פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לפיתוח מבחני ddPCR מולטיפלקס פנימיים לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. זה שימושי עבור אנשים שרוצים לפתח ערכות משלהם לזיהוי של SARS-CoV-2 ופתוגנים אחרים. בהשוואה לתקן הזהב RT-qPCR, RT-ddPCR יכול לשמש לכימות גנים מרובים של SARS-CoV-2 ללא צורך בעקומה סטנדרטית.

מכיוון ש- ddPCR היא טכניקה מתפתחת, הדגמה חזותית חשובה כדי לעזור למשתמשים הנוכחיים והעתידיים להבין ולפתח בקלות בדיקות מולטיפלקס לזיהוי SARS-CoV-2 ופתוגנים אחרים. עבור סינתזת cDNA, הוסף שני מיקרוליטרים של תערובת מאסטר שעתוק לאחור 5X, חמישה מיקרוליטרים של דגימת RNA מעניינת, ושלושה מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים ללא RNase לתוך צינור PCR של 100 או 200 מיקרוליטר לנפח סופי של 10 מיקרוליטר כתמיסה, והנח את הצינור על קרח. לאחר הוספת הריאגנטים, טען את הדגימה לתוך מחזור תרמי והגדר את המכשיר להריץ שעתוק לאחור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, השבתת חום של התעתיק ההפוך למשך 5 שניות ב 85 מעלות צלזיוס, והחזקה אינסופית סופית בארבע מעלות צלזיוס.

לפני ביצוע PCR דיגיטלי טיפתי, להוסיף 19.8 מיקרוליטר של תערובת אב מוכן טרי למספר המתאים של בארות של צלחת PCR דיגיטלית טיפתית 96 באר ללא נוקלאז. הוסף 2.2 מיקרוליטר של cDNA לכל באר של תערובת מאסטר לנפח סופי של 22 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל באר ואטם את הצלחת עם אוטם צלחת PCR חד פעמי. לאחר מכן, סובבו את הצלחת במשך 15 עד 30 שניות בצנטריפוגה למשך 10 עד 15 שניות כדי לאסוף את תכולת הבאר בתחתית הצלחת.

ליצירת טיפות אוטומטית במסך המגע האוטומטי של מחולל הטיפות, לחץ על הגדר צלחת דגימה ובחר את העמודות שבהן הדגימות ממוקמות על לוח הדגימה. לחץ על אישור ופתח את דלת מחולל הטיפות האוטומטי. טען את לוחות הדגימה ויצירת הטיפות ואת החומרים האחרים הדרושים לניסוי למיקומים המתאימים בתוך המכשיר וסגור את הדלת.

כאשר מסך המגע הופך לירוק, המציין שכל החומרים הועמסו למיקומם הנכון, בחרו שמן לגשושיות והתחילו בייצור טיפות. המתן עד שייצור הטיפות יפעל לסיום בהתאם לזמן המצוין על המסך. כאשר המסך אומר טיפות מוכנות, פתח את הדלת כדי להסיר את הצלחת המכילה את הטיפות והשתמש באטם צלחת במשך חמש שניות ב 180 מעלות צלזיוס כדי לאטום את הצלחת עם אטם נייר כסף נוקב.

תוך 30 דקות מרגע יצירת הטיפות, הניחו את צלחת הטיפות האטומה לתוך מחזור תרמי של באר עמוקה 96. הגדר את נפח הדגימה ל -40 מיקרוליטר ואת טמפרטורת המכסה ל -105 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, PCR להגביר את הטיפות.

לקריאת טיפות, לאחר ההגברה, העבירו את הצלחת התרמית בעלת מחזור 96 בארות לקורא טיפות ופתחו את התוכנה הנלווית במחשב המחובר לקורא הטיפות. ממצב ההתקנה, בחר חדש ולחץ פעמיים על כל באר כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של עורך הבאר. בחר את הבארות לקריאה והגדר ניסוי לכימות מוחלט, supermix כדי droplet דיגיטלי PCR supermix עבור בדיקות.

יש לכוון סוג אחד לערוץ 1 לא ידוע ולכוון סוג שני לערוץ 2 לא ידוע. הקצו את השמות לדוגמה בהתבסס על פריסת הלוח ולחצו על 'החל' ו'אישור'. לאחר שמירת התבנית, לחץ על הפעל.

כאשר תתבקש על-ידי התוכנה, בחר בצבע FAM/HEX. בסוף רכישת הנתונים, הסר את הלוח מהקורא. לפני ניתוח הנתונים, בדוק את הנתונים מכל הבארות כדי לקבל את המספר הכולל של טיפות.

והגדר סף לקבלת מספר מינימלי של טיפות שייספרו כתוצאות חיוביות או שליליות. לניתוח בדיקה חד-צדדית ודופה, לחץ פעמיים על קובץ QLP לניתוח ובחר נתח. השתמש בכלי הסף של משרעת 1D ומשרעת דו-ממדית כדי להבחין בין הטיפות החיוביות והשליליות עבור כל באר בערוץ הנכון, תוך שימוש בפקד תבנית הצומת ובדגימות הבקרה החיוביות כמדריך.

לאחר מכן, יצא את התוצאות כקובץ CSV לניתוח נוסף. לבדיקת תערובת גשושיות טריפלקס, פתח את קובץ QLP ובחר את הבארות לניתוח בכרטיסייה עורך הלוחות. הגדר את סוג הניסוי לכימות ישיר ואת המבחן לבדיקת מיקס טריפלקס, והזן את שם היעד.

לאחר מכן לחץ על החל. השתמשו בכלי התרשימים להקצאת צבעים מסוימים לאשכולות יעד שונים, בהתאם להוראות הבחירה להקצאת הצעות נפתחות לחלון אשכולות. לאחר הקצאת כל צבעי היעד, נתוני הכימות יוצגו בחלון נתוני הבאר.

יצא את הנתונים כקובץ CSV לניתוח במורד הזרם. עבור מבחן מרובע, הגדר את סוג הניסוי לכימות ישיר ואת המבחן למולטיפלקס משרעת. הזן את שם היעד ולחץ על החל.

השתמשו בכלי התרשימים להקצאת צבעים מסוימים לאשכולות יעד שונים, בהתאם להוראות הבחירה להקצאת הצעות נפתחות לחלון אשכולות. לאחר הקצאת כל צבעי היעד, נתוני הכימות יוצגו בחלון נתוני הבאר. יצא את הנתונים כקובץ CSV לניתוח נוסף.

כפי שנצפה בניתוח שיפוע טמפרטורה מייצג זה, טמפרטורות כריעה גבוהות יותר לא יכלו להבחין בבירור בין טיפות חיוביות לטיפות שליליות כאשר בוצעה בדיקת דופלקס. עם זאת, עם ירידה בטמפרטורת הכריעה, הושגה הפרדה אופטימלית בין טיפות חיוביות ושליליות. באמצעות מערכת זיהוי PCR דיגיטלית טיפתית RT בשני צבעים, ניתן לזהות מטרה אחת, שתיים, שלוש וארבע מטרות SARS-CoV-2 בדגימה אחת.

ניתן להשתמש בדוגמת בקרה ללא תבנית כדי לאתר טיפות שליליות כדי לסייע בקביעת הסף השלילי בבדיקות חד-צדדיות. במבחני דופלקס, הניתוח יכול להתבצע בערוצים בודדים או באמפליטודה הדו-ממדית. למרות שניתוח נתונים של מבחני מולטיפלקס מסדר גבוה יותר אינו פשוט, בדיקות אלה שימושיות, מכיוון שהן מאפשרות להעריך עד שמונה אשכולות טיפות במבחני תערובת בדיקה טריפלקסית ועד 16 אשכולות טיפות עבור מבדקים מבוססי משרעת מרובעת.

בהתאם לבדיקה שיש לפתח, ודא שפריימר המטרה הנכון וריכוזי הבדיקה מתווספים לתמהיל האב. באמצעות הליך זה, ניתן להחליף את המטרות כדי לפתח בדיקות RT-ddPCR חדשניות. בדיקה זו יכולה לשמש למטרות מחקר שונות או לאבחון של מחלות זיהומיות מתפתחות.

מאז פיתוחה, טכניקה זו שימשה לקביעה מדויקת של עותקים של חומצות גרעין נגיפיות בתקנים שונים, גוף האדם ודגימות סביבתיות.