזים נגד דגל, ואחריו ניתוח כתם מערבי של חלבונים התאוששו באמצעות נוגדן נגד דגל. החדרה מכוונת אתר של תג הדגל בלוקוס DDX3 נבדקה גם על ידי PCR באמצעות או פריימרים לאגף את אתר הכניסה, או פריימרים קדימה והפוך ספציפיים לוקוס DDX3 במורד הזרם של אתר החדרת הדגל.

חשוב למקם את התאים במפגש נכון, ולקבל התפלגות אחידה של התאים. עם צנטריפוגה ננו-בלייד, חשוב גם לחדש את הכדור ולקבל מדגם הומוגני של חלקיקים ויראליים מרוכזים. Nanoblades אפשרו למדענים לחקור את המנגנון של תיקון שבירת DNA כפול גדילים על ידי אספקת Cas9 ולהנחות את קומפלקס RNA לוקי גנומי ספציפי באופן מהיר ומתואם.

הם גם אפשרו להשבית RNAs ארוך שאינו מקודד בתאים העיקריים של המערכת החיסונית המולדת על מנת ללמוד את תפקידם.