פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

פרוטוקול מיצוי DNA מבוסס חרוזים מגנטיים זה, המבוסס על תקציב, הופך רצף תפוקה גבוה לנגיש למעבדות ומחקרים מוגבלים במשאבים. פרוטוקול זה אינו דורש ציוד יקר להפקת DNA באיכות גבוהה והוא יכול להיות מועיל במצבי אבחון או מחקר מסוימים שבהם השגת כמות מספקת של DNA עם איכות עבור ריצוף תפוקה גבוהה היא מאתגרת. קל לשכפל פרוטוקול זה באמצעות הדגמה חד-פעמית.

יש לנסות עם מספר קטן של דוגמאות תחילה כדי להכיר את זרימת העבודה. בתור התחלה, לחות דגימות רקמת היתוש המאוחסנות ביותר מ 70% אלכוהול על ידי הוספת 100 microliters של מים כיתה PCR ודגרה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לרכך את הרקמה. לאחר הדגירה, להשליך את המים ולהוסיף 100 microliters של תערובת אנזימי חיץ Proteinase K.

ואז להשתמש עלה צינור microcentrifuge כדי הומוגניזציה הרקמה. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה הרקמה ליסייט ודגרה במשך שעתיים עד שלוש שעות ב 56 מעלות צלזיוס. כדי לחלץ דנ"א, פיפטה 100 מיקרוליטרים של הרקמה מתמוססים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי חדש.

לאחר מכן להוסיף 215 microliters של תערובת מאסטר חרוז מגנטי. באמצעות פיפטה, מערבבים את תערובת החרוזים המגנטיים במשך 10 עד 20 שניות, ואז נותנים לו לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, לנער בעדינות את הצינור מדי פעם כדי למקסם את הכריכה של ה- DNA חרוזים מגנטיים.

לאחר מכן, מניחים את הצינור על מפריד החרוזים המגנטי עד שהתמיסה מתבהר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, שאפו בעדינות את הנוזל מהצינור מבלי להפריע החרוזים המגנטיים המחזיקים בדנ"א. הזז את הצינור ממפריד החרוזים המגנטי ושטוף את החרוזים על ידי הוספת 325 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה אחד.

מערבבים היטב על ידי צנרת ודגרה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, מניחים את הצינור על מפריד החרוזים המגנטי ומסירים את supernatant כפי שהוכח בעבר, ולאחר מכן להזיז את הצינור מן מפריד החרוזים המגנטי לשטוף את החרוזים פעם אחת עם חוצץ כביסה אחד. לאחר השטיפה השנייה עם חוצץ אחד, לשטוף את החרוזים פעמיים עם 250 microliters של חוצץ כביסה שני באותו אופן.

לאחר הכביסה האחרונה, להזיז את הצינור מן מפריד החרוזים המגנטי ולהוסיף 100 microliters של חוצץ elution. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת ולאחר מכן לדגור על הצינור במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר לפני הנחת אותו בחזרה על המפריד המגנטי. כאשר הפתרון מתבהר, להעביר את supernatant לתוך חדש, נקי 0.5 מיליליטר microcentrifuge צינור ולאחסן כראוי.

מוצג כאן כקריאת פלואורומטר מיקרו-וולטום טיפוסית של הדנ"א של היתוש במאגר אלוטיון המכיל 0.5 מילימול EDTA. יחס הספיגה הממוצע של 260 עד 280 ננומטר הוא 2.3. טבלה זו מציגה את העלויות ואת מספר הדגימות המעובדות ביום עבודה אחד עבור שיטות מיצוי שונות.

העלות ריאגנט טיפוסי מתכלה עבור מיצוי על ידי פרוטוקול זה הוא סביב 9.50 לכל מדגם. עלות זו שקולה לכל שיטת מיצוי אופיינית המבוססת על חרוז מגנטי. היתרון העיקרי של העלות של פרוטוקול זה נובע מאי-צורך במכשיר מיצוי DNA אוטומטי.

הקפד לשנות טיפים pipette בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב של DNA בעת עבודה עם דגימות מרובות. אנו משתמשים בדנ"א באיכות גבוהה המופק בשיטה זו לרצף גנום שלם. אנו משתמשים כעת בנתוני הרצף כדי לזהות מוטציות חדשניות בעמידות לחומרי הדברה או בגנים חיסוניים של דאגה בבריאות הציבור ובקרת מחלות.

פתרונות במחירים סבירים לרצף תפוקה גבוה פותח דלתות מרגשות לגנומיקה של האוכלוסייה וגנומיקה נוף שמטרתן להבין את פיזור היתושים ואת זרימת הגנים המשפיעה על הצלחתן של אסטרטגיות בקרה גנטיות חדשניות רבות.