ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

הפרוטוקול המתואר בסרטון זה יגדיר את ההליכים הניסיוניים הנדרשים להדמיה בגודל טבעי של תאים מתפשטים ושימוש בכלי חישובי לכמת תאים המפיצים דינמיקה באופן לא משוחד ואוטומטי. הנכס המתפשט של התא מאפשר מעקב רציף אחר תנועת קצה התא ושינויים מורפולוגיים במהלך הפצת תאים, שהיא תכונה שחסרה ברוב מבחני התפשטות התאים הקיימים. כמו כן, פרוטוקול זה מיישם את השימוש בעיבוד וניתוח אוטומטיים של המחשב, ומספק מידע על מעגליות התא, מחזורי נסיגת האזור והבליטה של תאים מתפשטים.

עיבוד אוטומטי כזה מפחית את ההטיה בניתוח נתונים ומספק שיטה איתנה לניתוח דינמיקה של הפצת תאים עבור מספר רב של תאים. בשילוב עם טיפולים תרופתיים או מדעי הגנים וטכניקות, פרוטוקול זה נוח למהירויות בקנה מידה גדול של שחקנים מולקולריים המסדירים בליטות תאים. עבור הפרוטוקול הנתון, התאים המשמשים הם פיברובלסטים עובריים של העכבר המקודדים גנטית PH-Akt-GFP, המאפשר תיוג פלואורסצנטי של קרום הפלזמה.

לפני תחילת התא מתפשט assay, תרבות צלחת של תאים ל 90%confluency. לאחר שהתאים השיגו את המפגש הנכון, להבה 22 על 22 מילימטר לכסות להחליק ומניחים אותו לתוך צלחת תרבית תא 35 מילימטר. מעיל את כיסוי להחליק עם פיברונקטין כי כבר מדולל PBS לריכוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר.

מניחים את המנה עם כיסוי להחליק לתוך אינקובטור 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר שעה אחת לשאוף את fibronectin הקפד לא לגעת להחליק את הכיסוי עם קצה פיפטה. לשטוף את המנה עם PBS על ידי צינור בעדינות סביב החלקת הכיסוי פעמיים עד שלוש פעמים.

עבור זריעת תאים, להתחיל על ידי שאיפת התקשורת תרבות התא מצלחת התאים. לאחר מכן, לשטוף את המנה עם PBS חם. מוסיפים 650 מיקרוליטרים של טריפסין EDTA למנה ומטה את המנה כדי להפיץ את האנזים באופן שווה.

מניחים את המנה עם טריפסין לתוך האינקובטור במשך דקה אחת. לאחר הדגירה תצטרך תחילה להוסיף 10 מיליליטר של מדיה תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, במהירות להוסיף עוד 10 מיליליטר של מדיה לתוך המנה על מנת להרוות את טריפסין.

כדי לדלל את התאים שייזרעו על החלקת הכיסוי, פיפטה מיליליטר אחד של תכולת המנה לתוך צינור הצנטריפוגה. מהצינור, פיפטה כ 500 כדי 1, 000 microliters של תאים מדוללים לתוך המנה עם להחליק את הכיסוי. ודא כי תלוש הכיסוי הוא ב 10%confluency או 50, 000 תאים למיליליטר ולהתאים את נפח התאים המדוללים לפי הצורך.

מטרת תאים אלה היא ליצור מישור של מיקוד במהלך רכישת תמונה. עם התאים הנותרים בצלחת, מעבר חמישית מהתאים לתוך מנה אחת קטנה לכל טיפול. אלה יהיו התאים שינותחו להפצת דינמיקה.

מניחים את מנות המעבר ואת צלחת להחליק את הכיסוי לתוך אינקובטור במשך שמונה עד 24 שעות. כדי לבדוק את החשיבות של Arp2/3 להתפשטות תאים, ראשית להוסיף חמישה מיליליטר של מדיה תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה טיפול. לאחר מכן להוסיף 20 מיליליטר של dmem כי הוא חסר פנול אדום לתוך כל אחד משני צינורות צנטריפוגה גדולים יותר.

פיפטה או התרופה CK-666 שהוא מעכב של קומפלקס Arp2/3 או טיפול מבוקר כגון DMSO לתוך צינורות קטנים וגדולים. כדי להתחיל טיפול תרופתי של התאים, להסיר את מנות המעבר כי היו דגירה לילה. לשאוף את התקשורת תרבות התא מכל הכלים ולשטוף את הכלים עם PBS חם.

קח את הצינורות הקטנים המכילים גם CK-666 או לשלוט במדיה בתוספת ולהוסיף את התוכן של הצינור הרלוונטי לתוך כל אחד מנות המעבר. מתייגים כל אחת מהמנות עם הטיפול התרופתי הנכון ולאחר מכן מניחים את הכלים בחזרה לאינקובטור למשך שעה נוספת לאחר דגירה של שעה, שואפים את המדיה בתוספת התרופה מכל אחת מהמנות. לאחר מכן, להוסיף PBS חם לכל הכלים על מנת להסיר ביסודיות את כל המדיה האדומה פנול הנותרים.

מוסיפים 230 מיקרוליטרים של טריפסין EDTA ומניחים את הכלים באינקובטור למשך דקה אחת. הסר את הכלים טריפסיניזציה מן החממה ולהמשיך להוסיף חמישה מיליליטר של התרופה בתוספת dmem כי הוא חסר פנול אדום לתוך צינור המיועד צינור B.Then להוסיף עוד חמישה מיליליטר של אותה מדיה לתוך המנה הרלוונטית כדי להרוות את טריפסין. פיפטה התקשורת למעלה ולמטה מספר פעמים על מנת לנתק את כל התאים מהצלחת.

מעבירים את כל תכולת המנה לצינור אחר שכבר הוגדר כצינור A.In על מנת להכין דילול תאים המתאים להדמיה, מעבירים מיליליטר אחד של תאים מצינור A לצינור B.Repeat את כל שלבי הדילול לכל טיפול. מניחים את כל הצינורות לתוך החממה במשך 45 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש טריפסיניזציה. ודא שכל חלקי התא המגנטי שיכול להכיל תלוש כיסוי של 22 על 22 מילימטר נוקו ביסודיות לפני השימוש.

מוציאים את המנה עם החלקת הכיסוי מהחממה. שאפו את מדיית תרבות התאים ושטפו את פתק הכיסוי עם PBS חם. הסר את תלוש הכיסוי באמצעות זוג מלקחיים והנח בעדינות את החלקת הכיסוי על הלוח התחתון של התא המגנטי.

לאחר מכן להרים את אטם הסיליקון ומניחים אותו על גבי תלוש הכיסוי. חבר את הגוף הראשי של התא המגנטי ללוח התחתון. הוסף מיליליטר אחד של dmem חסר פנול אדום המתאים לטיפול הרלוונטי לתא המגנטי.

קח רקמה ללא מוך בזהירות לטבול את המתחם בין הגוף הראשי ואת הצלחת התחתונה על מנת לבדוק את כל דליפות. כדי להשלים את התא המגנטי, הורידו את הכיסוי השקוף על הגוף הראשי. לבסוף לנגב את החלק התחתון של להחליק את הכיסוי עם רקמה מרוססת במים ועוד ריסוס עם 70% אתנול.

מחממים את החממה העליונה של מיקרוסקופ קונפוקל ל-37 מעלות. מניחים את התא המגנטי על גבי המטרה. לפני רכישת דינמיקה מתפשטת, הגדר את המוקד לתאים המקוטבים ממילא בערוץ הפלואורסצנטי הירוק.

פעולה זו מבטיחה שהתאים המתפשטים יהיו בפוקוס ברגע שהם יתחברו לתעודת הכיסוי. הסר את הכיסוי השקוף של התא המגנטי ופיפט 500 מיקרוליטר מצינור B שהוסר מהחממה. הנח את המכסה השקוף בחזרה למעלה.

כדי לזהות תאים אידיאליים לניתוח הפצת תאים, חפש הילות ירוקות המייצגות תאים שעדיין לא נקשרו לתעודת הכיסוי או נמצאים בשלבים המוקדמים ביותר של הקובץ המצורף. רכוש תמונות ושמור את הקבצים. לאחר השלמת רכישת התמונה של התפשטות תאים, להתחיל על ידי הפעלת IDE פייתון תואם כגון Spyder.

לצורך ניתוח חישובי של דינמיקת הפצת תאים, אתר ופתח את קובץ ה- GUI המתפשט בתא המסופק בחבילות ה- Script הרלוונטיות. לחץ על לחצן ההפעלה שיפתח את לוח ממשק משתמש גרפי ברקע. ממשק משתמש גרפי מכיל את כל ההגדרות הדרושות לניתוח.

כדי לנתח את אזור התא ואת המעגליות, הזן את קובץ הרכישה ואת ההגדרות הדרושות בכרטיסייה אזור התפשטות התא. יהיה צריכה להתבצע התאמות בהתאם לסוג התא ולפרמטרים של רכישת תמונה. לאחר הקשה על run, קובץ ה- Script ייצור מעגליות ושטח של תא לעומת התוויית זמן עבור כל התאים המתפשטים.

לקבלת נתוני קימוגרף, הקש על מחולל הקימוגרף וכרטיסיית הניתוח. ניתוח זה מחייב חיתוך של קבצי קלט בערימות תמונה של תא בודד. לאחר הוספת כל ההגדרות והפעלת הקשה, קובץ ה- Script ייצור קימוגרפים מרובים עבור התא הנתון.

בצד שמאל נמצאים תאים מייצגים מטיפולי DMSO ו- CK-666, המפולחים באופן אוטומטי באמצעות הסקריפט שסופק. בניגוד למורפולוגיה האיזוטרופית והמחוגית ביותר שהודגמה על ידי תאי בקרה, תאים מעוכבים Arp2/3 מפגינים מעגליות מופחתת. בנוסף, הקימוגרפים הנוצרים באופן אוטומטי מספקים רזולוציה זמנית החיונית להבנת הדינמיקה של בליטות.

תאי בקרה בולטים בהתמדה עם נסיגות מועטות עד ללא נסיגות. לעומת זאת, עיכוב Arp2/3 משבש את היציבות של בליטות כפי שצוין על ידי הגידול באירועי נסיגה לאורך התפשטות. קטעי וידאו זה צריך לספק לך את ההבנה של איך כראוי זרע תאים, לבצע טיפולים תרופתיים ולהכין הדמיה וכלים חישוביים הדרושים לכימות של דינמיקה הפצת תאים.

פרוטוקול זה יכול להיות משולב עוד יותר עם הדמיה פלואורסצנטית cytoskeleton ו מבחני הגירה כדי לזהות את השחקנים המולקולריים השולטים בליטות התא. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.