ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן
5 במרץ 2022
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני תמלול ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי, כולל בקרת איכות וצעדי עיבוד מראש לגישות אנליטיות סטטיסטיות מתקדמות.
ברוכים הבאים לפרוטוקול של ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן. פרוטוקול זה מחולק בשלבים הבאים. בקרת איכות לסינון קריאות באיכות נמוכה וגם להסרת רצפי מתאם רצף וביאורים, היכן עליך למפות את הקריאות לגנומי ייחוס ולהכניס את הקריאות לגנים.
ניתוח סטטיסטי וביטוי משותף, המגדיר את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי ומוצא גם את מודולי הביטוי המשותף. דרגה מולקולרית של ניתוח שיבוש כדי למצוא דגימות חריגות פוטנציאליות. ולבסוף, הניתוח התפקודי כדי לקבוע את הפונקציות הביולוגיות של גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי.
כל הכלים המשתמשים בצנרתות אלה הותקנו מראש במערכת לינוקס ונאספו לתוך מיכל Docker. הדגימות המשתמשות בפרוטוקולים אלה נגזרות ממאמר שפורסם על ידי הקבוצה שלנו בפתוגן PLOS. הדגימות כוללות 20 אנשים בריאים ו -39 חולים נגועים בנגיף Chikungunya.
דגימות הדם נאספו, ורצף RNA בוצע. כדי להתקין את Docker במערכת Windows, עליך לבצע שלבים אלה. עבור אל דף האינטרנט הרשמי של Docker ולחץ על התחל בעבודה.
מצא את המתקין עבור שולחן העבודה של Docker עבור חלונות. הורד את הקובץ. התקן באופן מקומי במחשב שלך.
ודא ששתי אפשרויות אלה מסומנות. לאחר התקנת התוכנית, מוריד את התמונה Docker עבור פרוטוקול זה. עבור אל מסוף Windows.
בצע את הפקודות כדי להוריד את התמונה. לאחר הורדת התמונה, אתה יכול לראות את הקובץ בשולחן העבודה Docker, ומתמונת זו, אנו יכולים ליזום את הגורם המכיל. לאחר שתלחץ על הלחצן העגול, עליך להרחיב את הפרמטרים והאפשרויות המקוריים כדי להגדיר את שם הגורם המכיל ולשייך תיקיה במחשב המקומי שלך לתיקיה בתוך Docker.
לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי לאתחל את הגורם המכיל. לאחר מכן תוכל לגשת למסוף, שנמצא במערכת לינוקס בתוך Docker. הקלד את פקודות bash ולאחר מכן באפשרותך לבצע את כל הפקודות של פרוטוקול זה.
ראשית, אנחנו צריכים לבצע את המקור כדי להפוך את כל הכלים של פרוטוקול זה זמין. עליך לגשת לקבצי ה- Script של הספריות. כדי לבצע ניתוח תמלול, עליך להוריד תחילה את גנום הייחוס.
כדי לבצע את הפקודות הבאות. לאחר הורדת הגנום, עליך להוריד את הביאורים של הגנים. כדי לעשות זאת, עליך להקליד את הפקודות הבאות.
לאחר מכן, עליך להגדיר את fastq-dump. פעולה זו מאפשרת לך להוריד את קבצי הרצף של הדוגמאות. לאחר הקלדת הפקודות הבאות, עליך להשתמש בלחצן Tab כדי לעבור לאפשרות כלים ולסמן את ספריית הנוכחים של האפשרויות.
השתמש בלחצני Tab כדי לשמור ולאחר מכן אישור. ואז לצאת מהכלי מהיר-dump. עכשיו אנחנו יכולים ליזום את ההורדות של הקריאות על ידי הקלדת הפקודות הבאות.
בקרת האיכות מורכבת ומעריכה באופן גרפי את ההסתברות לשגיאות בקריאה של הריצוף. בשלב זה, עליך גם להסיר את הרצפים הטכניים כגון מתאמים. כדי ליצור את תרשימי בקרת האיכות, עליך להפעיל את תוכנית FastQC.
כדי להסיר את רצפי המתאם ואת הרצפים באיכות נמוכה, עליך להקליד את הפקודות הבאות. עם הקריאות באיכות טובה, אנחנו צריכים עכשיו למפות את הקריאות לגנום הייחוס. לאחר המיפוי, נצטרך להוסיף ביאורים לגנים על פי הגנים האנושיים ואז לספור את מספר הקריאות התואמות לכל גן אנושי.
השלב הראשון הוא ליצור אינדקס של גנום הייחוס על-ידי הקלדת הפקודה הבאה. ואז אנחנו מקלידים את הפקודות האלה כדי למפות את הקריאות לגנום האנושי. לאחר מכן, עליך להפעיל את קבצי ה- Script המביאים את הקריאות.
לאחר מיפוי וביאור, באפשרותך לבצע את ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי המורכב מלמצוא את הגנים שהביטוי שלהם גבוה או נמוך יותר בקבוצה אחת בהשוואה לאחרת. כדי לזהות את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי, או DEGs, עליך להפעיל את הפקודות הבאות. לאחר מכן, באפשרותך להעביר את תוצאות הנתונים מה- Docker למחשב המקומי שלך.
לקבלת זאת, עבור אל המסוף והקלד את הפקודות הבאות כדי לשמור את כל התוצאות בתיקיה מקומית. כדי לבצע את הניתוח הנותר, עליך גם להעתיק את כל הקבצים של נתוני הספריה לספריה במחשב המקומי שלך. במחשב המקומי שלך, תוכל לראות את הספריות שבהן שמרת את הנתונים מ- Docker.
כפי שאתה יכול לראות, אתה יכול לגשת לכל הספריות. באפשרותך גם לפתוח את קובץ ה- HTML המכיל את דוחות בקרת האיכות. באפשרותך גם לגשת לספריה המכילה את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי.
ובתוך הספריה הזו, תמצאו את חלקות הר הגעש שבהן תוכלו לראות את הגנים שנמצאים למעלה או מוזנחים בקבוצה אחת לעומת אחרת, במקרה זה, חולים נגועים בנגיף צ'יקונגוניה לעומת בקרות בריאות. כל השלבים הנותרים של פרוטוקול זה יבוצעו בכלי אינטרנט באמצעות הדפדפן שלך. בואו נתחיל קודם עם CEMiTool.
עבור אל הדפדפן והקלד את הכתובת הבאה. CEMiTool מזהה מודולי ביטוי משותף מתוך ערכות נתונים של ביטוי המסופקים על-ידי המשתמשים. בדף הראשי, באפשרותך לעבור לתפריט וללחוץ על הלחצן הפעל.
פעולה זו תפתח דף חדש שבו תוכל להעלות את קובץ הביטוי. קובץ זה נמצא בנתוני הספריות של המחשב המקומי שלך. אתה תראה שיש שלושה קבצי ביטוי, וזה שאנחנו הולכים להשתמש עבור CEMiTool הוא נורמליזציה שיחה tmm.
אז אתה צריך לבחור את קובץ פנודטה, אותו הדבר עבור הקובץ המכיל את אינטראקציות חלבון-חלבון, ולבסוף, להעלות את הקובץ המכיל את ערכות הגנים או מסלולים. קובץ ערכות הגנים מאפשר ל- CEMiTool לבצע ניתוח העשרה עבור כל אחד ממודול הביטוי המשותף. לאחר מכן, עליך להרחיב את מקטע הפרמטרים וללחוץ תחת החל VST.
לאחר מכן, אתה יכול פשוט ללחוץ על הפעל CEMiTool. לאחר הפעלת CEMiTool, תראה שזוהו 12 מודולי ביטוי משותף. על ידי לחיצה כאן, אתה יכול להוריד את כל התוצאות של ניתוחים אלה.
כלי נוסף שאנחנו הולכים להשתמש בפרוטוקול זה הוא MDP, או דרגה מולקולרית של Perturbation. פשוט הקלד את הדפדפן שלך mdp.sysbio.tools. MDP מחשב את המרחק המולקולרי של כל מדגם בהשוואה לקבוצת התייחסות של דגימות, במקרה זה, את הפקדים הבריאים, על מנת למצוא לא רק חריגים פוטנציאליים אלא גם עד כמה מוטרדים כל דגימות בהשוואה לקבוצה זו.
בדף 'הפעלה', באפשרותך פשוט להעלות את קובץ הביטוי על-ידי לחיצה על הלחצן ובחירת הקובץ. אז אתה צריך להעלות את קובץ פנודטה. לאחר מכן עליך להגדיר איזו עמודה מכילה את המידע אודות הקבוצה או המחלקה ולאחר מכן איזו מחלקה או קבוצה תואמות לקבוצת הביקורת.
אחרי זה, אתה יכול פשוט להפעיל MDP. גרף העמודות מציג עבור כל אחת מהדגימות כסרגל את הציון של דרגה מולקולרית של שיבוש, והצבעים מייצגים את הקבוצות השונות. והתוויה של התיבה היא דרך נוספת לדמיין את אותן תוצאות שבהן רואים בכל נקודות את הדגימות השונות בנפרד משתי קבוצות.
כדי לבצע את הניתוח הפונקציונלי, אנחנו הולכים להשתמש בכלי מעשיר. בשביל זה, אתה צריך לבחור את רשימת הגנים שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, למעלה או downregulated, ולהשתמש בו כרשימת גנים קלט בכלי מעשיר. תראה שקיימות כרטיסיות שונות.
ניתן גם להוריד את כל התוצאות למחשב המקומי שלך. סביבת המחשב לניתוח תמלול הוצבה על פלטפורמת Docker. גישה זו מאפשרת למשתמשים ללא ניסיון קודם עם מערכת לינוקס להשתמש במסוף.
בגורם מכיל זה, קיים מבנה תיקיות מוגדר מראש עבור ערכת נתונים וקבצי Script הנחוצים לכל הניתוח. בצנרת, משתמשים ישתמשו בנתוני תמלול הדם מ -20 אנשים בריאים ו -39 חולים נגועים בחריפות בנגיף Chikungunya. פלטפורמת הרצף מחזירה קבוצה של קבצי FASTQ המכילים את רצף ה- DNA, כלומר.
הקריאות, והאיכות המשויכת לכל בסיס נוקלאוטיד. סולם האיכות Phred מציין את ההסתברות לקריאה שגויה עבור כל בסיס. כלים מזהים ומסירים קריאות באיכות נמוכה מדגימות ומגדילים את ההסתברות למיפוי קריאות.
בשלב זה, מודול המיפוי, קריאות באיכות גבוהה התאושש משמשים תשומות כדי ליישר אותם נגד הגנום התייחסות אנושי. CEMiTool מזהה ומנתח מודולי ביטוי משותף. גנים בתוך אותו מודול באים לידי ביטוי משותף, מה שאומר שהם מציגים דפוסי ביטוי דומים על פני הדגימות של ערכות הנתונים.
ניתוח הרשת מספק מידע על הגנים המחוברים ביותר, כלומר הרכזות. שמות הגנים האלה מוצגים ברשת.
גודל הצמתים הוא פרופורציונלי במידת הקישוריות שלו. התוצאות שהתקבלו מניתוח DEG סוכמו בחלקות הר הגעש. ניתוח מידת ההסתעפות המולקולרית מאפשר זיהוי של דגימות מוטרדות מאנשים בריאים ונגועים.
MDP מציע אילו דגימות הן חריגות ביולוגיות פוטנציאליות. הסרת דגימות אלה תשפיע על התוצאות במורד הזרם. ניתוח העשרה פונקציונלי באמצעות AURA יכול להתבצע באמצעות הכלי Enrichr.
שלבים אלה מסייעים לפרש את התוצאות על ידי חשיפת תפקידים פונקציונליים נפוצים של מספר גנים שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. התהליך הביולוגי המוצג בתרשימי העמודות הם עשרת ערכות הגנים המועשרות המובילות בהתבסס על דירוג ערך ה- p שלהם. לסיכום, פרוטוקולים אלה מכסים את כל השלבים של ניתוח RNA-Seq.
הצינור פותח ועטוף במערכת הלא מסחרית בשם Docker. על תמונה וזמין עבור הקהילה המדעית. בשל מערכת הגורם המכיל, כל קבצי ה- Script והכלים נמצאים תחת אותה גירסה ספציפית כדי להבטיח שכפול.
יתר על כן, חלקים מניתוח הביו-אינפורמטיקה בוצעו באמצעות כלי אינטרנט ידידותיים למשתמש בחינם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף לאנליזה של טרנסקריפטום בספיקות גבוהות (high-throughput) לבדיקת אינטראקציות בין מארח לפתוגן, תוך שימוש ספציפי בנתוני ריצוף RNA (RNA-seq). תהליך העבודה (pipeline) מדריך חוקרים החל מקריאות ריצוף גולמיות, דרך בקרת איכות, מיפוי, אנליזה סטטיסטית ופרשנות פונקציונלית, תוך שימוש בכלים של שורת פקודה ובכלים ידידותיים למשתמש מבוססי רשת, המגולמים בתוך מיכל Docker להבטחת הניתנות לשחזור והנגשה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- טרנסקריפטומיקה
- ביואינפורמטיקה
- אינטראקציות מאח-פתוגן
- מחקר מחלות זיהומיות
רקע
- פתוגנים מעוררים תגובות מאכסן מגוונות המשפיעות על חומרת המחלה.
- טכנולוגיית RNA-seq מאפשרת מדידה של שינויים טרנסקריפטומיים דינמיים במהלך זיהום.
- ניתוח של שינויים אלו יכול לחשוף מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.
- תהליכי עיבוד נתונים (pipelines) סטנדרטיים וניתנים לשחזור חיוניים לניתוח חסון של נתוני RNA-seq.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול שלב-אחרי-שלב לניתוח נתוני RNA-seq ממחקרי מאכסן-פתוגן.
- להבטיח שחזוריות ונגישות באמצעות סביבות מבוססות Docker.
- להדגים את מסלול העבודה (pipeline) באמצעות דגימות דם מאנשים בריאים וממטופלים שנדבקו בנגיף ה-Chikungunya.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בקרת איכות של קריאות רצף (הסרה של קריאות באיכות נמוכה ואדפטורים באמצעות FastQC וכלים נלווים).
- מיפוי קריאות לגנום הייחוס האנושי ואנוטציית גנים.
- ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וביטוי משותף (זיהוי DEGs ומודולים של ביטוי משותף באמצעות CEMiTool).
- ניתוח דרגת הפרעה מולקולרית (MDP) לזיהוי דגימות חריגות ומופרעות.
- ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי באמצעות Enrichr.
- כלילה של כל הכלים והסקריפטים בתוך Docker container להבטחת שחזוריות.
תוצאות עיקריות
- עיבוד מוצלח של נתוני RNA-seq מ-20 ביקורות בריאות ו-39 מטופלים נגועים ב-Chikungunya.
- זיהוי גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי ומודולי ביטוי משותף הקשורים לזיהום.
- גילוי דגימות חריגות ודגימות עם הפרעה גבוהה באמצעות אנליזת MDP.
- העשרה פונקציונלית חשפה מסלולים ביולוגיים מרכזיים הקשורים לפנוטיפ המחלה.
- תהליך העבודה (Pipeline) הדגים קלות שימוש עבור חוקרים בעלי ניסיון מוגבל ב-Linux באמצעות Docker וכלים מבוססי רשת.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק זרימת עבודה חסונה וניתנת לשחזור עבור אנליזת RNA-seq במחקרי מאחס-פתוגן.
- כלילה ב-Docker מבטיחה גרסאות כלים עקביות ונגישות.
- גישה זו מקלה על גילוי מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס מחלות זיהומיות ותומכת במחקר ניסויי עתידי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
ניתוח טרנסקריפטום ברזולוציה גבוהה (High-throughput) מאפשר לצוותים בביופארמה לחקור באופן שיטתי אינטראקציות בין מארח לפתוגן, ובכך לתמוך בזיהוי מוקדם של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות פוטנציאליות. תהליך עבודה זה מספק תובנות כמותיות וניתנות לשחזור לגבי דינמיקת ביטוי גנים, המשמשות באופן ישיר לתיקוף מטרות ולהחלטות תיק השקעות מותאמות סיכון. שילוב של תהליכי עבודה חסונים של RNA-seq בשלב הגילוי מגביר את הביטחון החזוי ואת הרצף התרגומי בתוכניות למחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מקיפה של נתיבי התגובה של המארח במהלך זיהום.
- תומך בזיהוי ותיעוד של מטרות פוטנציאליות על בסיס ביטוי גנים דיפרנציאלי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת מודולים של ביטוי משותף וקישוריות בין נתיבים.
- מספק נתונים כמותיים לתיקוף ומיון של מטרות המונחים בהשערות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק חתימות טרנסקריפטומיות מתוקשפות לצורך פיתוח בדיקות המשך.
- מנstandardיז את איכות הנתונים ואת השחזוריות באמצעות זרימות עבודה במכולות (containerized workflows).
- מפיק פלטים כמותיים המתאימים לסריקה ולניתוחים השוואתיים.
- מאפשר אינטגרציה ניתנת להרחבה, שאינה תלויה בפלטפורמה, לתוך צינורות סריקה רחבים יותר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים טרנסקריפטומיים למסלולים ולסמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור ביטוי גנים לתוצאות תפקודיות.
- מסייעת בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על בסיס פרופילים של הפרעות מולקולריות.
- משפרת את הערך הניבויי עבור מחקר תרגומי במודלים של מחלות זיהומיות.
שילוב בנתיב העבודה ובזרימת התהליך
תהליך עבודה זה ל-RNA-seq המקיף שלבים מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, משלב בקרת איכות, מיפוי, ניתוח סטטיסטי ופרשנות תפקודית בתוך סביבת Docker הניתנת לשחזור.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): מאפשרת בדיקה חסונה של היפותזות והבהרה של מסלולים באמצעות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי וביטוי משותף (co-expression).
- סריקה (Screening): מספקת נתונים טרנסקריפטומיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה (Analytics): מספקת תוצאות כמותיות, תרשימי הרי Volcano וציוני הפרעה מולקולרית לצורך אנליטיקה השוואתית.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשרת בין שינויים בביטוי גנים למסלולים הרלוונטיים למחלה, ותומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): מציעה זרימת עבודה במיכלים (containerized) עם בקרת גרסאות ליישום עקבי בין פרויקטים וצוותים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבחירת המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות, סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות פריסה מבוססת Docker.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי ביסוס ההתקדמות בנתונים טרנסקריפטומיים כמותיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובמעבר ידע בין תוכניות שונות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסקריפטומיקה, בביואינפורמטיקה ובניתוח סטטיסטי.
- נדרש גישה לפלטפורמות ריצוף, לתשתית חישוב ולמערכות התואמות ל-Docker.
- מחייב סטנדרטיזציה רב-צוותית של פורמטי נתונים ופרמטרי ניתוח.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מאכסן-פתוגן עם גנומי ייחוס וקבצי אנוטציה מתאימים.
- תלוי באיכות דגימות הקלט ובנתוני הריצוף לצורך השגת תוצאות אופטימליות בשלבי הניתוח הבאים.
