שיטת חיסון קלה וגמישה להערכה מדויקת של פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי של ערבידופסיס וצמחים אחרים
9 במרץ 2021
אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת הפצת נבגים פשוטה המורכבת מקופסת חיסון עם רשת ~ 50 מיקרומטר ותא פלסטיק שקוף. ניתן להשתמש בו כדי לחסן צמחים באופן שווה בנבגי טחב אבקתיים, ובכך לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של פנוטיפים של מחלות של צמחים נחקרים.
טחב אבקתי הוא מחלה צמחית חשובה. קביעה מדויקת של פנוטיפ המחלה דורשת אפילו חיסון של הפתוגן. מכיוון שהשיטות הקיימות אינן יעילות, פיתחנו פרוטוקול זה.
שיטת חיסון הנבגים שלנו יכולה להשיג בקלות אפילו חיסון, והיא פשוטה וניתנת להרחבה. לפיכך, כל מעבדה העובדת עם טחב אבקתי יכולה בקלות להשתמש בשיטה זו. החוקרים יכולים גם להרכיב רשת על קופסת קרטון ולהשתמש בה לחיסון נבגים.
כיצד לנתק נבגים ולצחצח אותם דרך רשת הוא צעד קריטי. אז להדגים את זה בווידאו יכול להיות מאוד מועיל. עבור פרוטוקול זה, קבל גליל של רשת קרום ניילון 50 מיקרומטר או רשת נירוסטה של 48 מיקרומטר.
חותכים דיקט גדול בגודל בינוני לחתיכות של 24.5X10 אינץ' ו-12X10 אינץ' להכנת קופסת חיסון. כדי ליצור מכסה עליון נשלף עם רשת, חתכו את הדיבל המרובע הארוך מעץ לשני סטים של 26 אינץ' ו-12.75 אינץ'. הדביקו ומסמרו את ארבעת החלקים כך שיתאימו מסביב לקופסה.
קחו יריעות אקריליק והרכיבו את כל יריעות האקריליק לקופסה, באמצעות שמונה מלחציים פינתיים. חותכים חלון פתיחה בגודל 7X2 אינץ 'בצד הקדמי של יריעת האקריליק של הקופסה. כדי להכין נבגי טחב אבקתיים טריים כאינוקולה, לגדל צמחים מוטנטיים נקיים של אראבידופסיס עם פגיעה במערכת החיסון4-1 בתא גידול בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 65% במשך שישה עד שמונה שבועות.
לגדל את הצמחים כדי לקבוע פנוטיפים זיהום בדירות סטנדרטיות. יש לחסן אחד או מחצית מצמחי הפד4-1 כדי לבנות מספיק נבגי טחב אבקתיים טריים. כאשר נבגים טריים מצמחים נגועים זמינים, העבירו דירה של צמחים לתוך תיבת החיסון בתוך תא החיסון לבדיקת זיהום.
חותכים 15 עד 20 עלי ערבידופסיס נגועים בכבדות, ומניחים להם להתייבש אם יש מים מעובים. החזיקו אחד או שניים עלים הפוכים ביד אחת עם זוג מלקחיים ארוכים. לאחר מכן הכניסו את שתי הידיים דרך פתח החדר ופגעו בעדינות בזרוע המלקחיים עם זוג מספריים, תוך כדי הזזה איטית של העלים מעל הרשת המותקנת על תיבת החיסון.
הברישו את הנבגים עם מברשות בלנדר מאוורר עדינות דרך כל משטח הרשת בכיוונים שונים כדי למקסם את הפיזור השווה של הנבגים על הצמחים. טפחו בעדינות על הרשת כמה פעמים עם המברשות כדי לנער את הנבגים שנתקעו ברשת. לאחר שהנבגים שוקעים, הוציאו את הדירה המכילה את הצמחים המחוסנים מקופסת החיסונים.
מכסים את הדירה בכיפת פלסטיק ומניחים אותה בתא גידול בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-65% לחות יחסית. פנוטיפ המחלה יכול להתבצע ב 5 או 8 עד 12 ימים לאחר החיסון. המירו קופסאות קרטון לקופסת חיסון על ידי הסרת הצדדים העליונים והתחתונים של הקופסה, הדבקת הפינה כדי למצק אותה והרכבת רשת של 50 מיקרומטר בחלק העליון עם דבק.
הזיזו את השטוח המכיל את הצמחים בתוך תא החיסונים, והניחו את קופסת החיסונים הקטנה יותר על גבי הדירה כדי לכסות את הצמחים. לאחר מכן לנתק ולצחצח את הנבגים. הכינו קופסת חיסונים קטנה וקצת יותר גדולה מצלחת פטרי.
אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במקרר עד לשימוש. חותכים עלה אחד או שניים מורחבים במלואם מבסיס הפטיולה כדי שכל צמח ייבדק. מכניסים את הפטיולה של העלים המנותקים למדיום האגר בזווית של 30 מעלות.
לחסן את העלים בתוך תא החיסון, ולהעביר את הצלחת עם המכסה לתא הצמיחה. להערכת פנוטיפים של זיהום, מעבירים את העלים לצלחת אגר MS אספטית טרייה ארבעה או חמישה ימים לאחר החיסון. חותכים את בסיס הפטיולה לפני הכנסת העלים למדיום האגר הטרי.
להעריך את פנוטיפים המחלה בשמונה או תשעה ימים לאחר החיסון. הניתוח המיקרוסקופי הציג פיזור שווה של נבגים על השקופיות המיקרוסקופיות בתחתית הדירה. צפיפות הנבגים המחושבת, שהתפזרו בשישה מקומות שונים לאחר חיסוני האור, לא הראתה הבדלים משמעותיים.
תוצאות דומות הושגו לאחר חיסונים כבדים בנבגים. אחידות החיסון נבדקה בין גנוטיפים שונים של צמחים ב-12 יום לאחר חיסון כבד. צמחי הפד4-1 הראו רגישות מוגברת למחלות בהשוואה לקולומביה 0, צמחי הבר.
שימוש בנבגים טריים בכמות מספקת, המיוצרים כ-10 ימים לאחר החיסון, על צמחים רגישים, הם חשובים, משום שנבגים טריים קלים יותר לעקירה, וסביר יותר שהם יבססו התיישבות. טחב אבקתי מאכלס רק תאי אפידרמיס צמחיים. בידוד של תאים נגועים בטחב אבקתי על ידי קילוף האפידרמיס, או מיקרו-דיסקציה בלייזר, יאפשר מחקר תעתיק ופרוטאומי ממוקד יותר של תגובות המארח.
שיטה זו תסייע לחוקרים לקבוע ביעילות רבה יותר פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי, ולכן אמורה לאפשר מחקרים פונקציונליים יעילים יותר על אינטראקציות טחב אבקתי צמחי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מערכת בטוחה, יעילה וניתנת לשחזור לצורך פנוטיפג של מחלות בצמחי Arabidopsis המודבקים בטחב קפואי, פתוגן פטרייתי ביוטרופי. הפרוטוקול נותן מענה לאתגרים בהשגת הדבקה אחידה ובהערכה מדויקת של פנוטיפים של המחלה, ומספק שלבים מפורטים לבנייה ולהשמוש בציוד הדבקה ייעודי לשיפור תוצאות המחקר בלימודי אינטראקציה בין צמח לפתוגן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פתולוגיה של צמחים
- אינטראקציות צמח-מיקרוביים
- ביולוגיה ניסויית של צמחים
רקע
- הטל השחור הוא מחלה פטרייתית משמעותית המשפיעה על צמחים, כולל Arabidopsis.
- פנוטיפויז מדויק של המחלה חיוני להבנת החסינות של הצמח והפתוגנזה הפטרייתית.
- שיטות הדבקה קיימות גורמות לעיתים קרובות לפיזור נבגים לא אחיד, מה שמגביל את השחזוריות.
- פתוגנים ביוטרופיים כמו הטל השחור קשים לגידול במעבדה, דבר המסבך את מאמצי הפנוטיפויז.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית להדבקה אחידה של Arabidopsis בנבגי mildew פודרי.
- שיפור הדיוק והשחזור של פנוטיפינג של מחלות במחקרי אינטראקציה בין צמחים לפטריות.
- אספקת פרוטוקולים מפורטים והדגמות לבנייה ולשימוש במערכת ההדבקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של תיבת הדבקה מעץ עם מכסה רשת נשלף (רשת ניילון 50 μm או רשת פלדת אל-חלד 48 μm).
- שימוש בתא הדבקה מאקריליק שקוף עם פתח קדמי קטן כדי למזער את בריחת הנבגים.
- הכנת נבגי mildew אבקה טריים מ-Arabidopsis pad4-1 נגועים.
- פיזור אחיד של נבגים על ידי הברשה והטבחה של נבגים דרך הרשת על הצמחים או על עלים מנותקים.
- הערכה של פנוטיפי זיהום בנקודות זמן מרובות לאחר ההדבקה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר פיזור אחיד וניתן לשחזור של נשגי mildew אבקי (powdery mildew) על פני תבניות צמחים ועלים מופרדים.
- ניתוח מיקרוסקופי אישר צפיפות נבגים אחידה במספר מיקומים, הן לאחר חיסון קל והן לאחר חיסון כבד.
- צמחים מוטנטיים מסוג pad4-1 הראו רגישות מוגברת למחלה בהשוואה לבקרה של טיפוס ברי.
- נבגים טריים (שהופקו כ-10 ימים לאחר ההחדרה) היו יעילים יותר לצורך התנחלות ופנוטיפויג.
מסקנות
- מערכת זו מספקת שיטה מהימנה ונגישה להחדרה אחידה של פתוגנים ולאפיון מדויק של מחלות במחקרי *Arabidopsis*-mildew powdery.
- הגישה היא גמישה, בעלות נמוכה ומתאימה למגוון רחב של מעבדות.
- אפיון משופר יסייע במחקרים פונקציונליים של חסינות צמחים ואינטראקציות עם פתוגנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
פנוטיפינג מדויק וניתן לשחזור של מחלות מהווה צוואר בקבוק קריטי במחקר של פתוגנים בצמחים, המשפיע ישירות על רמת הביטחון החזויה של תיקוף מטרות ומחקרי תפקוד. מערכת הדבקה גמישה זו מאפשרת הולכה סטנדרטית ואחידה של נבגים להדבקה בקומי mildew (Oidium), ובכך תומכת בבדיקה חסונה של היפותזות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולת ההתאמה וההתרחבות שלה ממיצבה כבעלת יכולת רב-פעמית למחקר תרגומי של חסינות צמחים ומו"פ להגנת גידולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה קפדנית של נתיבי חיסון בצמחים על ידי הבטחת חשיפה אחידה לפתוגן.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות גנטיות באמצעות פנוטיפ של זיהום הניתן לשחזור.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מזעור השונות בקריאת נתוני המחלה.
- משפר את הביטחון החזוי עבור החלטות מיון של תיק פרויקטים בשלבים הבאים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות מאושרות של צמח-פתוגן עבור תהליכי סריקה בעלי רמת ביטחון גבוהה.
- מנרמל את תנאי ההדבקה כדי לשפר את הדירות וההשוואתיות של הבדיקה.
- מספק תוצרי הדבקה כמותיים ואחידים מרחבית להערכה אמינה של תרכובות.
- מאפשר פריסה של בדיקות ניתנות להרחבה וכלכליות בין צוותי מחקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי הפנוטיפיקה למודלים צמחיים רלוונטיים למחלה לצורך רצף תרגומי.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים של גנים מועמדים או טיפולים, בהתבסס על נתוני זיהום חסונים.
- מספקת פלטפורמה למחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים ממוקדים של אינטראקציות מאח-פתוגן.
- מפחיתה סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי שיפור איכות הנתונים בשלבים מוקדמים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ההחדרה זו משתלבת באופן חלק משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי המולקולות המובילות ועד לתיקוף פרה-קליני בשרשראות מחקר של מחלות צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה מונחית-היפותזה של מנגנוני חסינות צמחים ועוצמת מחלה של פתוגנים.
- סריקה: מספק פנוטיפים של זיהום כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות לבדיקה וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות אחידות המאפשרות השוואה סטטיסטית חסונה בין גנוטיפים וטיפולים.
- מחקר תרגומי: שומר על רצף בין פנוטיפינג של גילוי לבין תיקוף פרה-קליני במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה בעלות נמוכה וניתנת להתאמה לשימוש חוזר במגוון מחקרים של צמח-פתוגן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי צמחים-פתוגנים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות הדבקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות יעילה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) ויעילות הון על ידי שיפור איכות הנתונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מובילים גנטיים או כימיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפתולוגיה של צמחים ובניתוח פנוטיפי.
- נדרשת תשתית מעבדה בסיסית להרכבת תיבות ותאי גידול ותנאי גידול מבוקרים.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההחדרה והפנוטיפיקה בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למיני צמחים ומערכות פתוגנים שונות באמצעות שינויים ברשת ובתא הגידול.
- תלוי בזמינות של נבגי נבטה טריים וחיים להשגת עקביות אופטימלית של ההדבקה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Making a Standard Inoculation Box with a Removable Top Lid Mounted with a Mesh
1:17
Making an Inoculation Chamber and Inoculating Plants in Flats
3:13
Inoculate Plants with Smaller Inoculation Boxes
3:42
Inoculate Detached Leaves in Petri Dishes
4:37
Results: Assessment of Inoculation Evenness
5:19
Conclusion
