זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

דו"ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.

פרוטוקול זה מתאר טכניקה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לזהות את הנוכחות ולמדוד את אורך הגליקוזאמינוגליקנים, שהם מולקולות בעלי משמעות מוכרת יותר ויותר לתהליכים ביולוגיים רבים. טכניקה זו ניתנת להתאמה בקלות לרוב המעבדות למדעי החיים. טכניקות גליקומיות דומות דורשות לעתים קרובות ציוד ומומחיות שנמצאים רק במעבדות מחקר גליקוכימיה.

טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לחוקרים המעוניינים לחקור את הגליקוליקס, מעיל פוליסכריד המיישר את משטחי האנדהל והאפיתל של גוף האדם. התחל על-ידי הצבת קלטת ריקה במיכל PAGE. יצוק ג'ל פתרון על ידי ערבוב 10 מיליליטר של פתרון ג'ל פתרון פתרון עם 60 microliters של מוכן טרי ב 10% אמוניום אסולפט בצינור 15 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטרים של TEMED. הפוך את הצינור בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים. הוסף במהירות 10 מיליליטר של פתרון ג'ל polyacrylamide מופעל לקלטת באמצעות pipette.

כיסוי עם שני מיליליטר של מים מסוננים deionized, ולאפשר ג'ל פתרון כדי פולימר במשך 30 דקות. לאחר שהג'ל לפתרון הפך לפולימרי מלא, יש להשליך את המים עם הכיס. להטיל את ג'ל הערימה על ידי ערבוב שלושה מיליליטר של פתרון ג'ל לערום עם 90 microliters של 10% אמוניום אסולפט מוכן טרי בצינור 15 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של TEMED והפוך את הצינור בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים. השתמש פיפטה כדי להוסיף במהירות את פתרון ג'ל הערימה מעל ג'ל פתרון מוצק עד הקלטת מתמלאת עד הקצה. הכנס באופן מלא את המסרק הכלול בקלטת ג'ל הפוליקרימיד הריקה ואפשר לג'ל הערימה להסתגר במשך 30 דקות.

לאחר הג'ל הוא פולימר, להסיר את רצועת הסרט מתחתית הקלטת, ולהניח את הקלטת בחזרה לתוך הרכבת טנק PAGE. מלא את התאים העליונים והתחתונים בפתרונות המאגר המתאימים. להמיס דגימות glycosaminoglycan מיובש בנפח המינימלי הדרוש של מים מסוננים deionized ומערבבים עם חוצץ טעינה מדגם ביחס של אחד לאחד.

טען את הדגימות ואת סולמות האוליגו-סכריד של HS לתוך הג'ל. להריץ את הג'ל במשך חמש דקות ב 100 וולט, ולאחר מכן להפעיל אותו ב 200 וולט במשך 20 עד 100 דקות, בהתאם לאחוז אקרילאמיד של פתרון ג'ל פתרון. לאחר השלמת הריצה, לפרק את הקלטת ולחלץ בזהירות את הג'ל לתוך מיכל גדול ונקי מלא במים מסוננים deionized.

לאחר מכן להשליך את המים ולהכתים את הג'ל בתמיסת כתמים כחולים Alcian במשך חמש דקות. יש להשליך את הכתם הכחול האלקי, ולשטוף במהירות פעמיים עד שלוש פעמים במים מסוננים דה-יעו"ד עד להסרת רוב תמסת הכתמים הכחולה האלקית. מכתימים את הג'ל בתמיסת כתמי חנקות מכסף במיכל נקי ורענן למשך 30 דקות.

לאחר מכן לשטוף פעמיים עד שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד במים מסוננים deionized כדי להסיר באופן מלא את פתרון כתמי כסף. להשליך את המים ולהוסיף פתרון מתפתח. בזהירות להתבונן ג'ל להופעת להקות.

בהתאם לאיכות הכתם ומסת המדגם שנטען, הפיתוח יכול להימשך בין כמה שניות למספר דקות. ברגע הרצועות הרצויות גלויים, מיד להשליך את הפתרון המתפתח לשטוף את הג'ל בקצרה עם פתרון STOP. הגליקוזאמינוגליקנים המבודדים והמטוהרים הוצגו באמצעות טכניקת הכתמת כחול וכסף אלסיאנית לאחר רזולוציה תלויה בצפיפות על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד.

כפי שניתן לראות באיור זה, אוליגוסכרידים הפרין סולפט באורכים פולימריים שונים היו ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות גישה מבוססת PAGE זו. מגבלת הזיהוי של שיטה זו, נמוכה עד 0.5 מיקרוגרם, מראה כי הטכניקה רגישה מאוד בזיהוי גליקוזאמינוגליקנים מבודדים ומטוהרים מדגימות ביולוגיות. מתוך ארבעת ההפרין סולפטים השונים אוליגוסכרידים שדמיינו בשיטה זו, הפרין לא מפוצל היה פחות ניתן לזיהוי בקלות.

בשל polydispersity של הפרין unfractionated, הצפיפות של כל רצועה בודדת מדגם זה נמוכה יותר מאשר להקות המיוצרות על ידי מסה שווה של אוליגוסכרידים הפרין מטוהר. היעילות של טיהור גליקוסאמינוגליקן מדגימות ביולוגיות נוזליות הוערכה באמצעות דגימות שטיפה ברונכואלבולרי שנאספו מעכברים, שבמקור הכילו ריכוזים נמוכים יחסית של גליקוזאמינוגליקנס. בנוסף, ההצלחה של טכניקה זו הודגמה באמצעות הפרין גופרתי מבודד הומוגנט ריאות שלם, אשר הניב כמות גדולה של הפרין גופרתי מבודד, עם השברים הקטנים ביותר השווים כ 10 subaccharide subunits במסה.

חשוב מאוד להשתמש בריאגנטים טריים, ולסנן כל ריאגנט המשמש בפרוטוקול זה. זה קריטי להשתמש ריאגנטים של הטוהר והאיכות הגבוהים ביותר כדי לבצע בהצלחה טכניקה זו.