מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר

בשילוב עם הדמיית סידן של תאים חיים, טכניקת פרוסת רקמת הלבלב החריפה מאפשרת לחקור גלים בין-תאיים וקישוריות תפקודית רב-תאית ברזולוציה גבוהה לאורך תקופות זמן ארוכות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, משמרת את ארכיטקטורת הרקמות ומפחיתה מתח אנזימטי ומכני מוגבל תוך שמירה על תפוקה גבוהה של רקמה. על ידי זיהוי שינויים תפקודיים ומורפולוגיים במהלך התקדמות המחלה, טכניקה זו מסייעת להבנתנו את המחלות הקשורות ללבלב, כגון סוכרת.

ניתן ליישם טכניקה זו של פרוסת רקמות על רקמות המוח, יותרת המוח ואדרנל, תוך שימת דגש על שימור מגע בין-תאי, אינטראקציות של פרקרין וארכיטקטורת רקמות. כדי להתכונן להזרקת אגרוז ללבלב העכבר, מלאו מזרק של חמישה מיליליטר באגרוז נוזלי של 40 מעלות צלזיוס וציידו את המזרק במחט של 30 מעלות צלזיוס. לאחר כיסוי קפדני של המחט בכובע, מניחים את קצה מחט המזרק כלפי מטה, עם כל נפח האגרוז מתחת לפני המים, באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס.

מבעבעים בקבוק של תמיסה חוץ-תאית עם קרבוגן, ברציפות על קרח, במהירות של 1.5 מיליליטר לדקה בלחץ ברומטרי ובטמפרטורת החדר כדי להבטיח חמצון ו-pH של 7.4. כדי לבצע את הזרקת האגרוס מניחים עכבר בוגר מורדם תחת מיקרוסקופ סטריאופוני וניגשים לבטן העכבר באמצעות לפרוטומיה. הזיזו בעדינות את המעיים לצד שמאל כדי לחשוף את צינור המרה הנפוץ והשתמשו במלקחיים כדי להרים מעט את קצה התריסריון של הצינור כדי לאתר את הפפילה של ואטר.

השתמש hemostat כדי להדק את צינור המרה בפפילה התריסריון כדי למנוע דליפה של האגרוז מן הצינור לתוך התריסריון ולהשתמש מלקחיים חדים קטנים כדי להגיע מתחת לצינור המרה המשותף כדי לשבור את הקרום המחבר את הצינור לרקמת הלבלב. לאחר ניקוי כמות השומן ורקמת החיבור מהצינור ככל האפשר, מניחים את הצינור בניצב על קצות זוג מלקחיים גדולים יותר, ולוחצים בחוזקה על בוכנת המזרק, הזריקו את האגרוז הנוזלי הצמיג לקצה הפרוקסימלי של צינור המרה הנפוץ למשך 20 עד 30 שניות. כאשר הרקמה הופכת לבנבנה ומנוכרת מעט מסירים את המזרק ושופכים באיטיות 20 מיליליטרים של התמיסה החוץ-תאית הקרה כקרח על הלבלב כדי לקרר את הרקמה ולהקשיח את האגרוז.

כדי לרכוש פרוסות רקמת לבלב יש להשתמש במלקחיים ובמספריים חתוכים דקים וקשים כדי להעביר בעדינות את הלבלב המוזרק לאגרוזה לתוך צלחת פטרי של 100 מילימטר המכילה 40 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית קרה כקרח. סובבו את התבשיל כדי לשטוף את הרקמה ולהעביר את הלבלב למנה שנייה של תמיסה חוץ-תאית קרה כקרח. השתמשו במלקחיים ובמספריים כדי לחתוך את חתך הלבלב הלבן והמוזרק היטב לעד שש חתיכות של 0.1 עד 0.2 סנטימטר מעוקב ולהסיר את כל רקמות החיבור והשומנים שנותרו מחתיכות הרקמה.

מכניסים את הבלוקים המנוקים לתוך צלחת פטרי תחתונה לא דביקה בקוטר 35 מילימטרים המכילה כחמישה מיליליטרים של אגרוז נוזלי 40 מעלות צלזיוס ומניחים מיד את צלחת הפטרי על הקרח. כאשר האגרוז מתקשה, החזיקו את צלחת הפטרי הפוכה מעל המכסה של צלחת פטרי באורך 100 מילימטר והשתמשו בחצי אחד של סכין גילוח כדי לחתוך בזהירות את השוליים שבין הקיר הצדדי של צלחת הפטרי לבין האגרוז כדי להסיר את האגרוז מהמנה. השתמשו בסכין הגילוח כדי לחתוך קוביות בודדות, שכל אחת מהן מכילה גוש רקמה אחד של אגרוז, מהאגרוז המשוחרר והשתמשו בדבק ציאנואקרילט כדי לחבר את הבלוקים לצלחת הדגימה של ויברטום.

מלאו את תא החיתוך של הוויברטום ב-150 מיליליטרים של תמיסה חוץ-תאית קרה כקרח המבעבעת ברציפות בקרבוגן. בורג לתקן את לוחית הדגימה על vibratome ולהרכיב סכין גילוח חדש. הקיפו את התא בקרח והוסיפו שתי קוביות קרח בנפח 10 מיליליטר העשויות מתמיסה חוץ-תאית בתוספת גלוקוז של שישה מילימולרים.

הגדר את החתך ל-0.05 עד 1 מילימטר לשנייה ו-70 הרץ, ואז התחל לחתוך כדי לרכוש פרוסות אגרוז בעובי 140 מיקרון עם שטח פנים של 20 עד 100 מילימטר מרובע. השתמשו במברשת צבע עדינה כדי להעביר בזהירות כל פרוסה לתוך צלחת פטרי של 100 מילימטרים במילוי 40 מילימטרים של חיץ HEPES בתוספת גלוקוז של שישה מילימולרים. להכנת צבע סידן, ממיסים 50 מיקרוגרם של צבע מחוון סידן חדיר לתא, 7.5 מיקרוליטרים של DMSO, ו-2.5 מיקרוליטרים של הפולו-קסאמר, ו-6.667 מיליליטר של HBS בצינור מכסה בורג של 15 מיליליטר.

השתמש בפיפטה כדי לערבב ביסודיות את התמיסה במשך 20 שניות לפני טבילת הצינור בתא אמבטיה על-קולי ומערבולת, כל אחד למשך 30 שניות. לאחר מכן aliquot 3.333 מיליליטרים של תמיסת צבע מחוון סידן וכתוצאה מכך לתוך אחד 5 מיליליטר פטרי צלחת לכל 10 פרוסות של רקמה להיות מסומן. להעמסת צבע, השתמשו במכחול דק ורך כדי להעביר עד 10 פרוסות טישו לכל מנה של תמיסת צבע והניחו את הכלים על שייקר מסלולי למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר ו-40 סיבובים לדקה מוגנים מאור.

בסוף הדגירה, מעבירים עד 20 פרוסות מוכתמות לתוך כלי פטרי 60 מיליליטר בודדים במילוי HBS ללא צבע. להדמיית סידן על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית בחרו הגדלה של פי 20 או 25 והגדירו את מצב הרכישה להדמיית קיטועי זמן, חור הסיכה ל-100 עד 200 מיקרון, והעירור והפליטה של הפלואורופור ששימשו בניסוי. הרכיבו את תא ההקלטה ואת מערכת הזלוף על הבמה מבוקרת הטמפרטורה של המיקרוסקופ והניחו את הכניסה והשקע בקצוות הרחוקים של תא ההקלטה.

הגדר את קצבי הזרימה והיציאה ל-1 עד 2 מיליליטר לדקה. הגדר את הטמפרטורה של מערכת השפע ל -37 מעלות צלזיוס והתחל את השפע עם הפתרון שאינו ממריץ. כדי לתעד את דינמיקת הסידן של הרקמה מניחים פרוסת רקמה אחת לתוך תא ההקלטה ומשתקים את הרקמה עם משקל פלטינה בצורת U עם רשת ניילון מתוחה.

השתמש באפשרות השדה הבהיר כדי לאתר את מבנה העניין ולהשתמש בהדמיה חיה כדי למקם את המבנים הנחקרים בשדה הראייה. כדי למטב את יחס האות לרעש, התאם את הספק הלייזר, הגברת הגלאי והחיבור הממוצע של הקו תוך שמירה על הספק הלייזר מינימלי. התאם את מישור המוקד ל-15 מיקרון מתחת למשטח החיתוך כדי להימנע מהקלטה של תאים שעלולים להיפגע ולרכוש את התמונות.

הגדרת תדירות הדגימה לאחד עד שני הרץ כדי לאפשר זיהוי ראשוני של תנודות בודדות ורישום תמונה ברזולוציה גבוהה. אם זמין, השתמש בתרשים מקוון כדי לקבל משוב מיידי על תגובת ההכנה, תאורת יתר, הלבנת תמונות וסחף מכני. לאחר שכל התמונות נרכשו, שמור את הנתונים לניתוח מאוחר יותר.

כאן ניתן לראות דוגמה לפרוסת רקמה אופטימלית שבה צבע מחוון הסידן החדיר של התא הועמס בהצלחה לפרוסת רקמת הלבלב. לעומת זאת, פרוסות רקמה אלה אינן אופטימליות להדמיה בשל חדירת צבע לא מוצלחת, מחסור בתאי איון או שפע של רקמה נמקית על פני השטח של הדגימות. תמונות ברזולוציה גבוהה של פרוסת רקמת לבלב יכולות לשמש לתיחום אזורים שונים של רקמת הלבלב, כגון האיים של לנגרהנס, רקמת אסינאר או צינור הלבלב.

ניתן להשתמש בגירויים כדי להבחין באופן פונקציונלי בין תאי איון שונים או בין תאי איון לתאים שאינם איון. לדוגמה, תאי בטא מגיבים בדרך כלל לגירוי גלוקוז בפולס מרובע על ידי הצגת עלייה חולפת בסידן תוך תאי ואחריה תנודות סידן מהירות על מישור מתמשך. לעומת זאת, תאים שאינם בטא מגיבים בתנודות מהירות ולא סדירות יותר.

ניתן למדוד גם עיכוב בהתפרצות הסידן התוך-תאי לאחר הגירוי, כמו גם את ההטרוגניות והעיכובים בקרב תאים בודדים. ניתן להשתמש באותם פרמטרים כדי לתאר את שלב ההשבתה. כאן ניתן לראות הצגה סכמטית של משך תנודת הסידן התוך-תאית, התדירות ואחוז הזמן הפעיל.

כאשר הדמיה בקצבי רכישה העולים על 10 הרץ, ניתן לזהות בבירור גלי סידן המתפשטים שוב ושוב על פני האיון. מהדק את צינור המרה הנפוץ קרוב ככל האפשר לתריסריון כדי למנוע חסימה בטעות של הענף הנכנס ללבלב. כמו כן, אל תפסיק לדכא את הבוכנה במהלך ההזרקה כי האגרוז יתקשה מיד במחט.

ניתן להשתמש בטכניקת פרוסת רקמות הלבלב של עכבר חריף גם בשיטת הידוק המדבקה כדי לחקור זרמי תעלות יונים ולגשת לציטוזיס, כמו גם מחקרים אימונוהיסטוכימיה ומחקרי מזכירה.