Name: מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: גלה שיטת סקרינינג תרופות באורגנואידים של רשתית אנושית לזיהוי תרופות מגנות מפני רעילות פוטורצפטורים. הפלטפורמה מאפשרת מחקר מחלות רשתית וגילוי תרופות חדשות ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי מכון המחקר הרפואי לואי. ברצוננו להודות למשפחת לואי על תמיכתה בפרויקט מקטל. ברצוננו להודות למרי גאנטנר, מייק דורל ולאה שפקה על תרומתם האינטלקטואלית ועזרתם בהכנת כתב היד.

<ol><li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li>
<li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down%2C+mice+are+not+just+small+humans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).</li>
<li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li>
<li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+pathways+in+neurodegeneration%2C+from+genetics+to+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li>
<li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2%3A+the+Melbourne+collaborative+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li>
<li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li>
<li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Muller%27s+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li>
<li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li>
<li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li>
<li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li>
<li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients%3A+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li>
<li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

וריאציות של פרוטוקול בידול מאז המצאת הכוסות האופטיות היוצרות את עצמן על ידי קבוצת20 של יושיקי סאסאי, מעבדות רבות פיתחו פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים ברשתית שיכולים להשתנות כמעט בכל שלב 5,18,19,21. רשימה ממצה של פרוטוקולים ניתן למצוא ב Capowski et al.22. פרוטוקול ההתמיינות שאנו מספקים כאן הוא פרוטוקול פשוט, בהתערבות נמוכה המספק ...

מידול מחלות אנושיות בתרביות תאים ובמודלים של בעלי חיים סיפק כלים שלא יסולא בפז לגילוי, שינוי ותיקוף של טיפולים פרמקולוגיים, ואפשר להם להתקדם מתרופה מועמדת לטיפול מאושר. למרות ששילוב של מודלים במבחנה ומודלים לא אנושיים in vivo הוא כבר זמן רב מרכיב קריטי בצנרת פיתוח התרופות, הם לעתים קרובות נכשלים בחיזוי הביצועים הקליניים של תרופות מועמדות חדשות1. יש צורך ברור בפיתוח טכנולוגיות שיגשרו על הפער בין מונוקולטורה תאית אנושית פשטנית לבין ניסויים קליניים. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בתרביות רקמה תלת-ממדיות המאורגנות באופן עצמי, אורגנואידים, שיפרה את נאמנותן לרקמות שהן מדגימות והפכה אותן לכלים מבטיחים בצנרת פיתוח התרופות הפרה-קליניות2.
יתרון מרכזי של תרבית תאים אנושית על פני מודלים שאינם אנושיים in vivo הוא היכולת לשכפל את המורכבויות הספציפיות של חילוף החומרים האנושי, אשר יכול להשתנות במידה ניכרת אפילו בין חולייתנים מסדר גבוה יותר, כגון בני אדם ועכברים3. עם זאת, ספציפיות זו יכולה להיות מאפילה על ידי אובדן מורכבות רקמות; כזה הוא המקרה של רקמת רשתית שבה סוגי תאים מרובים שזורים זה בזה באופן מורכב ויש להם יחסי גומלין מטבוליים סימביוטיים ייחודיים בין תת-סוגים תאיים שלא ניתן לשכפל במונוקולטורה4. לאורגנואידים אנושיים, המספקים פקסימיליה של רקמות אנושיות מורכבות עם נגישות ומדרגיות של תרביות תאים, יש פוטנציאל להתגבר על הליקויים של פלטפורמות מידול מחלות אלה.
אורגנואידים ברשתית שמקורם בתאי גזע הוכיחו את עצמם כנאמנים במיוחד במידול הרקמה המורכבת של הרשתית העצבית האנושית5. זה הפך את מודל אורגנואיד הרשתית לטכנולוגיה מבטיחה לחקר וטיפול במחלות רשתית 6,7. עד כה, רוב מידול המחלה באורגנואידים ברשתית התמקד במחלות רשתית מונוגניות, שבהן אורגנואידים ברשתית נגזרים מקווי iPSC עם וריאנטים גנטיים גורמי מחלה7. בדרך כלל מדובר במוטציות חודרניות מאוד המתבטאות בפנוטיפים התפתחותיים. פחות עבודה נעשתה ביעילות על מחלות הזדקנות שבהן מוטציות גנטיות וגורמי עקה סביבתיים משפיעים על רקמות שהתפתחו באופן תקין. מחלות נוירודגנרטיביות של הזדקנות יכולות להיות בעלות תורשה גנטית מורכבת ותרומות מגורמי עקה סביבתיים שמטבעם קשה למדל באמצעות תרביות תאים לטווח קצר. עם זאת, במקרים רבים מחלות מורכבות אלה יכולות להתגבש על גורמי עקה תאיים או מטבוליים נפוצים, אשר, כאשר נבדקים על רקמה אנושית מפותחת, יכולים לספק תובנות רבות עוצמה על מחלות נוירודגנרטיביות של הזדקנות8.
המחלה הניוונית המקולרית המאוחרת, טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג II (MacTel), היא דוגמה מצוינת למחלה נוירודגנרטיבית מורכבת גנטית המתלכדת על פגם מטבולי נפוץ. מקטל היא מחלה ניוונית נדירה ברשתית של הזדקנות הגורמת לאובדן קולטני אור וגליה Müller במקולה, מה שמוביל לאובדן פרוגרסיבי בראייה המרכזית 9,10,11,12,13. ב- MacTel, תורשה גנטית לא מוגדרת, אולי רב-גורמית, מניעה ירידה נפוצה בסרין במחזור הדם בחולים, וכתוצאה מכך עלייה במין שומנים נוירוטוקסיים הנקראים deoxysphingolipids (deoxySL)14,15. כדי להוכיח שהצטברות של deoxySL רעילה לרשתית ולאמת טיפולים תרופתיים פוטנציאליים, פיתחנו פרוטוקול זה כדי להעריך רעילות של קולטני אור באורגנואידים ברשתית אנושית14.
כאן אנו מתארים פרוטוקול ספציפי להבחנה בין אורגנואידים ברשתית אנושית, ביסוס בדיקת רעילות והצלה באמצעות אורגנואידים, וכימות תוצאות. אנו מספקים דוגמה מוצלחת שבה אנו קובעים את הרעילות הספציפית לרקמות של גורם חשוד כגורם מחלה, deoxySL, ומאמתים את השימוש בתרופה גנרית בטוחה, פנופיברט, לטיפול פוטנציאלי ברעילות רשתית הנגרמת על ידי deoxySL. עבודות קודמות הראו כי פנופיברט יכול להגביר את השפלה של deoxySL ולהוריד את deoxySL במחזור הדם בחולים, עם זאת, יעילותו בהפחתת רעילות הרשתית הנגרמת על ידי deoxySL לא נבדקה16,17. למרות שאנו מציגים דוגמה ספציפית, פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת ההשפעה של כל מספר של גורמי עקה מטבוליים/סביבתיים ותרופות טיפוליות פוטנציאליות על רקמת הרשתית.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>125 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>1-deoxysphinganine</td><td>Avanti</td><td>860493</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף, מינוס ויטמין A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Beaver 6900 מיני להב</td><td>Beaver-Visitec</td><td>BEAVER6900</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-סוכרוז</td><td>VWR</td><td>97061-432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>תרמו-פישר</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, אבקת</td><td>גיבקו</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td><td>Thermo-fisher</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>סרום</td> <td>חמורSigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr>FBS, <td>קורנינג</td><td>מומת בחום</td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>Fenofibrate</td><td>Sigma</td><td>F6020</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לזיהוי מוות תאי באתר, פלואורסצין</td><td>סיגמא</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>מטריגל, גורם גדילה מופחת</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוסף</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% פורמלדהיד</td><td>תרמו-פישר</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-Recoverin נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip סטרילי חד פעמי יחידות מסנן ואקום</td><td>MilliporeSigma</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>רקמות פלוס- O.C.T. תרכובת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>EMS</td><td>62534-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>חיבור נמוך במיוחד 6 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>29443-030</td><td></td></tr><tr><td>חיבור נמוך במיוחד 75 ס"מ U-Flask</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr>וקטור <td>בינוני להרכבה Vectashield</td><td>מעבדות</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>עט שעווה-ImmEdge</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב סלעים)</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

אורגנואידים מספקים פלטפורמה מבטיחה לחקר מנגנונים וטיפולים במחלות, ישירות בהקשר של רקמה אנושית עם הרבגוניות והתפוקה של תרבית תאים. אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים משמשים לסינון טיפולים תרופתיים פוטנציאליים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).
לאחרונה הראינו כי MacTel יכול להיגרם על ידי רמות גבוהות של מין שומנים לא טיפוסי, deoxysphingolipids (deoxySLs). שומנים אלה רעילים לרשתית ועלולים לגרום לאובדן קולטני האור המתרחש בחולי מקטל. כדי לסנן תרופות על יכולתן למנוע רעילות של קולטני אור deoxySL, יצרנו אורגנואידים של רשתית אנושית מקו תאי גזע פלוריפוטנטיים שאינם מושרים על ידי מקטל (iPSC) והבשלנו אותם לגיל פוסט-מיטוטי שבו הם מפתחים את כל התאים שמקורם בשושלת העצבית של הרשתית, כולל פוטורצפטורים בוגרים מבחינה תפקודית. אורגנואידי הרשתית טופלו במטבוליט deoxySL ואפופטוזיס נמדד בתוך שכבת הפוטורצפטור באמצעות אימונוהיסטוכימיה. באמצעות מודל רעילות זה, נבדקו תרכובות פרמקולוגיות המונעות מוות של קולטני אור הנגרמים על ידי deoxySL. באמצעות גישה מועמדת ממוקדת, קבענו כי פנופיברט, תרופה הנרשמת בדרך כלל לטיפול בכולסטרול גבוה וטריגליצרידים, יכולה גם למנוע רעילות deoxySL בתאי הרשתית.
מסך הרעילות זיהה בהצלחה תרופה שאושרה על ידי ה-FDA ויכולה למנוע מוות של קולטני אור. זהו ממצא מעשי ישירות בשל המודל הרלוונטי מאוד למחלה שנבדק. ניתן לשנות פלטפורמה זו בקלות כדי לבדוק כל מספר של גורמי לחץ מטבוליים והתערבויות פרמקולוגיות פוטנציאליות לגילוי טיפול עתידי במחלות רשתית.

אורגנואידים ברשתית נוצרו מקו iPSC שאינו בקרת MacTel. לאחר שהאורגנואידים הגיעו ל-26 שבועות בתרבית, הם נבחרו וחולקו לקבוצות ניסוי. אורגנואידים טופלו בריכוזים משתנים של deoxySA כדי לקבוע אם deoxySA רעיל לקולטני אור. נבדקו ארבעה ריכוזים של deoxySA, מ-0 עד 1 מיקרומטר (איור 2), ואורגנואידים טופלו במשך 8 ימים, עם שינויי מדיה כל יומיים. מוות תאי בתגובה ל-deoxySA תלוי ריכוז וניתן לגילוי ב-deoxySA של 50 ננומטר בלבד (איור 2D). הריכוז הגבוה ביותר שנבדק, 1 מיקרומטר deoxySA, ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים ומשתמשים בהם בבדיקת רעילות קולטני אור כדי לזהות מועמדים תרופתיים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

פרוטוקול זה מספק גישה פרה-קלינית לגילוי ותיקוף טיפולים תרופתיים למחלות רשתית מטבוליות ישירות בתוך רקמת הרשתית האנושית. טכניקה זו משלבת את מורכבות חילוף החומרים ברקמות אנושיות עם הרבגוניות והתפוקה של תרבית תאים. השתמשנו בבדיקה זו כדי להשיג נתונים פרה-קליניים לטיפול במחלה הניוונית של הרשתית, MacTel, באמצעות תרופה נפוצה ובטוחה לשינוי שומנים, פנופיברט, שנמצאת כעת בניסויי בטיחות קליניים.גישה זו יכולה להיות מיושמת על מספר רב של גורמי לחץ נפוצים ברשתית שמובילים למחלות, כולל מחסור בחומרים מזינים, היפוקסיה, רעילות אור ושומנים רעילים אחרים. בשבוע 24 של התרבית, לבדוק את האורגנואידים להיווצרות של מקטעים בסיסיים בצד החיצוני של האורגנואיד. בשבוע 26 עד 28, המקטעים החיצוניים היו אמורים ליצור שכבה עבה.כאשר ניתן להבחין במקטע ספק מעובה, יש לדלל תמיסת מלאי deoxySA של מילימולרית אחת ל-0.51. ריכוז מיקרומולרי אחד ושניים בשלושה מיליליטר של מדיום התמיינות רשתית פלוס. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה וגשושית סטרילית, בחרו ארבע קבוצות אורגנואידים בערך באותו גודל וצורה עם מינימום של חמישה אורגנואידים לכל קבוצה, וחלקו את הקבוצות לבארות נפרדות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד בעלת 6 בארות.לאחר איסוף כל האורגנואידים, הסירו כמה שיותר מדיום מכל באר והוסיפו ריכוז אחד של תמיסת deoxySA לכל באר. הוסף את בקרת הרכב לקבוצה הרביעית של

toxicity-screens-human-retinal-organoids-for-pharmaceutical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

תאי מיקרוגליה הם תאי חיסון ייחודיים השוכנים ברשתית, וממלאים תפקידים מכריעים במחלות ניווניות שונות ברשתית. יצירת מודל תרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה יכולה להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה והתקדמות הפיתוח של מחלות רשתית.

הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

חלקיקים פלורסנט המיוצר במעבדה שלנו משמשים ריכוזי הדמיה יונים והנתיבים יון במערכות ביולוגיות כגון תאים במהלך נוזל איתות ביניים במהלך הומאוסטזיס פיזיולוגיים.

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

GENPLAT (רציף GLBRC אנזימים) מהווה פלטפורמה אוטומטיות לגילוי ואופטימיזציה של קוקטיילים אנזים לפירוק ביומסה. זה יכול להיות מותאם ממקורות מרובים תערובות של אנזימים המכילים רכיבים מרובים.

GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

גלה שיטת סקרינינג תרופות באורגנואידים של רשתית אנושית לזיהוי תרופות מגנות מפני רעילות פוטורצפטורים. הפלטפורמה מאפשרת מחקר מחלות רשתית וגילוי תרופות חדשות ביעילות גבוהה.

מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות

גלה סרטונים נוספים