Name: פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: למדו פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי ליתושי Aedes aegypti. השיטה החסכונית מייצרת DNA באיכות גבוהה לרצף גנום מלא ללא ציוד יקר, ומאפשרת מחקר גנומי במעבדות עם משאבים מוגבלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בתמיכה במימון מרכז המצוינות האזורי דרום מערב האוקיינוס השקט למחלות המועברות בווקטורים הממומן על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב (הסכם שיתוף פעולה 1U01CK000516), מענק ה- CDC NU50CK0000420-04-04, המכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות של USDA (פרויקט הצוהר 1025565), מלגת המעבדה לאנטומולוגיה רפואית UF / IFAS פלורידה לטס-יו צ'ן, NSF CAMTech IUCRC שלב II מענק (AWD05009_MOD0030) ופלורידה מחלקת הבריאות (חוזה CODQJ). הממצאים והמסקנות במאמר זה הם אלה של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את השקפותיו של שירות הדגים וחיות הבר של ארה"ב.

1. אחסון דגימות כללי ותכשירים לפני הפקת DNA
<ol><li>לחות את המדגם במים 100 μL PCR בכיתה עבור 1 שעות (או לילה) ב 4 °C (7 °F) אם המדגם כבר מאוחסן >70% אלכוהול כדי לרכך את הרקמה.</li>
</ol>2. הפרעה לדוגמה
<ol><li>הגדר אינקובטור או בלוק חום רועד ב 56 °C (56 °F).</li>
	<li>הפוך פרוטאינאז K (PK) חוצץ / תערובת אנזימים. 2 μL של פרוטאינאז K (100 מ"ג/מ"ל) ו-98 μL של חיץ Proteinase K (סה"כ 100 μL) נדרשים עבור כל מיצוי יתושים. כדי להכין תערובת אב עבור דגימות מרובות, להגדיל את הכמות הכוללת (בשילוב עבור כל הדגימות הבודדות) על ידי ~ 15% כדי להבטיח את הזמינות של נפח נאות.</li>
	<li>אם הדגימות היו hydrated לפני החילוץ, להשליך מים מכל צינור מדגם.</li>
	<li>בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל רקמת יתוש, הוסף 100 μL של חיץ PK / תערובת אנזימים.</li>
	<li>הומוגניזציה הרקמה באמצעות עלה צינור microcentrifuge.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות במשך 1 דקות ב 9,600 x g בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדגור על המדגם עבור 2-3 שעות ב 56 °C (56 °F).</li>
	<li>במהלך הדגירה, להכין את ריאגנטים אחרים באמצעות שלב מיצוי ה- DNA (שלב 3).</li>
</ol>3. מיצוי דנ"א
<ol><li>הפוך תערובת מאסטר חרוז מגנטי. עבור כל מדגם, לערבב 100 μL של מאגר תמה, 100 μL של Isopropanol, ו 15 μL של חרוזים מגנטיים (סה"כ 215 μL). כדי להכין תערובת אב לתגובות מרובות, הגדל את הכמות הכוללת (בשילוב עבור כל הדגימות הבודדות) בכ- 20% כדי להבטיח זמינות של נפח הולם.</li>
	<li>לאחר זמן הדגירה (שלב 2.7), מעבירים כל ליסייט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי או לבאר מיקרו-לוח באמצעות פיפטה.</li>
	<li>הוסף 100 μL ליסאט ו 215 μL של תערובת מאסטר חרוז מגנטי לכל מדגם.</li>
	<li>השתמש פיפטה לערבב אותו היטב במשך 10-20 s ולאחר מכן לתת לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לנער בעדינות את הצינור מדי פעם כדי למקסם את הכריכה של חרוזים מגנטיים ו- DNA.</li>
	<li>מניחים את הצינור / הצלחת על מפריד החרוזים המגנטי ולהמתין עד הפתרון ברור.</li>
	<li>יש להשליך את הנוזל מהצינור/צלחת באמצעות פיפטה. בעת הסרת supernatant, נסה לא לגעת או להפריע החרוזים המגנטיים מחזיק את ה- DNA.</li>
	<li>הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוזים מגנטי ולהוסיף 325 μL של חוצץ כביסה 1 לכל באר.</li>
	<li>מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5-3.6.</li>
	<li>הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוז מגנטי ולהוסיף 250 μL של חוצץ כביסה 1 לכל באר.</li>
	<li>מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5-3.6.</li>
	<li>הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוז מגנטי ולהוסיף 250 μL של חוצץ כביסה 2 לכל מדגם.</li>
	<li>מערבבים היטב ודגרה במשך דקה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5-3.6.</li>
	<li>הזז את הצינור / צלחת מן מפריד חרוז מגנטי ולהוסיף 250 μL של חוצץ כביסה 2 לכל באר.</li>
	<li>מערבבים היטב ודגרה במשך דקה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5-3.6.</li>
	<li>הזז את הצינור / צלחת מן מפריד החרוזים המגנטי ולהוסיף 100 μL של חוצץ elution לכל באר.</li>
	<li>מערבבים היטב ודגרה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מעבירים את הצינור/הצלחת על מפריד החרוזים המגנטי וממתינים עד שהפתרון יתבהר.</li>
	<li>Pipette supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי חדש 0.5 או microplate היטב.</li>
	<li>יש לאחסן דגימות דנ"א ב-4 °C (עד שבוע אחד) או -80 °C (50 °F).  אם נעשה שימוש במיקרו-לוח, כסו אותו בפרפילם.</li>
	<li>קבע את תפוקת הדנ"א בכל שיטה מתאימה. הערה: במחקר זה, קריאה וספיגה של פלואורומטר DNA ב 260/280 ננומטר נוצלו.</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם למינים אחרים של חרקים. הגרסה המקורית של הפרוטוקול שהוצגה בניימן ואח'1 נבדקה על מינים מרובים, כולל Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, ו Keiferia lycopersicella2,<sup...

פיתוח לאחרונה של פרוטוקול מיצוי DNA משופר1 אפשר מחקרים רבים בעלי השפעה גבוהה במורד הזרם מעורבים רצף גנום שלם2,3,4,5,6. פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי זה מספק תפוקת DNA אמינה מדגימות יתושים בודדות, אשר בתורו מפחית את העלות ואת הזמן הקשורים לרכישת מספר מספיק של דגימות מאוספי שדה.
ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של אוכלוסיה ונוף מתואמת ישירות עם הפחתת עלויות של ריצוף גנום שלם. למרות פרוטוקול חילוץ ה- DNA הקודם1 מגביר את היעילות הקשורה לרצף תפוקה גבוהה, מעבדות / מחקרים קטנים יותר ללא הכספים עשויים לבטל את השימוש בכלי הנוף החדשים והחזקים האלה וגנומיקה באוכלוסייה בשל עלויות יישום הפרוטוקול (למשל, עלויות של מכשירים מיוחדים).
כאן, פרוטוקול מיצוי DNA שונה מוצג המשתמש בצעד מיצוי חרוז מגנטי דומה כמו נימן ואח'1 כדי להשיג DNA טוהר גבוה אבל לא מסתמך על מכשירים בעלות גבוהה עבור תמיסת רקמות ומיצוי DNA. פרוטוקול זה מתאים לניסויים הדורשים >10 ננוגרם של DNA באיכות גבוהה.

<table><tbody><tr><td>מאגר AE</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>מאגר אלוטיון מאגר</td></tr><tr><td>AL</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>AW1 מאגר</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>מאגר כביסה 1</td></tr><tr><td>AW2 מאגר</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>מאגר כביסה 2</td></tr><tr><td>מתלה MagAttract G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>חרוז מגנטי</td></tr><tr><td>מפריד חרוזים מגנטי</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td></tr><tr><td>PK Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>Proteinase K buffer</td></tr><tr><td>Proteinase K ThermoFisher</td><td></td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>פלואורומטר</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול מיצוי dna יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

פרוטוקול מיצוי DNA שפורסם לאחרונה באמצעות חרוזים מגנטיים ומכשיר מיצוי DNA אוטומטי הציע כי ניתן לחלץ DNA באיכות גבוהה וכמות מיתוש בודד שמור היטב מספיק עבור ריצוף גנום שלם במורד הזרם. עם זאת, הסתמכות על מכשיר מיצוי DNA אוטומטי יקר יכולה להיות אסורה עבור מעבדות רבות. כאן, המחקר מספק פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי ידידותי לתקציב, אשר מתאים לתפוקה נמוכה עד בינונית. הפרוטוקול המתואר כאן נבדק בהצלחה באמצעות דגימות יתושים Aedes aegypti בודדים. העלויות המופחתות הקשורות להפקת דנ"א באיכות גבוהה יגדילו את היישום של רצף תפוקה גבוהה למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים.

תפוקת הדנ"א הממוצעת לכל רקמת ראש/בית החזה של יתוש הייתה 4.121 ננוגרם/μL (N = 92, סטיית תקן 3.513) שנמדדה באמצעות פלואורומטר כאשר נעשה בה שימוש ב-100 מיקרו-אל של חיץ אילוטיון. זה מספיק עבור דרישות קלט DNA גנומי 10-30 ננומי הדרושות לבניית ספריית גנום שלמה1,7. כמות ה- DNA יכולה להשתנות בין 0.3-29.7 ng/μL בהתאם לגודל גוף היתוש ותנאי השימור. חלק מההנוויות הגבוהות נובעות מהמאפיין של חרוזים מגנטיים המשמשים במחקר. מותגים שונים של חרוזים מגנטיים עשויים לייצר ריכוזים עקביי...

מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוזים מגנטיים זה, המבוסס על תקציב, הופך רצף תפוקה גבוה לנגיש למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים. פרוטוקול זה אינו דורש ציוד יקר להפקת DNA באיכות גבוהה והוא יכול להיות מועיל במצבי אבחון או מחקר מסוימים שבהם השגת כמות מספקת של DNA עם איכות עבור ריצוף תפוקה גבוהה היא מאתגרת. קל לשכפל פרוטוקול זה באמצעות הדגמה חד-פעמית.יש לנסות עם מספר קטן של דוגמאות תחילה כדי להכיר את זרימת העבודה. בתור התחלה, לחות דגימות רקמת היתוש המאוחסנות ביותר מ 70% אלכוהול על ידי הוספת 100 microliters של מים כיתה PCR ודגרה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לרכך את הרקמה. לאחר הדגירה, להשליך את המים ולהוסיף 100 microliters של תערובת אנזימי חיץ Proteinase K.ואז להשתמש עלה צינור microcentrifuge כדי הומוגניזציה הרקמה. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה הרקמה ליסייט ודגרה במשך שעתיים עד שלוש שעות ב 56 מעלות צלזיוס. כדי לחלץ דנ"א, פיפטה 100 מיקרוליטרים של הרקמה מתמוססים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי חדש.לאחר מכן להוסיף 215 microliters של תערובת מאסטר חרוז מגנטי. באמצעות פיפטה, מערבבים את תערובת החרוזים המגנטיים במשך 10 עד 20 שניות, ואז נותנים לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לנער בעדינות את הצינור מדי פעם כדי למקסם את הכריכה של ה- DNA חרוזים מגנטיים.לאחר מכן, מניחים את הצינור על מפריד החרוזים המגנטי עד שהתמיסה מתבהר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, שאפו בעדינות את הנוזל מהצינור מבלי להפריע החרוזים המגנטיים המחזיקים בדנ"א. הזז את הצינור ממפריד החרוזים המגנטי ושטוף את החרוזים על ידי הוספת 325 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה אחד.מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, מניחים את הצינור על מפריד החרוזים המגנטי ומסירים את supernatant כפי שהוכח בעבר, ולאחר מכן להזיז את הצינור מן מפריד החרוזים המגנטי לשטוף את החרוזים פעם אחת עם חוצץ כביסה אחד. לאחר השטיפה השנייה עם חוצץ אחד, לשטוף את החרוזים פעמיים עם 250 microliters של חוצץ כביסה שני באותו אופן.לאחר הכביסה האחרונה, להזיז את הצינור מן מפריד החרוזים המגנטי ולהוסיף 100 microliters של חוצץ elution. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת ולאחר מכן לדגור על הצינור במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לפני הנחת אותו בחזרה על המפריד המגנטי. כאשר הפתרון מתבהר, להעביר את supernatant לתוך חדש, נקי 0.5 מיליליטר microcentrifuge צינור ולאחסן כראוי.מוצג כאן כקריאת פלואורומטר מיקרו-וולטום טיפוסית של הדנ"א של היתוש במאגר אלוטיון המכיל 0.5 מילימול EDTA. יחס הספיגה הממוצע של 260 עד 280 ננומטר הוא 2.3. טבלה זו מציגה את העלויות ואת מספר הדגימות המעובדות ביום עבודה אחד עבור שיטות מיצוי שונות.העלות ריאגנט טיפוסי מתכלה עבור מיצוי על ידי פרוטוקול זה הוא סביב 9.50 לכל מדגם. עלות זו שקולה לכל שיטת מיצוי אופיינית המבוססת על חרוז מגנטי. היתרון העיקרי של העלות של פרוטוקול זה נובע מאי-צורך במכשיר מיצוי DNA אוטומטי.הקפד לשנות טיפים pipette בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב של DNA בעת עבודה עם דגימות מרובות. אנו משתמשים בדנ"א באיכות גבוהה המופק בשיטה זו לרצף גנום שלם. אנו משתמשים כעת בנתוני הרצף כדי לזהות מוטציות חדשניות בעמידות לחומרי הדברה או בגנים חיסוניים של דאגה בבריאות הציבור ובקרת מחלות.פתרונות במחירים סבירים לרצף תפוקה גבוה פותח דלתות מרגשות לגנומיקה של האוכלוסייה וגנומיקה נוף שמטרתן להבין את פיזור היתושים ואת זרימת הגנים המשפיעה על הצלחתן של אסטרטגיות בקרה גנטיות חדשניות רבות.

a-magnetic-bead-based-mosquito-dna-extraction-protocol-for-next

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי...

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.

PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית

מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

פרוטוקול זה מראה שהכאת חרוזים בשילוב עם טיהור חרוזי לכידת DNA מספקת שיטה מהירה ועקבית לחילוץ DNA מדגימות Mycobacterium tuberculosis , מה שהופך אותה לבחירה יעילה עבור יישומי ריצוף של הדור הבא.

מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

אנו מציגים שיטה אופטימלית למיצוי DNA מליחה מזוהמת באמצעות שיטת מיצוי מבוססת מטריצה בשילוב עם טיהור חרוזים מגנטיים לריצוף ממוקד במורד הזרם של Mycobacterium tuberculosis.

מיצוי DNA מבוסס מטריצה לריצוף ממוקד של הדור הבא על דגימות ליחה מטוהרות

למדו פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוז מגנטי ליתושי Aedes aegypti. השיטה החסכונית מייצרת DNA באיכות גבוהה לרצף גנום מלא ללא ציוד יקר, ומאפשרת מחקר גנומי במעבדות עם משאבים מוגבלים.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

גלה סרטונים נוספים