צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

אפיון מודל תלת ממדי במבחנה ברזולוציה תאית ותת תאית הוא קריטי לניצול מלא, אך יכול להיות מאתגר. לכן, סיפקנו פרוטוקול משלים להדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים תלת-ממדיים קבועים במבחנה הנעים בין 100 מיקרומטר למספר מילימטרים. מבנים תלת ממדיים הם רדיאליים, ויש לטפל בהם בזהירות.

לפני הפיפט, בדוק את המיקום של המבנים התלת-ממדיים שלך בתוך הצינור כדי למנוע כל שאיפה. כפי שהתאמנו טכניקות קלאסיות להטמעת מבנים קטנים כגון אורגנואידים או ספרואידים, הוראות חזותיות יכולות לעזור למשתמשים בפעם הראשונה לבצע את המשימה ביתר קלות. מי שתדגים איתי את ההליך תהיה לורה פרנקולס, טכנאית מעבדה מהפלטפורמה לחקר הפתולוגיה.

כדי להכין דוגמאות לצביעה תלת-ממדית של תושבת שלמה, השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד המקודד מראש עם BSA כדי להוסיף תרחיף מבנה תלת-ממדי של מיליליטר אחד לשפופרת של 500 מיקרוליטר של PBS. כאשר המבנים התלת-ממדיים התיישבו בתחתית הצינור, החלף בזהירות את PBS בתמיסת חסימת חדירה של 500 מיקרוליטר לדגירת שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה אופקית עדינה במהירות של 30 עד 50 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, אפשרו למבנים התלת-ממדיים לשקוע שוב לפני ששטפו בזהירות את המבנים התלת-ממדיים פעמיים במיליליטר אחד של 0.1% PBS בתוספת BSA במשך שלוש דקות לכל שטיפה.

לאחר השטיפה האחרונה, תייגו את המבנים התלת-ממדיים עם 250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני ב-PBS למשך יומיים-שלושה עם תסיסה אופקית עדינה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שטפו את הדגימה בחמש שטיפות של שלוש דקות ושתי שטיפות של 15 דקות במיליליטר אחד של 0.1% PBS BSA לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, תייגו את המבנים התלת-ממדיים עם 250 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המתאים ב-PBS למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה אופקית עדינה המוגנת מפני אור.

למחרת, תייגו את המבנים התלת-ממדיים עם 250 מיקרוליטר מהריכוז המתאים של Hoechst 3342 לדגירת שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה אופקית עדינה. בסוף הדגירה, שטפו את המבנים התלת-ממדיים חמש פעמים במשך שלוש דקות ופעמיים במשך 15 דקות במיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה כפי שהודגם בהדגמה. לאחר השטיפה האחרונה, מעבירים את המבנים התלת-ממדיים למיקרו-צלחת פוליסטירן שחורה 96, ומוסיפים בעדינות 200 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי על המבנים, תוך הימנעות מבועות.

לאחר מכן מניחים את הצלחת מכוסה ברדיד אלומיניום בארבע מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות. כדי להטמיע מודלים גדולים של תרביות תאים תלת-ממדיות, השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד מצופה BSA כדי להעביר בזהירות את המבנים התלת-ממדיים לצינור זכוכית תחתון שטוח עם פקק בקבוק מרופד PTFE. לאחר שהמבנים שקעו, החליפו בזהירות את PBS באתנול 70% למשך דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, להחליף את 70% אתנול עם מיליליטר אחד של מוכן לשימוש eosin Y פתרון. יש להעיף את הצינור ולהכתים את המבנים למשך 30 דקות לפחות. בתום הדגירה, יש לייבש את המבנים בשלוש שטיפות רצופות של 30 דקות במיליליטר אחד של 100% אתנול לכל שטיפה.

לאחר ההתייבשות האחרונה, נקו את המבנים התלת-ממדיים עם שלוש שטיפות רצופות של 30 דקות במיליליטר אחד של קסילן לכל שטיפה מתחת למכסה מנוע כימי. לאחר טבילת הקסילן האחרונה, הניחו חתיכת פד ביופסיה ספוג קסילן בתא אחד של קלטת רקמת מיקרוטווין לבנה, והשתמשו בפיפטת פסטר פלסטיק מצופה BSA של שני מיליליטר כדי להעביר את המבנים התלת-ממדיים אל הפד. כסו את המבנים התלת-ממדיים בכרית ביופסיה ספוגה קסילן נוספת כדי להחזיק את המבנים התלת-ממדיים במקומם ולסגור את הקלטת.

לאחר שכל הדגימות הועברו, הניחו את הקלטות באמבט פרפין בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שתניחו את הקלטות באמבט פרפין טרי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, מוסיפים פרפין נוזלי לתבנית הטבעה מחוממת אחת של 65 מעלות צלזיוס לכל דגימה, ומניחים דגימה אחת משובצת פרפין בכל תבנית. הסעירו בעדינות את התבניות עד שכל המבנים התלת-ממדיים צונחים לתחתית, והשתמשו במלקחיים עדינים מחוממים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי למקם את המבנים התלת-ממדיים במרכז כל תבנית.

מצננים את התבנית עד שהפרפין יוצר שכבה מוצקה דקה, המבטיחה את המבנה התלת-ממדי במקומו. מניחים קסטת טישו ומוסיפים פרפין חם על התבנית. מוציאים את התבנית כאשר הפרפין התמצק לחלוטין.

כדי להטמיע מודלים קטנים של תרביות תאים תלת-ממדיות, שטפו בעדינות את המבנים התלת-ממדיים שלוש פעמים במיליליטר אחד של TBS לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, מוציאים כמה שיותר TBS מבלי לגעת במבנים, ומוסיפים שתי טיפות מגיב שתיים מערכת הטבעה מסחרית של פרפין. מערבבים בעדינות על ידי הקשה, ומוסיפים שתי טיפות מגיב, אחת עם הקשה עד שהג'ל מתמצק.

השתמשו במלקחיים עדינים כדי להעביר את הג'ל מהבאר של הקלטת שהורכבה מראש מהערכה, ולייבש את הדגימה המשובצת בג'ל עם דגירות אתנול וקסילן עולות של 30 דקות במכסה אדים כפי שצוין. לאחר טבילת הקסילן האחרונה, הניחו את הקלטת באמבט פרפין בטמפרטורה של 65 מעלות למשך הלילה לפני שתשתמשו במלקחיים עדינים כדי להעביר את הדגימה המשובצת בפרפין למרכז תבנית הטבעה מחוממת של פרפין נוזלי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אבטחו את המבנה התלת-ממדי עם שכבה נוספת של פרפין כפי שהודגם עבור מודלים גדולים של תרביות תאים תלת-ממדיות.

צביעה תלת ממדית של הר שלם ומיקרוסקופ קונפוקלי מספקים מידע חזותי על ההרכב התאי והמיקום המרחבי של מודלי התרבית התלת-ממדית לשדה עומק של עד 200 מיקרון. הרזולוציה הגבוהה שניתן לקבל עבור מבנים תלת-ממדיים באמצעות פרוטוקול זה מאפשרת יישום של אלגוריתמי סגמנטציה תאיים ותת-תאיים לכימות מספר התא ולאיתור סמני תאים שונים בתוך תת-סוגים שונים של תאים. ניתוח תושבות שלמות תלת-ממדיות יכול להיות מיושם על תאים דמיוניים בעומק של עד 200 מיקרון, ללא קשר למבנים השלמים.

להיפך, ניתוח חתכים דו-ממדי יכול לספק תובנות לגבי תאים בכל גודל.